自絮凝酵母發(fā)酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法
【專利摘要】自絮凝酵母發(fā)酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及到一種新型的用于乙醇發(fā)酵的自絮凝酵母菌株以及利用該菌株發(fā)酵木糖渣酶解液生產(chǎn)乙醇的工藝路線。本發(fā)明以木糖生產(chǎn)過程中剩余的木糖渣作為纖維素原料，通過堿預(yù)處理酶解或直接酶解得到富含葡萄糖的酶解液，再利用從自然界中篩選得到的自絮凝酵母發(fā)酵酶解液制備乙醇。該酵母在發(fā)酵過程中可以自絮凝成毫米級(jí)顆粒，起到無載體固定化的效果，而且發(fā)酵后無需離心，通過自沉降即可分離菌體。與傳統(tǒng)的纖維素乙醇生產(chǎn)工藝相比，本工藝能夠有效簡(jiǎn)化生產(chǎn)環(huán)節(jié)，減少生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期，具有極高的應(yīng)用價(jià)值和工業(yè)化潛質(zhì)。
【專利說明】自絮凝酵母發(fā)酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及到一種新型的用于乙醇發(fā)酵的自絮凝酵母菌株以及利用該菌株發(fā)酵木糖渣酶解液生產(chǎn)乙醇的工藝路線。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代社會(huì)和工業(yè)發(fā)展對(duì)能源和資源的需求日益增加，開發(fā)可再生生物能源是維持社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的必要條件。在新興能源領(lǐng)域，燃料乙醇作為唯一可大規(guī)模替代車用運(yùn)輸燃料的生物能源，已成為世界各國(guó)競(jìng)相開展研究的熱點(diǎn)。一代的燃料乙醇生產(chǎn)采用淀粉糖化發(fā)酵工藝。采用該工藝，每生產(chǎn)I噸淀粉，大約要消耗3噸谷物。中國(guó)是人口大國(guó)，以谷物作為原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)勢(shì)必會(huì)造成糧食資源短缺問題。因此，采用富含纖維素的生物質(zhì)資源作為原料生產(chǎn)二代燃料乙醇技術(shù)正在悄然興起。生物質(zhì)資源除了纖維素外，還含有半纖維素和木質(zhì)素等干擾纖維素水解的物質(zhì)，需要將其去除才能被微生物利用。傳統(tǒng)的生物質(zhì)到乙醇的生產(chǎn)包括預(yù)處理，纖維素分離，酶解糖化，生物發(fā)酵等步驟。這些復(fù)雜的過程增加了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，使二代燃料乙醇的生產(chǎn)仍停留在研發(fā)階段。
[0003]木糖渣是木糖生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，而木糖通常是由生物質(zhì)(玉米芯、甘蔗渣)中的半纖維素降解得到的。由于木糖生產(chǎn)中，90%以上半纖維素已經(jīng)得到去除，因此木糖渣中的纖維素含量非常高(65%左右)，是理想的二代燃料乙醇的原料。目前，大規(guī)模應(yīng)用于木糖生產(chǎn)的方法主要有酸水解法(ZL200480016169.0，ZL200710112975.3)和蒸汽爆破方法(ZL20131047000.3)。其中酸水解主要是用1.4-2.0 %的硫酸在0.11-0.15Mpa下水解90-150min ;蒸汽爆破則是先用0.1-0.2%的硫酸浸泡，再在0.4-1.8Mpa壓力下進(jìn)行瞬時(shí)噴爆。上述兩種方法得到 的木糖渣在結(jié)構(gòu)上有所差異，酸水解對(duì)于木質(zhì)素和纖維素的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞程度較低，因此酸水解后的木糖渣較難直接被纖維素酶水解，通常需要堿液處理后才能糖化(ZL200910090186.3，ZL201210332435.7);而蒸汽爆破對(duì)于木質(zhì)素的破壞程度較高，同時(shí)壓力差形成的剪切力能夠增加纖維素的比表面積和表面孔隙率，使蒸汽爆破后的木糖渣能夠直接被纖維素酶糖化。
[0004]目前用于燃料乙醇的發(fā)酵菌株集中在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(ZL200880119451.X)以及釀酒酵母(201010111324.4)。然而上述菌株均為游離細(xì)胞，在連續(xù)發(fā)酵過程中易隨發(fā)酵液流出，從而降低了發(fā)酵罐中的細(xì)胞濃度，延長(zhǎng)了平均發(fā)酵時(shí)間。采用吸附、包埋或交聯(lián)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵菌株的固定化，從而解決游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵的問題，但固定化材料的使用增加了乙醇發(fā)酵的成本，且操作復(fù)雜。自絮凝酵母是指在發(fā)酵過程中能夠自發(fā)形成毫米級(jí)松散顆粒的特殊菌株，利用自絮凝酵母可以實(shí)現(xiàn)燃料乙醇的無載體固定化發(fā)酵，從而有效提高乙醇生產(chǎn)效率，同時(shí)降低菌體分離成本。目前報(bào)道過的自絮凝酵母均是以具有自絮凝能力的粟酒裂殖酵母和乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母通過常規(guī)酵母細(xì)胞原生質(zhì)體融合技術(shù)得到的融合株(ZL01138778.5)。