生產(chǎn)mstn雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，其利用高效簡便的基因修飾技術(shù)TALEN技術(shù)，設(shè)計(jì)構(gòu)建能高效敲除MSTN基因的質(zhì)粒；通過電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，磁珠分選陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，化學(xué)輔助去核方法去核后進(jìn)行體細(xì)胞核移植；經(jīng)胚胎移植確定妊娠后26-36天取出胎兒進(jìn)行基因測序，以MSTN雙側(cè)基因敲除胎兒細(xì)胞作為供體細(xì)胞再次體細(xì)胞核移植，胚胎移植；足月分娩后免疫組化及形態(tài)學(xué)觀察，確定為雙肌性狀克隆豬。獲得MSTN-/-雙側(cè)敲除的雙肌性狀克隆公豬，取精液對發(fā)情母豬進(jìn)行人工受精，獲得大量雙肌豬。本發(fā)明工藝簡單，易于實(shí)施，且可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)雙肌豬，利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)研究。
【專利說明】生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種克隆動物模型的構(gòu)建方法，特別是一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對營養(yǎng)與健康的日漸重視，市場的瘦肉需求量也越來越大，而這種現(xiàn)象卻導(dǎo)致了“注水豬肉”、“瘦肉精”、“三聚氰胺”等事件的發(fā)生，對人們的健康和生活造成了嚴(yán)重的困擾。中國是全世界最大的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國，在生豬存欄量減少的情況下，人均豬肉占有量呈現(xiàn)上升勢頭。肌肉是動物胴體的最重要的組成部分，肌肉的生產(chǎn)是動物生產(chǎn)學(xué)中三大生產(chǎn)方向(肉、蛋、奶)之一，肌肉的產(chǎn)量是肉用畜禽的重要的經(jīng)濟(jì)性狀，也是畜牧生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)方向。為此，長期以來育種學(xué)家們都將肌肉生產(chǎn)列為主要的研究目標(biāo)。同時(shí)在醫(yī)學(xué)方面肌肉消耗和衰竭癥狀的患者正逐年增多，為患者生產(chǎn)能夠使雙肌性狀的克隆豬模型項(xiàng)目的啟動迫在眉睫。
[0003]肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)是近幾年來發(fā)現(xiàn)的骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，其活性的喪失，會引起動物肌肉的過度發(fā)育，肌纖維直徑變大或肌纖維數(shù)增加，表現(xiàn)為動物的“雙肌”性狀。各國科學(xué)工作者分別將基因敲除、基因診斷、分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)上,力求培育出一些高產(chǎn)肉率、肉質(zhì)好和飼料報(bào)酬高的肉用品種。
[0004]體細(xì)胞核移植技術(shù)是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的最有效方法。體細(xì)胞核移植技術(shù)與基因修飾技術(shù)結(jié)合代表了未來轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展方向。2000年，Betthauser等系統(tǒng)地優(yōu)化了豬體細(xì)胞核移植的各個步驟，包括卵母細(xì)胞的來源和體外成熟培養(yǎng)、供體細(xì)胞的培養(yǎng)、核移植后卵的激活、胚胎的體外培養(yǎng)和胚胎移植代孕，建立了一套穩(wěn)定的豬體細(xì)胞核移植程序，為通過核移植技術(shù)生產(chǎn)基因修飾豬的技術(shù)路線奠定了基礎(chǔ)。2001年，Park等報(bào)道以轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白基因的豬成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植獲得轉(zhuǎn)基因豬，第一次打通了通過體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)路線。在國內(nèi)2002年，賴良學(xué)等采用這一技術(shù)路線，利用同源重組技術(shù)敲除小型豬成纖維細(xì)胞α-1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GGTAl)基因，得到四頭GGTAl基因敲除克隆豬，第一次實(shí)現(xiàn)了豬的基因定點(diǎn)修飾，但此類核移植克隆豬技術(shù)還存在效率低的問題。
[0005]參閱CN101892264A等文獻(xiàn)，雖然研究人員通過不同方法獲得MSTN基因敲除胎兒，但均為MSTN單側(cè)基因敲除，未達(dá)到理想的MSTN雙側(cè)基因敲除雙肌性狀健康豬個體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的提供一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)問題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目 的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs基因表達(dá)盒，其特征在于包含SEQ.N0.1~2所示的核酸序列。[0009]上述TALENs基因表達(dá)盒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
