一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置與方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置與方法，其中生物反應(yīng)器細(xì)胞特性篩選方法為根據(jù)細(xì)胞在不同的細(xì)胞狀態(tài)條件下代謝率不同，在細(xì)胞特性篩選過程中通過加入物理、化學(xué)、生物的因素造成細(xì)胞的比生長速率不同，使比生長速率快的為所篩選細(xì)胞。本發(fā)明可實現(xiàn)在篩選過程中、培養(yǎng)過程中的自動化管理，對細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)特性篩選（例如G418加壓或持續(xù)的降血清），且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細(xì)胞，此外反應(yīng)器篩選過程大大縮短了篩選時間、減少工作量、降低污染率，而且能很好的去掉人為因素，為工業(yè)應(yīng)用提供有保證的細(xì)胞株。
【專利說明】一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域的裝置和方法，具體是一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置與方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，絕大部分生物工程用特性細(xì)胞株(例如無血清、單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株)的細(xì)胞篩選均為傳統(tǒng)方式，用孔板或者轉(zhuǎn)瓶根據(jù)其需要篩選的特性(例如單克隆的穩(wěn)定細(xì)胞株，無血清細(xì)胞株)進(jìn)行篩選，也可以達(dá)到其基本需要，但其缺點在于容易造成假陽性、程序繁冗、污染率高、耗時長，且工作量大，人為因素較大。另外，傳統(tǒng)方式所提供的細(xì)胞體外生長環(huán)境不容易控制，通常隨培養(yǎng)進(jìn)程而變化，且傳統(tǒng)方式難于做到連續(xù)等。
[0003]經(jīng)過對現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，在Chun Chen, Xiang-Dong Fang, Jiang Zhu,Xiang-Fu ffu, et al ((The Gene Expression of Coagulation Factor VIII in MammalianCell Lines)) Thromb Res.1999 Jul 15; 95 (2):105-15.中，F(xiàn)VIII 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選是轉(zhuǎn)染后用G418進(jìn)行陽性篩選，稀釋法96孔板不斷加入G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。但是該過程中，操作繁瑣，容易造成假陽性、程序繁冗、污染率高、耗時長，且工作量大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]生物反應(yīng)器大規(guī)模細(xì)胞特性的篩選能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中用孔板或者轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行篩選的缺點，因此本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種連續(xù)的、簡便、反應(yīng)器規(guī)模的細(xì)胞篩選的裝置和方法，使得在篩選過程中，可實現(xiàn)培養(yǎng)過程中的自動化管理，對細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)特性篩選(例如G418加壓或持續(xù)的降血清)，且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細(xì)胞，此外反應(yīng)器篩選過程大大縮短了篩選時間、減少工作量、降低污染率，而且能很好的去掉人為因素，為工業(yè)應(yīng)用提供有保證的細(xì)胞株。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明涉及的生物反應(yīng)器細(xì)胞特性篩選裝置，包括儲液裝置、細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置、多個液體無菌推動裝置(如蠕動泵)、細(xì)胞截留裝置(如biosep，細(xì)胞沉降裝置，中空纖維裝置等)、多個可控速液體流動管道(如硅膠管等)、上清收集裝置、截留細(xì)胞收集裝置；其連接方式為，儲液裝置通過一第一可控速液體流動管道與細(xì)胞培養(yǎng)裝置相連，一第一液體無菌推動裝置設(shè)置在儲液裝置與細(xì)胞培養(yǎng)裝置之間；
細(xì)胞培養(yǎng)裝置一端通過一第二可控速液體流動管道與細(xì)胞截留裝置截留前部分相連，細(xì)胞培養(yǎng)裝置另一端通過一第三可控速液體流動管道與細(xì)胞截留裝置的截流后部分相連，一第二液體無菌推動裝置設(shè)置在細(xì)胞培養(yǎng)裝置與截流后的細(xì)胞截留裝置之間；
細(xì)胞培養(yǎng)裝置與細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置通過信號轉(zhuǎn)化輸出線相連；
細(xì)胞截留裝置的截留前一端與上清收集裝置相連，一第三液體無菌推動裝置設(shè)置在上清收集裝置與細(xì)胞截留裝置的截留前一端之間，細(xì)胞截留裝置的截留后另一端與截留細(xì)胞收集裝置相連，一第四液體無菌推動裝置設(shè)置在截留細(xì)胞收集裝置與細(xì)胞截留裝置的截留后另一端之間。
