專利名稱：褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中的活性表達與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木糖異構(gòu)酶的提取及應用，具體涉及一種褐色喜熱裂孢菌 木糖異構(gòu)酶的提取方法及其在釀酒酵母中的活性表達與應用。
技術(shù)背景木糖異構(gòu)酶(EC5.3.15),既能催化木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，也能催化葡萄糖 轉(zhuǎn)化為果糖，該酶可應用于高果糖漿的生產(chǎn)。木糖異構(gòu)酶的另一重要潛在應用 在于可再生木質(zhì)纖維素資源的開發(fā)。木質(zhì)纖維素是年產(chǎn)量巨大且目前尚未被充 分利用的可再生資源，其水解物中木糖的含量僅次于葡萄糖。當前隨著能源危 機和環(huán)境污染的日益嚴重，對可再生資源的利用和尋求清潔能源是大勢所趨。 燃料乙醇是最有發(fā)展前景的環(huán)境友好新型能源。因此利用木糖，特別是通過微 生物轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)生乙醇，是解決能源危機和環(huán)境污染的途徑之一。促進木糖向 乙醇的生物轉(zhuǎn)化是充分利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，降低乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 之一。因此，利用基因工程手段，拓展乙醇轉(zhuǎn)化的底物，對于木質(zhì)纖維素資源 全利用具有重要的理論意義和應用價值。木糖代謝的研究己經(jīng)取得了許多進展，包括木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源的降 解，具有直接發(fā)酵木糖成酒精能力的細菌、真菌及酵母菌種的選育，木糖發(fā)酵 工程菌的構(gòu)建等。迄今為止已發(fā)現(xiàn)100多種微生物可代謝木糖，包括細菌、真 菌和酵母。能利用木糖的細菌是在木糖異構(gòu)酶的作用下直接轉(zhuǎn)化木糖形成木酮 糖。釀酒酵母菌由于缺乏將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶，而不能利用木糖。釀酒酵 母是工業(yè)上生產(chǎn)酒精的優(yōu)良菌株，與細菌相比具有較高的乙醇耐受力，對纖維 材料水解液中的抑制物有較高的抗性，但酵母菌只能代謝木糖的異構(gòu)體形式一一木酮糖。木酮糖由木酮糖激酶催化形成5 —磷酸木酮糖，然后進入磷酸戊糖 途徑(PPP途徑)，并經(jīng)糖酵解途徑或在厭氧條件下產(chǎn)生乙醇，或在好氧條件下經(jīng)TCA循環(huán)徹底氧化。引入細菌木糖異構(gòu)酶基因(矽/A)是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖成為較易運輸并可被釀酒酵母直接利用的木酮糖。由于直接完成木糖的 木酮糖的轉(zhuǎn)化，并且不需要任何輔助因子，被認為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母基 因工程菌株的便利途徑。目前很多科研工作者致力于構(gòu)建能直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精的酵母工程菌，大腸桿菌(￡.co// )、米蘇里游動放線菌(Am^。wn'e,'s)，枯草芽孢桿菌(fi.和乳糖桿菌(丄.； e"tos附)的木糖異構(gòu)酶基因w"曾先后被克隆于 釀酒酵母菌中，但均沒有得到有活性的表達。目前只有嗜熱(r.決wmop/H 附) 及高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(C. )的木糖異構(gòu)酶基因在釀酒酵母中得到了活性表達。鮑曉明等嗜熱細菌木糖異構(gòu)酶基因矽/A 在釀酒酵母中的高效表達[J].微生物學報，1999， 39 (1) : 49-54采用 PCR技術(shù)，克降得到高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(C. Aemw/zj^ra^/y^z'cwm ) 木糖異構(gòu)酶基因(砂/A)，并在釀酒酵母H158中得到活性表達，此外還利用 輔酶工程手段，釀酒酵母工程菌株可以在木糖為唯一碳源的平板上生長；搖瓶 發(fā)酵實驗結(jié)果表明，該工程菌株可以發(fā)酵木糖形成1.3#乙醇。迄今為止，還未有將褐色喜熱裂孢菌(77^rmo6i/^a/w5c，簡寫成7Vks"， 下同)的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中表達的報道。 發(fā)明內(nèi)容由于目前只有極少數(shù)細菌木糖異構(gòu)酶基因能在釀酒酵母中活性表達，在很 大程度上制約了直接發(fā)酵木糖生產(chǎn)灑精的酵母工程菌的研究和利用。