本課題組經(jīng)過長(zhǎng)期的研究，從自然界中篩選到了一株天然的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的自絮凝酵母，經(jīng)過ISSrDNA序列信息比對(duì)該酵母與Lachanceafermentati 具有 100 % 的同源性，故將其命名為 Lachancea fermentati Y309 (GenBankAccession N0.KJ451620)。該菌株目前已經(jīng)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，登記號(hào)8844，保藏時(shí)間為2014年2月24日，保藏地址為中國(guó)科學(xué)研究院微生物研究所，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于能夠提供一種具有自絮凝特征的乙醇發(fā)酵菌株，同時(shí)提供一種利用木糖渣酶解液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。
[0006]一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的自絮凝酵母,其拉丁文名為L(zhǎng)achancea fermentati Y309,保藏號(hào)為 CGMCC N0.8844。
[0007]一種利用木糖渣酶解液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟:
[0008](I)根據(jù)來源不同 本專利使用的木糖渣分為兩種，其中木糖渣A為玉米芯酸解殘?jiān)?，木糖渣B為玉米芯蒸汽爆破殘?jiān)?。?duì)于木糖渣A，需要先將木糖渣在堿性溶液中進(jìn)行預(yù)處理，然后再將預(yù)處理后的木糖渣A進(jìn)行酶解糖化；對(duì)于木糖渣B，則直接將其進(jìn)行酶解糖化。
[0009](2)步驟I中所述的堿性溶液為亞硫酸鈉和雙氧水的混合溶液，其中亞硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% _8%，雙氧水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% -2.5%。向IL堿性溶液中加入150-200g的木糖渣A。預(yù)處理溫度為80-150°C，預(yù)處理攪拌轉(zhuǎn)速為100-300rpm，預(yù)處理時(shí)間為l_3h。
[0010](3)步驟I中所述的預(yù)處理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同。使用PH4.8的醋酸或檸檬酸緩沖溶液作為酶解緩沖液，向IL緩沖液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纖維素酶，酶解溫度為45-55 °C，酶解攪拌轉(zhuǎn)速為100-300rpm，酶解時(shí)間 66_72h。
[0011](4)酶解結(jié)束后，通過固液分離得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液。利用高效液相色譜法測(cè)定酶解液中葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖收率。然后將木糖渣酶解液濃縮至葡萄糖濃度為 100-200g/L。
[0012](5)將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度30_35°C，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm下培養(yǎng)18_24h。取上述種子液，按照5% -10% (v/v)的接種量接入到含有木糖渣酶解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度30-35°C，發(fā)酵pH值控制在6.0-6.5，發(fā)酵周期為40-50h。
[0013](6)步驟5中所述的自絮凝酵母為實(shí)驗(yàn)室自主篩選得到的Lachancea fermentatiY309。該自絮凝酵母菌落呈白色，圓形，表面有褶皺。液體培養(yǎng)過程中細(xì)胞會(huì)自發(fā)絮凝形成毫米級(jí)大小的顆粒，如附圖1所示。每升種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g，酵母膏4g，蛋白胨3g，硫酸鎂lg。向IL步驟4的木糖渣酶解液中加入磷酸二氫鉀l_2g，硫酸銨2-4g，硫酸鎂0.1-1g配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0014](7)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。利用高效液相色譜分析發(fā)酵液中殘?zhí)呛鸵掖己?，?jì)算乙醇收率。
[0015]步驟(4)和步驟(7)中的葡萄糖收率和乙醇收率的計(jì)算公式為:
[0016]葡萄糖收率=酶解液中葡萄糖濃度(g/L) X酶解液體積(L)/木糖渣中纖維素的質(zhì)量(g) χιοο% ；
[0017]乙醇收率=發(fā)酵液中乙醇濃度(g/L) X發(fā)酵液體積(L)/發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度(g)/乙醇理論收率(0.51) X 100%
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利具有以下優(yōu)勢(shì):
[0019](I)本發(fā)明使用的纖維素原料為木糖生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物木糖渣，由于其半纖維素已經(jīng)大部分被去除，纖維素含量高，因此通過簡(jiǎn)單處理即可酶解糖化。特別是玉米芯蒸汽爆破殘?jiān)?，可以直接被纖維素酶高效降解，從而進(jìn)一步降低了酶解成本和設(shè)備投資。