[0006]所述儲液裝置為有至少三孔的可滅菌培養(yǎng)液儲存裝置，其中一孔可通過一第四可控速液體流動管道使無菌過濾后的培養(yǎng)液進(jìn)入儲液裝置中，另一孔可通過所述第一可控速液體流動管道將無菌過濾后的培養(yǎng)液推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0007]所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置為至少有培養(yǎng)液入口、培養(yǎng)液出口、細(xì)胞回流入口、氣體(如空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣)入口、細(xì)胞取樣口、堿入口、細(xì)胞接種口、探頭插入口(如PH、D0、溫度)，可高溫滅菌、密閉無菌進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。該裝置可通過細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置控制細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種參數(shù)(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)。
[0008]所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置為至少可保存和調(diào)控各種培養(yǎng)過程中的物理化學(xué)參數(shù)(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)的控制器，該裝置可控制細(xì)胞培養(yǎng)過程的各種參數(shù)使得細(xì)胞最優(yōu)化的生長或獲得目的產(chǎn)物。在本發(fā)明的一些具體實施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置還可以控制一部分液體無菌推動裝置的開、關(guān)和流速。
[0009]所述可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養(yǎng)液流速。
[0010]所述液體無菌推動裝置(如蠕動泵)為可無菌地推動管道內(nèi)的液體流動的裝置，如蠕動泵。所述液體無菌推動裝置的開、關(guān)和流速控制可由所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置控制，或者人工控制，或部分液體無菌推動裝置由所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置控制，而另一部分人工控制。
[0011]所述細(xì)胞截留裝置(如biosep，細(xì)胞沉降裝置，中空纖維裝置等)至少設(shè)有細(xì)胞混合液入口、細(xì)胞上 清液出口、細(xì)胞回流出口、截留出口；其中，所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞混合液入口通過所述第二可控速液體流動管道與所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置連接，用于將所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞混合液送入所述細(xì)胞截留裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞上清液出口通過所述第三液體無菌推動裝置與所述上清收集裝置連接，用于將細(xì)胞上清液推入到上清收集裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞回流出口通過所述第三可控速液體流動管道和所述第二液體無菌推動裝置與所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置相連接，用于將截留下來的細(xì)胞通過細(xì)胞回流出口推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的截留出口通過所述第四液體無菌推動裝置與所述截留細(xì)胞收集裝置連接，用于將截留下來的細(xì)胞推入截留細(xì)胞收集裝置中；其中，截留下來的細(xì)胞可通過細(xì)胞回流出口回流進(jìn)入所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置中，或者通過截留出口進(jìn)入所述截留細(xì)胞收集裝置中，具體地，截留下來的細(xì)胞需進(jìn)入上述的哪一個裝置是由所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置或人為根據(jù)預(yù)先設(shè)定來調(diào)控相關(guān)的液體無菌推動裝置實現(xiàn)的。
[0012]所述上清收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第三液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將截留后的細(xì)胞上清液送入該上清收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0013]所述截留細(xì)胞收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將截留后的細(xì)胞懸液送入該截留細(xì)胞收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0014]本發(fā)明提供的生物反應(yīng)器細(xì)胞特性篩選的方法，其原理為一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞狀態(tài)條件下代謝率(如比生長速率、比葡萄糖消耗率、比細(xì)胞得率等)不同，在細(xì)胞特性篩選(穩(wěn)定細(xì)胞株、無血清細(xì)胞株)過程中通過加入物理、化學(xué)、生物的因素(例如G418、低、無血清培養(yǎng)液等，包括上述舉例但不限于此)、造成細(xì)胞的比生長速率不同，使得比生長速率快的細(xì)胞為所篩選細(xì)胞。