本發(fā)明的 目的在于利用基因工程技術(shù)，提供一種能夠在釀酒酵母中得到活性表達并能應用于發(fā)酵制備乙醇的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶，獲得不同類型的重組菌株，為提高了釀酒酵母菌在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的能力打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明人在分析嗜熱微生物的基因組時，發(fā)現(xiàn)可以用生物信息學的方法在 一系列已注釋的脫氧核糖核酸中找到非常有用的信息。結(jié)合基因的克隆和異源 基因表達技術(shù)，以及通過對表達的蛋白質(zhì)進行特征鑒定，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌T/WM"的 木糖異構(gòu)酶基因經(jīng)過克隆和培養(yǎng)，在宿主中表達出具有酶活力的木糖異構(gòu)酶， 使基因工程菌能以木糖、葡萄糖等為碳源發(fā)酵制得乙醇或其它發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種木糖異構(gòu)酶(W/A)的提取方法，其特征在于所述的木糖異構(gòu)酶基因 選自褐色喜熱裂孢菌(T7zw/^Z^^"/^c")，提取方法包含以下步驟首先設計正向引物5 ， -ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3，，反向引物5，-ATAGGATCCTTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3，，采用現(xiàn) 有聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)從基因組里獲得褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶基 因，然后對PCR產(chǎn)物進行初步純化，并利用和////^/111對PCR產(chǎn)物進行 雙酶切，再與同樣雙酶切過的穿梭載體pYES2質(zhì)粒連接，獲得重組表達質(zhì)粒 pYES2-xylA。所述褐色喜熱裂孢菌可以從微生物菌種保藏中心購買，也可以通過野外采 集和其他途徑獲得。所述重組質(zhì)粒攜帶的木糖異構(gòu)酶基因可以在釀酒酵母中獲得木糖異構(gòu)酶活 性表達，該酶的主要特征是分子量為43KD，酶的最適反應溫度為80 85'C， 酶的最適反應pH是7.0。表達的方法包括如下步驟制備釀酒酵母菌(Sacc/2flwmyc^ ce WWae，簡寫Sc，下同)的感受態(tài)細胞，然后用重組質(zhì)粒pYES2-xylA電轉(zhuǎn)化Sc的感受態(tài)細胞，得重組釀酒酵母菌 Sc/p YES2-xylA;在可使木糖異構(gòu)酶基因表達的條件下培養(yǎng)該重組菌，把細胞 破碎后所得粗酶液用果糖做底物，在酶的合適條件下進行反應，可以檢測到木 糖異構(gòu)酶活力。本發(fā)明所述的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶，可用于構(gòu)建利用木 糖的重組釀酒酵母菌，所構(gòu)建的重組菌可以應用于發(fā)酵生產(chǎn)包括乙醇在內(nèi)的各 種發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種以褐色喜熱裂孢菌為來源并能在釀酒酵母中活性表達的 新的木糖異構(gòu)酶提取途徑，擴充了能直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精的酵母工程菌菌 株。該褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶成功的在釀酒酵母中獲得了很好的活性表 達，并成功地應用于木糖的代謝利用，可用于發(fā)酵過程中生產(chǎn)包括乙醇在內(nèi)的 各種發(fā)酵產(chǎn)物，具備良好的生物質(zhì)能源開發(fā)和利用前景。
具體實施方式
為更好的理解本發(fā)明，下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明，但 不限制本發(fā)明。實施例l一、褐色喜熱裂孢菌(r&ww6iyMfl/"scfl)基因組DNA的提取接種褐色喜熱裂孢菌(購于中國微生物菌種保藏管理中心)在20ml淀粉 牛肉膏培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比(m/v)，由9%的可溶性淀粉、0.5 %的牛肉膏、0.5%的酵母膏、0.5%的NaCl、 0.2%的K2HP04和1%的微量元 素溶液組成。將接種過的培養(yǎng)基置于55'C恒溫搖床里培養(yǎng)過夜。取1.5ml培養(yǎng) 物離心2min，所得沉淀用無菌水洗滌3次，晾干水分，將沉淀放入裝有液氮的 研缽迅速研磨成粉末，把粉末裝入EP管，然后用北京天根生物工程公司生產(chǎn)提供的細菌基因組DNA提取試劑盒提取獲得總DNA。