[0020](2)本發(fā)明使用的自絮凝酵母在發(fā)酵過程中能自發(fā)形成毫米級(jí)大小的顆粒，從而在發(fā)酵罐中能夠?qū)崿F(xiàn)無載體固定化，增加細(xì)胞密度，縮短發(fā)酵周期，尤其適用于大規(guī)模連續(xù)發(fā)酵過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為自絮凝酵母Lachancea fermentati Y309的掃描電鏡圖
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
[0023]向IL堿性溶液中加入150g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，雙氧水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。在80°C，150rpm下預(yù)處理3h后進(jìn)行固液分離得到預(yù)處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入100g預(yù)處理后的木糖渣A，再加入2000FPU的纖維素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為86.8 %。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為150g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.5g，硫酸銨3g，硫酸鎂0.5g配制成 發(fā)酵培養(yǎng)基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm下培養(yǎng)22h。取上述種子液，按照8% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵pH值控制在6.5，發(fā)酵周期為45h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?.8g/L,乙醇濃度為64.6g/L，乙醇收率為理論轉(zhuǎn)化率的84.5%。
[0024]實(shí)施例2
[0025]向IL堿性溶液中加入180g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，雙氧水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。在120°C，150rpm下預(yù)處理1.5h后進(jìn)行固液分離得到預(yù)處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入120g預(yù)處理后的木糖渣A，再加入3000FPU的纖維素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為89.3 %。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為180g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.Sg，硫酸銨3.6g，硫酸鎂Ig配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度35°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm下培養(yǎng)20h。取上述種子液，按照10% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵pH值控制在6.5，發(fā)酵周期為50h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?.3g/L,乙醇濃度為81.3g/L，乙醇收率為理論轉(zhuǎn)化率的88.6%。
[0026]實(shí)施例3
[0027]向IL堿性溶液中加入200g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，雙氧水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。在150°C，150rpm下預(yù)處理Ih后進(jìn)行固液分離得到預(yù)處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的檸檬酸緩沖溶液中加入150g預(yù)處理后的木糖渣A，再加入4500FPU的纖維素酶，在50°C，250rpm下酶解72h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為81.5%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為120g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.2g，硫酸銨2.6g，硫酸鎂0.2g配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度35°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm下培養(yǎng)24h。取上述種子液，按照5% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵pH值控制在6.0,發(fā)酵周期為40h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?.6g/L,乙醇濃度為55.2g/L，乙醇收率為理論轉(zhuǎn)化率的90.2%。
[0028]實(shí)施例4