而在細(xì)胞培養(yǎng)裝置中細(xì)胞是均勻的分布，細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞通過細(xì)胞截留裝置后，啟動細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將生長快和慢的細(xì)胞以反應(yīng)器中該條件下的比例均勻的推入截留細(xì)胞收集裝置中，由于其比生長速率不同造成細(xì)胞培養(yǎng)裝置中生長快、慢的細(xì)胞比例發(fā)生變化，比生長速率大的(即生長快)的細(xì)胞與比生長速率小的(即生長慢)比例變大，而細(xì)胞截留裝置是連續(xù)的啟動，使得最終細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞均為比細(xì)胞生長速率大的細(xì)胞，從而篩選到生長速率大的細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明的裝置工作時，儲液裝置內(nèi)的培養(yǎng)液在相應(yīng)液體無菌推動裝置(如蠕動泵)作用下，通過可控速液體流動管道(如硅膠管)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，而細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置控制細(xì)胞培養(yǎng)的各種參數(shù)(例如PH、D0、溫度等包括上述舉例但不限于此)以達(dá)到細(xì)胞生長的優(yōu)化條件，細(xì)胞在細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液或普通細(xì)胞培養(yǎng)液中此優(yōu)化條件下生長。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，細(xì)胞密度達(dá)到一定數(shù)量級時，進(jìn)行細(xì)胞特性篩選。當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞特性篩選(如穩(wěn)定細(xì)胞株、無血清細(xì)胞株)時，加入物理、化學(xué)、生物等因素的細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液(例如G418、低、無血清培養(yǎng)液等，包括上述舉例但不限于此)，該細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液在相應(yīng)液體無菌推動裝置(如蠕動泵)作用下，通過可控速液體流動管道(如硅膠管)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，細(xì)胞在此培養(yǎng)液下生長。細(xì)胞培養(yǎng)裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)以設(shè)定的灌注速率進(jìn)行推動細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液至細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)將細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞混合液推至細(xì)胞截留裝置(如biosep，細(xì)胞沉降裝置，中空纖維裝置等)中。細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置通過連續(xù)灌注稱的設(shè)定重量調(diào)控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度，使得細(xì)胞培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)液總體積保持不變。細(xì)胞回流處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度由自行設(shè)定，不宜過大或過小(例如在細(xì)胞沉降截留裝置中，速度過大則回流細(xì)胞損傷過大，過小則截留效果不佳，較多細(xì)胞都進(jìn)入了上清中)。當(dāng)細(xì)胞密度高于設(shè)定的灌注細(xì)胞密度時，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置則啟動細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將截留的部分細(xì)胞推至截留細(xì)胞收集裝置中，當(dāng)細(xì)胞密度低于設(shè)定的灌注 細(xì)胞密度時，則關(guān)閉細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，使得細(xì)胞密度維持在設(shè)定密度位置不變。
[0016]本發(fā)明所提供的生物反應(yīng)器細(xì)胞特性篩選的方法的一具體實施步驟如下:
1.安裝、連接該發(fā)明的整套裝置且進(jìn)行高溫滅菌；
2.在無菌操作臺里面向儲液裝置里加入細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液或普通培養(yǎng)液，然后向細(xì)胞培養(yǎng)裝置里以(0.5-10X106cells/ml)細(xì)胞密度接種待篩選的細(xì)胞；
3.設(shè)定該反應(yīng)器的灌注、回流速度、截留細(xì)胞密度以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置的灌注重量；
4.待細(xì)胞密度達(dá)到(2-10X106cells/ml)數(shù)量級時，進(jìn)行細(xì)胞特性篩選；加入細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液，該細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液在相應(yīng)液體無菌推動裝置作用下，通過可控速液體流動管道進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，細(xì)胞在此細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液下生長；開啟細(xì)胞培養(yǎng)裝置處及細(xì)胞回流處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，以分別調(diào)節(jié)至設(shè)定灌注速度及設(shè)定回流速度。細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置通過連續(xù)灌注稱的設(shè)定重量調(diào)控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)速度，使得細(xì)胞培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)液總體積保持不變。