一種狂犬病滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟：對倉鼠腎細胞系進行細胞的復蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；然后對處理后的倉鼠腎細胞進行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025％的比例加入B-丙內酯，在4℃條件下滅活24小時，然后在37℃條件下水解2小時，然后按照水解后細胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。使其具有操作簡單、工藝穩(wěn)定、疫苗病毒含量高、質量易控等優(yōu)點，可顯著提高疫苗產量和質量，并且采用本發(fā)明制備方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。
【專利說明】一種狂犬病滅活疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種狂犬病滅活疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前我國生產犬用狂犬病滅活疫苗主要用傳統(tǒng)的轉瓶培養(yǎng)細胞生產，此方法成本高、毒價低、勞動強度大。同時因各個轉瓶都是獨立單元，每瓶的細胞質量、病毒滴度均不相同，致使生產出的疫苗質量不穩(wěn)定、批量差異大。因此，現(xiàn)有技術還有待于更進一步的改進和發(fā)展。

【發(fā)明內容】

[0003]鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，以提高制作工藝的穩(wěn)定性與病毒含量。
[0004]本發(fā)明的技術方案如下:
[0005]一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟:
[0006]A、對倉鼠腎細胞系進行細胞的復蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；
[0007]B、然后在步驟A處理后的倉鼠腎細胞進行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；
[0008]C、制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內酯，在4°C條件下滅活24小時，然后在37°C條件下水解2小時，然后按照水解后細胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0009]所述的制備方法，其中，所述步驟A具體的包括:
[0010]先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復蘇的倉鼠腎細胞，待其長成單層后經胰酶消化傳代，加入細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。
[0011]所述的制備方法，其中，所述步驟A具體的包括:在細胞接種密度為
2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對倉鼠腎細胞進行全懸浮培養(yǎng)。
[0012]所述的制備方法，其中，所述步驟B具體的包括:取步驟A中生長良好的單層倉鼠腎細胞，接種含狂犬病 病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。
[0013]所述的制備方法，其中，所述步驟B具體的包括:
[0014]將狂犬病毒種在接種量為1% _2%，溶氧量為30% -60%, Ph值為7.2-7.4，轉數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當病毒含量達到107 5TCID5(l/ml時得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
[0015]所述的制備方法，其中，所述細胞生長液為99% -97%的MEM199液與1% -3%的胎牛血清，且細胞生長液的Ph值為7.2-7.4。
[0016]本發(fā)明提供的一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，采用復蘇、傳代、培養(yǎng)、毒種繁殖、毒液繁殖與滅活分裝的步驟，使其具有操作簡單、工藝穩(wěn)定、疫苗病毒含量高、質量易控等優(yōu)點，可顯著提高疫苗產量和質量，并且采用本發(fā)明制備方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的制備方法細胞生長液血清中的濃度可降低至1% -3% ;不僅能提高細胞生長密度，提高病毒滴度，能生產出的病毒液均一穩(wěn)定，顯著提高了疫苗的產量和質量，
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明提供了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明提供了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟:
[0019]步驟101:對倉鼠腎細胞系進行細胞的復蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；
[0020]步驟102:然后在步驟:101處理后的倉鼠腎細胞進行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；
[0021]步驟103:制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內酯，在4°C條件下滅活24小時，然后在37°C條件下水解2小時，然后按照水解后細胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0022]更進一步的，所述步驟101具體的包括:
[0023]先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復蘇的倉鼠腎細胞，待其長成單層后經胰酶消化傳代，加入細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。 [0024]在本發(fā)明的另一較佳實施例中，所述步驟101具體的還包括:在細胞接種密度為
2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對倉鼠腎細胞進行全懸浮培養(yǎng)。
[0025]更進一步的，所述步驟102具體的包括:取步驟101中生長良好的單層倉鼠腎細胞，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。并且將狂犬病毒種在接種量為I % -2 %,溶氧量為30 % -60%, Ph值為7.2-7.4，轉數(shù)為50r/min-60r/min,培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4_6天，當病毒含量達到107_5TCID5ciAil時得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
[0026]在步驟101中的所述細胞生長液為99% -97%的MEM199液與1% _3%的胎牛血清，且細胞生長液的Ph值為7.2-7.4。
[0027]為了更進一步描述本發(fā)明，以下列舉更詳盡的實施例進行說明。
[0028](I)篩選適宜細胞系:將狂犬病毒株接種于倉鼠腎傳代細胞上，不斷培養(yǎng)傳代，控制培養(yǎng)條件，Ph值7.2-7.4、溫度32°C _34°C，使病毒適應細胞，檢測病毒增殖滴度，當所需病毒含量每毫克達到>107_5TCID5tZml，篩選出適宜細胞；
[0029](2)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):長成單層的細胞經胰酶消化傳代，加入細胞生長液于37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層的細胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:DMEM:
199= 1:1, Ph值為7.2-7.4，溫度為36°C _37°C，培養(yǎng)時間為48小時-72小時；
[0030](3)倉鼠腎細胞的生物反應器全懸浮培養(yǎng):將長成單層的倉鼠腎細胞經胰酶細胞分散液消化為單個細胞，接種于生物反應器中，細胞接種密度為2-3X103cellS/ml，溶氧量為 30% -60%，Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉數(shù)為 50r/min_60r/min，培養(yǎng)基為DMEM: 199 =1:1。[0031](4)細胞毒種的繁殖:將生長良好的單層倉鼠腎細胞，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種；
[0032]細胞毒種的鑒定:細胞毒種鑒定完全符合狂犬病病毒CVS-1l株毒種標準，細胞毒種每毫升病毒含量>107_ 5TCID50/mL.[0033](5)細胞毒液的繁殖:將狂犬病毒種在接種量為1% _2%，溶氧量為30% -60%,Ph 值為 7.2-7.4，轉數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為 DMEM: 199 = 1:1，溫度為 32°C -34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當病毒含量達到107 5TCID5(l/ml時得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在-20°C條件下保存。
[0034](6)病毒的滅活、配苗與分裝:制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內酯，在4°C條件下滅活24小時，然后在37°C條件下水解2小時，然后按照水解后細胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0035]安全檢測
[0036]用體重11克-13克的小白鼠8只，各腹腔注射疫苗0.5ml，觀察7日，全部健活，無不良反應。并與市面上的狂犬疫苗進行比較，其結果如表1所示。
[0037]表1
[0038]
【權利要求】
1.一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟: A、對倉鼠腎細胞系進行細胞的復蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟； B、然后在步驟A處理后的倉鼠腎細胞進行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟； C、制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內酯，在4°C條件下滅活24小時，然后在37°C條件下水解2小時，然后按照水解后細胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體的包括: 先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復蘇的倉鼠腎細胞，待其長成單層后經胰酶消化傳代，加入細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體的包括:在細胞接種密度為 2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C -37。。，轉數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對倉鼠腎細胞進行全懸浮培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括:取步驟A中生長良好的單層倉鼠腎細胞 ，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括: 將狂犬病毒種在接種量為I % -2%，溶氧量為30% -60%, Ph值為7.2-7.4，轉數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當病毒含量達到107 5TCID5(l/ml時得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
6.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述細胞生長液為99% -97 %的MEM199液與1% -3%的胎牛血清，且細胞生長液的Ph值為7.2-7.4。
【文檔編號】C12R1/93GK103948919SQ201410168670
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
【發(fā)明者】吳金, 張中洋, 高玉龍, 任培森, 李曉莉, 楊金梅, 孫巖 申請人:吉林和元生物工程有限公司