[0010]一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs質(zhì)粒，包含用以切割MSTN基因特異位點(diǎn)而形成上述基因表達(dá)盒的TALENs質(zhì)粒。
[0011]上述TALENs質(zhì)粒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
[0012]利用上述TALENs基因表達(dá)盒或上述TALENs質(zhì)粒構(gòu)建的MSTN基因敲除陽性細(xì)胞系O
[0013]上述MSTN基因敲除陽性細(xì)胞系在生產(chǎn)雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
[0014]一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，包括如下步驟:
[0015](I)提供上述TALENs質(zhì)粒，其作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子的特定序列，其如SEQ.N0.3所示；
[0016](2)提供豬胎兒成纖維細(xì)胞，并通過電轉(zhuǎn)染法以所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，再分選出其中的陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，且利用化學(xué)輔助去核方法去核后進(jìn)行體細(xì)胞核移植；
[0017](3)經(jīng)胚胎移植確定妊娠后26-36天取出胎兒建立胎兒成纖維細(xì)胞后進(jìn)行基因測序;
[0018](4)以步驟⑵所獲MSTN雙側(cè)基因敲除胎兒細(xì)胞作為供體細(xì)胞再次體細(xì)胞核移植，實(shí)現(xiàn)胚胎移植；
[0019](4)足月分娩后免疫組化及形態(tài)學(xué)觀察，確定為雙肌性狀克隆豬；
[0020](5)利用步驟(4)所獲MSTN雙側(cè)敲除的雙肌性狀克隆公豬，取精液對發(fā)情母豬進(jìn)行人工受精，進(jìn)而批量生產(chǎn)雙肌豬。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括:開發(fā)了一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，其工藝簡單，易于實(shí)施，且可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)雙肌豬，當(dāng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)方面時(shí)，將改進(jìn)肌肉質(zhì)量和重量，生產(chǎn)具有商業(yè)化性質(zhì)的優(yōu)良品種家畜，而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也會對人的肌肉萎縮、肌營養(yǎng)不良等疾病提供良好的治療切入點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的工藝流程圖；
[0023]圖2所示是本發(fā)明中TALEN介導(dǎo)的豬胎兒成纖維細(xì)胞及磁珠分選MACS后的富集細(xì)胞；
[0024]圖3所示是本發(fā)明中公豬胎兒成纖維細(xì)胞的MSTN基因測序結(jié)果，其中，黑色加粗部分為堿基插入，“---”為堿基缺失。
[0025]圖4所示是本發(fā)明所獲的MSTN+雙側(cè)敲除體細(xì)胞克隆公豬的照片；
[0026]圖5所示是本發(fā)明中肌肉形態(tài)測定分析圖譜，經(jīng)HE染色MSTN+雙側(cè)敲除公豬(圖4b)比對照組(圖4a)肌纖維明顯肥大；
[0027]圖6所示是本發(fā)明中免疫印跡分析圖譜，MSTN+雙側(cè)敲除公豬Myostatin基因沒表達(dá)；
[0028]圖7所示是本發(fā)明中以Scion Image軟件測量肌纖維直徑分析400個肌纖維，并計(jì)算平均值所獲圖譜，結(jié)果顯示MSTN+雙側(cè)敲除公豬肌纖維直徑比對照組肌纖維明顯大；[0029]圖8所示是本發(fā)明中大量生產(chǎn)MSTN+豬的方法的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明中記載的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0031]本發(fā)明的主旨在于提供一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，其利用目前最高效簡便的基因修飾技術(shù)TALEN技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀克隆豬，并可應(yīng)用雙肌豬的規(guī)模化生產(chǎn)。
[0032]更為具體的講，參閱圖1，本發(fā)明的工藝包括:利用TALEN技術(shù)，設(shè)計(jì)構(gòu)建能高效敲除肌生成抑制素基因的質(zhì)粒和編碼TALENs的信使核糖核酸；通過電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，磁珠分選陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，化學(xué)輔助去核方法去核后進(jìn)行體細(xì)胞核移植；經(jīng)胚胎移植確定妊娠后26-36天取出胎兒建立胎兒成纖維細(xì)胞后進(jìn)行基因測序，以MSTN雙側(cè)基因敲除胎兒細(xì)胞作為供體細(xì)胞再次體細(xì)胞核移植，胚胎移植；足月分娩后免疫組化及形態(tài)學(xué)觀察，確定為雙肌性狀克隆豬；獲得MSTN雙側(cè)敲除的雙肌性狀克隆公豬，取精液對發(fā)情母豬進(jìn)行人工受精，獲得大量雙肌豬。