當(dāng)細(xì)胞密度高于設(shè)定的灌注細(xì)胞密度時，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置則啟動細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，將截留的部分細(xì)胞推至細(xì)胞截留細(xì)胞收集裝置中，當(dāng)細(xì)胞密度低于設(shè)定的灌注細(xì)胞密度時，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置則關(guān)閉細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置(如蠕動泵)，使得細(xì)胞密度維持在設(shè)定密度位置不變；
5.每天取樣進(jìn)行陽性分析，待細(xì)胞培養(yǎng)裝置中絕大部分的細(xì)胞為預(yù)定的篩選細(xì)胞后則停止該連續(xù)篩選。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明的裝置與方法克服了傳統(tǒng)方法的諸多不利，提供了一種連續(xù)的、簡便、反應(yīng)器規(guī)模的細(xì)胞篩選的方法，使得在篩選過程中，可實現(xiàn)培養(yǎng)過程中的自動化管理，對細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)特性篩選(G418加壓或持續(xù)的降血清)，且在篩選的同時可獲得大量的目的蛋白或目的細(xì)胞，此外反應(yīng)器篩選過程大大縮短篩選時間、減少工作量、降低污染率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明裝置的一種實例結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明實施例中FVIII細(xì)胞篩選過程中，F(xiàn)VIII表達(dá)量曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 [0020]此處以G418的調(diào)節(jié)作用為例說明本發(fā)明的細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液調(diào)控細(xì)胞比生長速率的原理:例如，在細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選過程中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，部分為目的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去的細(xì)胞，部分為未能將目的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去的細(xì)胞，而在此時將G418加入該培養(yǎng)液中，無抗性基因的細(xì)胞在G418的作用下，逐漸開始死亡或者生長速率慢，而有抗性基因的則能適應(yīng)G418的存在下生長。隨著時間的推移，細(xì)胞會呈現(xiàn)出在一定濃度的G418的條件下細(xì)胞比生長速率存在快慢，此時通過在灌注培養(yǎng)過程中的截留作用，可將比生長速率快的保留，生長速率慢的則逐步被截留出。
[0021]請參見圖1所示，本發(fā)明的一個實施例提供的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特定篩選的裝置，包括儲液裝置1、細(xì)胞培養(yǎng)裝置4、細(xì)胞截留裝置(如biosep，細(xì)胞沉降裝置，中空纖維裝置等)5、上清收集裝置7、截留細(xì)胞收集裝置8、多個可控速液體流動管道(如硅膠管等)、多個液體無菌推動裝置(如蠕動泵)、細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11，其中，細(xì)胞截留裝置5至少有細(xì)胞混合液入口、細(xì)胞上清液出口、細(xì)胞回流出口、截留出口 ；其連接方式為，儲液裝置I通過一第一可控速液體流動管道2與細(xì)胞培養(yǎng)裝置4相連，一第一液體無菌推動裝置3設(shè)置在儲液裝置I與細(xì)胞培養(yǎng)裝置4之間；
細(xì)胞培養(yǎng)裝置4 一端通過一第二可控速液體流動管道12與細(xì)胞截留裝置5的細(xì)胞混合液入口相連，細(xì)胞培養(yǎng)裝置4另一端通過一第三可控速液體流動管道13與細(xì)胞截留裝置5的細(xì)胞回流出口相連，一第二液體無菌推動裝置10設(shè)置在細(xì)胞培養(yǎng)裝置4與細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞回流出口之間；
細(xì)胞培養(yǎng)裝置4與細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11通過信號轉(zhuǎn)化輸出線相連；
細(xì)胞截留裝置5的上清液出口與上清收集裝置7相連，一第三液體無菌推動裝置6設(shè)置在上清收集裝置7與細(xì)胞截留裝置5的上清液出口之間，細(xì)胞截留裝置5的截留出口與截留細(xì)胞收集裝置8相連，一第四液體無菌推動裝置9設(shè)置在截留細(xì)胞收集裝置8與細(xì)胞截留裝置5的截留出口之間。
[0022]儲液裝置I為至少有三孔的可滅菌培養(yǎng)液儲存裝置，其中一孔可通過一可控速液體流動管道(如硅膠管等)將無菌過濾后的培養(yǎng)液送入該儲液裝置I中，另一孔可通過第一可控速液體流動管道2將無菌過濾后的培養(yǎng)液推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置4中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0023]細(xì)胞培養(yǎng)裝置4為至少有培養(yǎng)液入口、培養(yǎng)液出口、細(xì)胞回流入口、氣體(如空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣)入口、細(xì)胞取樣口、堿入口、細(xì)胞接種口、探頭插入口(如PH、D0、溫度)的裝置，可高溫滅菌、密閉無菌進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。該裝置可通過細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11來控制細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種參數(shù)(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)。