[0029]向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入100g的木糖渣B，再加入2000FPU的纖維素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為85.4%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為150g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.58，硫酸銨38，硫酸鎂0.5g配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm下培養(yǎng)22h。取上述種子液，按照8% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵pH值控制在6.5，發(fā)酵周期為45h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?.4g/L,乙醇濃度為66.3g/L，乙醇收率為理論轉(zhuǎn)化率的86.7%。
[0030]實(shí)施例5
[0031]向lLpH4.8的檸檬酸緩沖溶液中加入120g的木糖渣B，再加入3000FPU的纖維素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為88.7%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃 度為180g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.Sg，硫酸銨3.6g，硫酸鎂Ig配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度35°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm下培養(yǎng)20h。取上述種子液，按照10% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵pH值控制在6.5，發(fā)酵周期為50h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發(fā)酵液分離。此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?.9g/L,乙醇濃度為82.4g/L，乙醇收率為理論轉(zhuǎn)化率的89.8%。
[0032]本發(fā)明中上述實(shí)施例中的溫度及時(shí)間等參數(shù)均為較優(yōu)的選擇，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明在超出上述實(shí)施例范圍外也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，因不能窮盡所有的數(shù)值，在此不再贅述。
[0033]以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的自絮凝酵母，其拉丁文名為L(zhǎng)achancea fermentati Y309,保藏號(hào)為 CGMCC8844。
2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的自絮凝酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟: 木糖渣分為兩種，其中木糖渣A為玉米芯酸解殘?jiān)?，木糖渣B為玉米芯蒸汽爆破殘?jiān)?；?duì)于木糖渣A，需要先將木糖渣在堿性溶液中進(jìn)行預(yù)處理，然后再將預(yù)處理后的木糖渣A進(jìn)行酶解糖化；對(duì)于木糖渣B，則直接將其進(jìn)行酶解糖化； 所述的堿性溶液為亞硫酸鈉和雙氧水的混合溶液，其中亞硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% _8%，雙氧水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% -2.5%;向IL堿性溶液中加入150-200g的木糖渣A;預(yù)處理溫度為80-150°C，預(yù)處理攪拌轉(zhuǎn)速為100-300rpm，預(yù)處理時(shí)間為l_3h ； 所述的預(yù)處理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同；使用pH4.8的醋酸或檸檬酸緩沖溶液作為酶解緩沖液，向IL緩沖液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纖維素酶，酶解溫度為45-55°C，酶解攪拌轉(zhuǎn)速為100-300rpm，酶解時(shí)間66-72h ； 酶解結(jié)束后，通過固液分離得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液；然后將木糖渣酶解液濃縮至葡萄糖濃度為100-200g/L ;向IL木糖渣酶解液中加入磷酸二氫鉀l_2g，硫酸銨2_4g，硫酸鎂0.1-1g配制成發(fā)酵培養(yǎng)基； 將自絮凝酵母接種到種子培養(yǎng)基中，搖床溫度30-35°C，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm下培養(yǎng)18_24h得到種子液；所 述的自絮凝酵母為L(zhǎng)achancea fermentati Y309 ;每升種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g,酵母膏4g,蛋白胨3g,硫酸鎂Ig ； 取上述種子液，按照5% -10%的接種量接入到含有木糖渣酶解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵溫度30-35°C，發(fā)酵pH值控制在6.0-6.5，發(fā)酵周期為40_50h。
【文檔編號(hào)】C12P7/10GK104004669SQ201410168809
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】袁其朋, 范曉光, 霍辰青, 王世曾, 譚旭 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)