[0033]體細(xì)胞克隆獲得的胎兒建立成纖維細(xì)胞后進(jìn)行基因測序，10種體細(xì)胞體株的MSTN基因發(fā)生突變，其中3株細(xì)胞為MSTN基因雙側(cè)突變具體為F1、F2、19_3，7株細(xì)胞為MSTN基因單側(cè)基因突變具體為F3、F5、F9、18-2、18-3、19-1、19-4，突變部位的堿基序列如圖2所示。對獲得的10個陽性突變胎兒細(xì)胞系永久冷凍保存并提供未來大量克隆基因突變豬。
[0034]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0035]需要說明的是，在本文中，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。
[0036]實(shí)施例1:TALEN的構(gòu)建
[0037]針對MSTN基因特異位點(diǎn)的TALENs設(shè)計(jì)和構(gòu)建由韓國ToolGen公司完成(NCBI基因編號:399534 ;基因組序列號:NC_010457.3)。經(jīng)生物信息學(xué)方法分析和在酵母中的DNA切割能力比較，最終確定了 I對TALENs，作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子特定序列(表 I)。
[0038]TALEN是由一個TAL復(fù)制域和一個核酸內(nèi)切酶的切割域(Fok I )構(gòu)成。Fok I的切割域形成RR或DAS的異質(zhì)二聚體，可以打靶MSTN基因突變exonl位點(diǎn)。TALENs由ToolGen公司構(gòu)建。424TAL效應(yīng)子陣列質(zhì)粒構(gòu)建由一共84個TAL效應(yīng)子質(zhì)粒構(gòu)成，其中包括64個三單元模塊質(zhì)粒，16個二單元模塊質(zhì)粒和4個多單元模塊質(zhì)粒排列成NN、HD、NI和NG的所有可能組合。RVD模塊的建立采用GenScript技術(shù)。為了避免不良反應(yīng)，本發(fā)明排除了人類罕見的密碼子和有限的最大序列鑒別不同的RVDs81%。每84個質(zhì)粒由適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)6個TAL效應(yīng)子陣列的位置由BsaI消化。PCR擴(kuò)增子在以卡那霉素抗藥性選擇標(biāo)記的主鏈載體擴(kuò)增亞克隆。8個FokI表達(dá)質(zhì)粒含有氨芐西林抗藥性基因、CMV啟動子、一個HA附加表位、核定位信號、AvrBs3的η端135個氨基酸,其中一個中心四個RVD半復(fù)制和sharkeyFokl切割域(DAS或RR) 32。
[0039]表1 TALEN-MSTN對應(yīng)的DNA結(jié)合位點(diǎn)
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs基因表達(dá)盒，其特征在于，包含SEQ.N0.1~2所示的核酸序列。
2.權(quán)利要求1所述TALENs基因表達(dá)盒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
3.一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，包含用以切割MSTN基因特異位點(diǎn)而形成上述基因表達(dá)盒的TALENs質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，與所述質(zhì)粒相應(yīng)的NCBI基因編號為399534 ;基因組序列號為NC_010457.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子特定序列，該特定序列如SEQ.N0.3所示。
6.權(quán)利要求3或4所述TALENs質(zhì)粒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
7.利用權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述TALENs基因表達(dá)盒或權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)所述的TALENs質(zhì) 粒構(gòu)建的MSTN基因敲除陽性細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求7所述MSTN基因敲除陽性細(xì)胞系在生產(chǎn)雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。
9.一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提供權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)所述的TALENs質(zhì)粒，其作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子的特定序列，該特定序列如SEQ.N0.3所示； (2)提供豬胎兒成纖維細(xì)胞，并通過電轉(zhuǎn)染法以所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，再分選出其中的陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，且利用化學(xué)輔助去核方法去核后進(jìn)行體細(xì)胞核移植； (3)經(jīng)胚胎移植確定妊娠后26-36天取出胎兒建立胎兒成纖維細(xì)胞后進(jìn)行基因測序； (4)以步驟(2)所獲MSTN雙側(cè)基因敲除胎兒細(xì)胞作為供體細(xì)胞再次體細(xì)胞核移植，實(shí)現(xiàn)胚胎移植； (4)足月分娩后免疫組化及形態(tài)學(xué)觀察，確定為雙肌性狀克隆豬； (5)利用步驟(4)所獲MSTN雙側(cè)敲除的雙肌性狀克隆公豬，取精液對發(fā)情母豬進(jìn)行人工受精，進(jìn)而批量生產(chǎn)雙肌豬。
【文檔編號】C12N15/63GK103952424SQ201410168615
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】尹熙俊, 金奭中, 金進(jìn)秀, 康錦丹 申請人:尹熙俊