[0024]細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11為至少可保存和調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種物理化學(xué)參數(shù)(如PH、D0、溫度、葡萄糖濃度等)的控制器，該裝置可控制細(xì)胞培養(yǎng)過程的各種參數(shù)使得細(xì)胞最優(yōu)化的生長或獲得 目的產(chǎn)物。具體地，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11可以為安裝有探頭組數(shù)據(jù)信號接口和在線監(jiān)控系統(tǒng)軟件的計算機(jī)。細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11還可以控制部分液體無菌推動裝置的開、關(guān)和流速。
[0025]可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養(yǎng)液流速的裝置，如硅膠管。
[0026]液體無菌推動裝置為可無菌地推動管道內(nèi)的液體流動的裝置，如蠕動泵。
[0027]細(xì)胞截留裝置(如biosep，細(xì)胞沉降裝置，中空纖維裝置等)5可將細(xì)胞混合液中的細(xì)胞進(jìn)行截留，得到的細(xì)胞上清液通過第三液體無菌推動裝置6 (如蠕動泵)將上清液推入到上清收集裝置7中，而截留下來的細(xì)胞通過細(xì)胞回流出口被第二液體無菌推動裝置(如蠕動泵)10推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置4中，或者通過細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11控制啟動截留出口處的第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)9將截留下來的細(xì)胞推入截留細(xì)胞收集裝置8中。
[0028]上清收集裝置7為至少有二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過第三液體無菌推動裝置(如蠕動泵)6將截留后的細(xì)胞上清液送入該上清收集裝置7中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0029]截留細(xì)胞收集裝置8為有至少二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過第四液體無菌推動裝置(如蠕動泵)9將截留后的細(xì)胞懸液進(jìn)入送入該截留細(xì)胞收集裝置8中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
[0030]
實施例
[0031]本實施例所用生物反應(yīng)器等儀器和CHO細(xì)胞等試劑均為市售。
[0032]本實施例通過以下方法進(jìn)行細(xì)胞特性篩選:
I)在生物反應(yīng)器上安裝PH電極、溶氧電極、溶二氧化碳電極、液位電極和溫度電極，并將該些電極連接至安裝有探頭組數(shù)據(jù)信號接口和自制在線監(jiān)控系統(tǒng)軟件的計算機(jī)(即細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11)上，設(shè)定溫度37° C，pH值7.1，溶氧濃度值45%，溶二氧化碳濃度5%，由加熱套控制溫度，電子可調(diào)節(jié)氣體流量閥控制C02，N2, O2和空氣四路進(jìn)氣，用鼓泡供給的方法控制溶氧濃度和溶二氧化碳濃度，連接有l(wèi)mol/L NaOH和lmol/L HCL的控速蠕動泵控制PH，根據(jù)液位電極的信號控制添加培養(yǎng)液到處理裝置的蠕動泵的速度，將培養(yǎng)液處理至設(shè)定值，以50轉(zhuǎn)的速度實現(xiàn)培養(yǎng)液的指標(biāo)均勻，此處所用培養(yǎng)液為適用CHO細(xì)胞的普通細(xì)胞培養(yǎng)液；
2)細(xì)胞的初級培養(yǎng)
將CHO細(xì)胞以0.5 X IO6個細(xì)胞/ml的密度向生物反應(yīng)器中接種，連續(xù)培養(yǎng)48小時，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期；
3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
本實例選用直接轉(zhuǎn)染法，向一轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合裝置(在本實例中為圓柱形裝置，有一個進(jìn)液口和一個出液口，用多孔橡膠塞密封，橡膠塞孔上插入可控速、可定時攪拌裝置)中加入帶有抗G418的neomycin的pGMAX-FVIII重組質(zhì)粒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染液，120rpm攪拌5min,然后加入轉(zhuǎn)染介導(dǎo)試劑PEI MAX, 120rpm攪拌5min，攪拌結(jié)束后靜置孵育lOmin。其中質(zhì)粒pGMAX-FVIII量為2 μ g/106個細(xì)胞，DNA:PEI=1: 2.5。通過蠕動泵將轉(zhuǎn)染復(fù)合物推入到細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時開啟灌注，該灌注培養(yǎng)液為帶G418的細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液(即在上述普通細(xì)胞培養(yǎng)液中加入G418)，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)各理化指標(biāo)值分別為溫度37° C，PH值7.0，溶氧濃度值40%，葡萄糖濃度1.5g/L，G418濃度控制在600ug/ml，通過細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11控制來自動調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)裝置4的進(jìn)液口和出液口的蠕動泵轉(zhuǎn)速，以維持設(shè)定的細(xì)胞生長環(huán)境，同時細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置11根據(jù)生物反應(yīng)器液位電極和溫度，PH，溶氧，溶二氧化碳電極的信號自動調(diào)節(jié)控制儲液裝置I中培養(yǎng)液添加的蠕動泵的轉(zhuǎn)速，以保證培養(yǎng)液的供應(yīng)；