二、 木糖異構(gòu)酶基因的克隆設計以下引物1、 正向引物5 ，國ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3';2、 反向引物5 ,-ATAGGATCCTTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT隱3'。然后按PCR Cloning Protocols中所講的步驟進行首先94。C， 2分鐘；然后按以下條件進行30個循環(huán)94°C30秒，60°C30秒，72°C1分30秒；最后72。C10min。用上海華舜生物工程有限公司的專用試劑盒對PCR產(chǎn)物進行初步純化，然 后用和歷m/III對PCR產(chǎn)物進行雙酶切，再與同樣用和歷"^ffl酶 切過的pYES2質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pYES2-xylA。三、 木糖異構(gòu)酶基因在釀酒酵母菌中的表達重組質(zhì)粒pYES2-xylA構(gòu)建完畢，先轉(zhuǎn)化DH5ot大腸桿菌感受態(tài)細胞，大 量制備pYES2-xylA表達質(zhì)粒，所得質(zhì)粒可用一部分于DNA測序以確認讀碼框 的正確性，另一部分則可以用來進行木糖異構(gòu)酶基因表達試驗。1、按《精編分子生物學實驗指南》(2005年第四版)所述的方法，制備 釀酒酵母菌Sc的感受態(tài)細胞，然后用pYES2-xylA轉(zhuǎn)化Sc感受態(tài)細胞，于30 。C培養(yǎng)72 144小時，挑出單菌落接入15ml含有2% (m/v)葡萄糖的SC-U0.17% (m/v) Yeast nitrogen base, (NH4)2S04 0.5% (m/v) ， 0.01% (m/v) 必需氨基酸(His, Leu， Trp，不含尿嘧啶U)培養(yǎng)基中，30°C、 220rpm/min 條件下振蕩培養(yǎng)過夜。2、 測定過夜培養(yǎng)物的OD6Q。，計算接入50ml培養(yǎng)基使其OD6。。為0.4的過 夜培養(yǎng)物的用量，丁2000rpm， 4。C離心5min，棄上清。3、 沉淀重懸于2ml誘導培養(yǎng)基含2% (m/v)半乳糖的SC-U培養(yǎng) 基)并接入50mlSC-U培養(yǎng)基中，30°C、 220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)8 12 小時。離心收集菌體后，即可進行蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳和酶活的測定。四、 含有重組表達載體pYES2-xylA的釀酒酵母菌全蛋白變性聚丙烯酰胺 凝(SDS-PAGE)電泳1、 取5ml誘導表達后的菌液離心收集細胞，加入500|Lil無菌水重懸，離 心棄上清，再用裂解緩沖液(0.1mol/L， pH 7.0的磷酸鈉緩沖液中含0.5mmol/L EDTA， lmmol/L PMSF， 0.5mmol/L DTT)洗滌1次，然后沉淀重懸于酵母裂 解緩沖液中，使其OD,為50 100。2、 、加入0.5g的酸洗玻璃珠(纟0.5mm)，蝸旋振蕩器振蕩30S，冰上放置 30S,重復4次。3、 離心取上清，加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮 5min。4、 于12000rpm離心10min，上樣20|al濃度為12%的凝膠中進行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍染色，再用脫色液脫色后得電泳圖譜。以含空載體 pYES2做空白對照，電泳結(jié)果證明有特異蛋白表達，分子量分別為43KD，與 預期的相符。五、 木糖異構(gòu)酶酶活性的分析取5ml誘導表達后的菌液離心收集細胞，用蒸餾水洗滌一次，然后懸浮在 50(^1酵母裂解緩沖液中，加入0.5g的酸洗玻璃珠，蝸旋振蕩器振蕩30s，冰上放置30s，重復4次。離心得上清液，即為粗酶液。木糖異構(gòu)酶的活性以轉(zhuǎn)化果糖為葡萄糖的能力表示之。具體方法為將酶活反應液1000)^1(0.1mol/LpH7.0的HEPES緩沖液，400mmol/L果糖，10mmol/L MnCl2， 100|ul 粗酶液)在80。C保溫處理10min，加入0.3ml 50% (v/v)的三氯乙酸以終止反 應。所產(chǎn)生的葡萄糖通過葡萄糖氧化酶試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司提 供)進行定量。酶活單位在8(TC， pH7.0的條件下，每分鐘催化l(amol底物(果糖)轉(zhuǎn) 化為產(chǎn)物(葡萄糖)所需的酶量為1單位。表1所示的測試分析結(jié)果表明，本發(fā)明所述的木糖異構(gòu)酶酶具有較好的活性。表l酵母基因工程菌木糖異構(gòu)酶活力菌株Sc/p YES2Sc/p YES2-xylA活力(U/ml粗酶液)046.5實施例2基因工程酵母菌以木糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)乙醇1、 挑出單菌落接入15ml含有2%葡萄糖的SC-U0.17% (m/v) Yeast nitrogen base, (NH4)2SO40.5% (m/v) ， 0.01% (m/v)必需氨基酸(His, Leu， Trp，不含尿嘧啶U)培養(yǎng)基中，30°C、 220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)過 夜，在可使木糖異構(gòu)酶基因表達的條件下培養(yǎng)該重組菌。