4)細(xì)胞篩選
在灌注培養(yǎng)的過程中，待細(xì)胞活率穩(wěn)定后，每天在截留處截留掉20-40%的細(xì)胞，取樣測定FVIII的表達(dá)量，持續(xù)30天，最終細(xì)胞的表達(dá)量基本穩(wěn)定維持在4IU/ml左右，請參見圖2 ；
5)細(xì)胞收獲
待細(xì)胞的比生長速率、及FVIII的表達(dá)量基本穩(wěn)定后，即可進(jìn)行收獲該細(xì)胞，該細(xì)胞即為所篩選細(xì)胞。圖2還示出了本實施例中FVIII細(xì)胞篩選過程中，F(xiàn)VIII表達(dá)量曲線，圖2中可看到FVIII的表達(dá)量在20天以后基本穩(wěn)定維持在4IU/ml左右。
[0033]在本發(fā)明及上述實施例的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易預(yù)見到，本發(fā)明所列舉或例舉的各原料或其等同替換物、各加工方法或其等同替換物都能實現(xiàn)本發(fā)明，以及各原料和加工方法的參數(shù)上下限取值、區(qū)間值都能實現(xiàn)本發(fā)明，在此不一一列舉實施例。
【權(quán)利要求】
1.一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，包括儲液裝置、細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞截留裝置、上清收集裝置、截留細(xì)胞收集裝置、多個可控速液體流動管道、多個液體無菌推動裝置、細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置；其中， 儲液裝置通過一第一可控速液體流動管道與細(xì)胞培養(yǎng)裝置相連，一第一液體無菌推動裝置設(shè)置在儲液裝置與細(xì)胞培養(yǎng)裝置之間； 細(xì)胞培養(yǎng)裝置一端通過一第二可控速液體流動管道與細(xì)胞截留裝置截留前部分相連，細(xì)胞培養(yǎng)裝置另一端通過一第三可控速液體流動管道與細(xì)胞截留裝置的截流后部分相連，一第二液體無菌推動裝置設(shè)置在細(xì)胞培養(yǎng)裝置與細(xì)胞截留裝置的截流后部分之間； 細(xì)胞培養(yǎng)裝置與細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置通過信號轉(zhuǎn)化輸出線相連； 細(xì)胞截留裝置的截留前一端與上清收集裝置相連，一第三液體無菌推動裝置設(shè)置在上清收集裝置與細(xì)胞截留裝置的截留前一端之間，細(xì)胞截留裝置的截留后一端與截留細(xì)胞收集裝置相連，一第四液體無菌推動裝置設(shè)置在截留細(xì)胞收集裝置與細(xì)胞截留裝置的截留后一端之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述儲液裝置為有至少三孔的可滅菌培養(yǎng)液儲存裝置，其中一孔可通過一第四可控速液體流動管道使無菌過濾后的培養(yǎng)液進(jìn)入儲液裝置中，另一孔通過所述第一可控速液體流動管道將無菌過濾后的培養(yǎng)液推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，又一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置為至少有培養(yǎng)液入口、培養(yǎng)液出口、細(xì)胞回流入口、若干氣體入口、細(xì)胞取樣口、堿入口、細(xì)胞接種口、若干探頭插入口，可高溫滅菌、密閉無菌進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的裝置，該裝置能通過所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置控制細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種參數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置為至少可保存和設(shè)置各種培養(yǎng)過程中的物理化學(xué)參數(shù)的控制器，該裝置可控制細(xì)胞培養(yǎng)過程的各種參數(shù)使得細(xì)胞最優(yōu)化的生長或獲得目的產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述可控速液體流動管道為可通過滑動控制閥或夾子控制培養(yǎng)液流速的管道。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述液體無菌推動裝置為可無菌地推動管道內(nèi)的液體流動的裝置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述細(xì)胞截留裝置至少設(shè)有細(xì)胞混合液入口、細(xì)胞上清液出口、細(xì)胞回流出口、截留出口；其中，所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞混合液入口通過所述第二可控速液體流動管道與所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置連接，用于將所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞混合液送入所述細(xì)胞截留裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞上清液出口通過所述第三液體無菌推動裝置與所述上清收集裝置連接，用于將細(xì)胞上清液推入到上清收集裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞回流出口通過所述第三可控速液體流動管道和所述第二液體無菌推動裝置與所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置相連接，用于將截留下來的細(xì)胞通過細(xì)胞回流出口推入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中；所述細(xì)胞截留裝置的截留出口通過所述第四液體無菌推動裝置與所述截留細(xì)胞收集裝置連接，用于將截留下來的細(xì)胞推入截留細(xì)胞收集裝置中；其中，截留下來的細(xì)胞可通過細(xì)胞回流出口回流進(jìn)入所述細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置中，或者通過截留出口進(jìn)入所述截留細(xì)胞收集裝置中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述上清收集裝置為至少有二孔的可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第三液體無菌推動裝置將截留后的細(xì)胞上清液送入該上清收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的裝置，其特征在于，所述截留細(xì)胞收集裝置為有至少二孔可滅菌儲存裝置，其中一孔可通過所述第四液體無菌推動裝置將截留后的細(xì)胞懸液送入該截留細(xì)胞收集裝置中，另一孔通過空氣過濾裝置與外部環(huán)境相通。
10.一種用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的方法，其特征在于，根據(jù)細(xì)胞在不同的細(xì)胞狀態(tài)條件下代謝率不同，在細(xì)胞特性篩選過程中通過加入細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液造成細(xì)胞的比生長速率不同，使比生長速率快的為所篩選細(xì)胞；在細(xì)胞培養(yǎng)裝置中細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞通過細(xì)胞截留裝置后，通過液體無菌推動裝置將生長快和生長慢的細(xì)胞均勻的推入截留細(xì)胞收集裝置中，進(jìn)而由于細(xì)胞比生長速率不同造成細(xì)胞培養(yǎng)裝置中生長快和生長慢的細(xì)胞的比例發(fā)生變化，比生長速率大的細(xì)胞與比生長速率小的細(xì)胞的比例變大，細(xì)胞截留裝置連續(xù)啟動，使得最終細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞均為比細(xì)胞生長速率大的細(xì)胞，從而篩選到 生長速率大的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的方法，其特征在于，所述細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液為通過物理、化學(xué)、生物的因素對細(xì)胞生長速率進(jìn)行調(diào)控。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞特性篩選的方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，安裝、連接整套裝置并進(jìn)行高溫滅菌； 第二步，在無菌操作臺里面向儲液裝置里加入細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液或普通細(xì)胞培養(yǎng)液，然后向細(xì)胞培養(yǎng)裝置里接種待篩選的細(xì)胞； 第三步，設(shè)定生物反應(yīng)器的灌注、回流速度、截留細(xì)胞密度以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置的灌注重量; 第四步，待細(xì)胞密度達(dá)到(2-10X106 cells/ml)時，進(jìn)行細(xì)胞特性篩選；加入細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液，該細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液在相應(yīng)液體無菌推動裝置作用下，通過可控速液體流動管道進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，細(xì)胞在此細(xì)胞特性篩選培養(yǎng)液下生長；開啟細(xì)胞培養(yǎng)裝置處及細(xì)胞回流處設(shè)置的液體無菌推動裝置，以分別調(diào)節(jié)至設(shè)定灌注速度及設(shè)定回流速度；細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置通過連續(xù)灌注稱的設(shè)定重量調(diào)控上清收集裝置處的液體無菌推動裝置的速度，使得細(xì)胞培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)液總體積保持不變；當(dāng)細(xì)胞密度高于設(shè)定的灌注細(xì)胞密度時，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置則啟動細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置，以將截留的部分細(xì)胞推至截留細(xì)胞收集裝置中，當(dāng)細(xì)胞密度低于設(shè)定的灌注細(xì)胞密度時，細(xì)胞培養(yǎng)控制裝置則關(guān)閉細(xì)胞截留裝置處的液體無菌推動裝置，使得細(xì)胞密度維持在設(shè)定密度位置不變； 第五步，每天取樣進(jìn)行陽性分析，待細(xì)胞培養(yǎng)裝置中絕大部分的細(xì)胞為預(yù)定的篩選細(xì)胞后則停止連續(xù)篩選。
【文檔編號】C12M1/36GK103981093SQ201410167289
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】齊念民, 鄭琛, 傅強(qiáng), 莊超 申請人:上海泰因生物技術(shù)有限公司