2、 測定過夜培養(yǎng)物的OD6()()，計算接入50ml培養(yǎng)基使其OD6QQ為0.4的過 夜培養(yǎng)物的用量，于2000rpm， 4。C離心5min，棄上清。3、 沉淀重懸于2ml誘導培養(yǎng)基(含2%半乳糖的SC-U培養(yǎng)基)并接入50mlSC-U培養(yǎng)基中，30°C、 220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)8 12小時。4、 離心收集菌體后，用滅菌生理鹽水洗滌細胞1次，沉淀重懸于10mL木 糖發(fā)酵培養(yǎng)基含2.5% (m/v)木糖的SC-U培養(yǎng)基并接入50mlSC-U木糖 培養(yǎng)基中，30°C、 90rpm/min條件下限氧振蕩培養(yǎng)72小時。5、 取lmL菌液，于12000rpm， 4。C離心2min，上清用于氣相色譜分析產(chǎn) 酒精量。表2所示的試驗結(jié)果表明，本發(fā)明所述的木糖異構(gòu)酶可以獲得較好的乙醇產(chǎn)出率。表2酵母基因工程菌利用木糖產(chǎn)乙醇量菌株Sc/pYES2Sc/p YES2-xylA乙醇(g/L)<0.53.權(quán)利要求
1. 一種褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶的提取方法，其特征在于所述的木糖異構(gòu)酶的基因選自褐色喜熱裂孢菌，提取方法包含以下步驟首先設計正向引物5’-ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3’，反向引物5’-ATAGGATCCTTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3’，從基因組里經(jīng)聚合酶鏈式反應獲得褐色喜熱裂孢菌基因，然后對前述反應產(chǎn)物進行初步純化，并利用EcoRI和HindIII對反應產(chǎn)物進行雙酶切，再與同樣經(jīng)雙酶切的穿梭載體pYES2質(zhì)粒連接，獲得表達質(zhì)粒pYES2-xylA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法提取的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶，其特征在于 所述木糖異構(gòu)酶的分子量為43KD，酶的最適反應溫度為80-85'C，酶的最適 反應pH是7.0。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法提取的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中 的活性表達方法，其特征在于所述活性表達方法包含以下步驟制備釀酒酵母菌Sc的感受態(tài)細胞，然后用重組質(zhì)粒pYES2-xylA電轉(zhuǎn)化 Sc的感受態(tài)細胞，得重組釀酒酵母菌Sc/p YES2-xylA，在可使木糖異構(gòu)酶基因 表達的條件下培養(yǎng)該重組菌，把細胞破碎后所得粗酶液用果糖做底物，在酶的 合適條件下反應進行酶活力測定。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法提取的褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母發(fā) 酵產(chǎn)物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以褐色喜熱裂孢菌為來源提取木糖異構(gòu)酶的方法及褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中的活性表達與應用。所述褐色喜熱裂孢菌木糖異構(gòu)酶的分子量為43KD，酶的最適反應溫度為80~85℃，酶的最適反應pH是7.0。該酶能夠在正常的生化反應條件下將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，該酶基因可以重組到釀酒酵母菌中，在釀酒酵母中實現(xiàn)活性表達，并可利用木糖或其它碳源如木質(zhì)纖維素水解物產(chǎn)生包括乙醇在內(nèi)的各種發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明利用基因工程手段，拓展乙醇轉(zhuǎn)化的底物，對于木質(zhì)纖維素資源全利用具有重要的理論意義和應用價值。
文檔編號C12P1/02GK101260394SQ20081007356
公開日2008年9月10日 申請日期2008年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月5日
發(fā)明者靚 孫, 楊登峰, 王青艷, 肖代俊, 雁 陸, 黃志民, 黃日波, 黎貞崇 申請人:廣西科學院