一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，包括以下步驟：茶葉粉或茶粕粉接入菌種分步固態(tài)發(fā)酵、恒溫水浸提、離心；超濾膜分離、濃縮、乙醇沉淀、離心、冷凍干燥得到茶多糖。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的水提法區(qū)別在于本發(fā)明利用微生物生長繁殖中產(chǎn)生的多種酶系（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶等）將茶葉細(xì)胞中多種大分子物質(zhì)水解，有利于茶多糖的浸出，制備條件溫和、工藝簡單、綠色環(huán)保，茶多糖的得率大、純度高、活性強(qiáng)。本發(fā)明以低檔茶、粗老茶、茶粕為原料，實(shí)現(xiàn)了資源的高值化利用。本發(fā)明制得的茶多糖具有抗氧化、抗輻射、降血糖的功能活性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，屬于食品營養(yǎng)活性物質(zhì)加工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]茶葉為山茶科茶屬植物，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，其活性物質(zhì)茶氨酸、多酚類和黃酮類等的提取及保健功能已進(jìn)行了深入研究，但對(duì)于茶多糖的研究卻缺乏應(yīng)有的重視。茶多糖具有降血糖、降血脂、抗凝血、預(yù)防心腦血管疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗輻射等功能。我國民間一直流傳泡飲粗老茶治療糖尿病的說法。茶多糖存在于茶葉細(xì)胞內(nèi)，由于茶葉細(xì)胞的表面被脂質(zhì)包圍，通常使用脫脂溶劑如甲醇、乙醇或乙醇與乙醚混合液等先將茶葉的脂質(zhì)除去，再用提取溶劑稀酸、稀堿或水提取茶多糖。但是，大量研究表明酸性或堿性條件下提取的茶多糖活性較低，所以提取茶多糖最好的溶劑是水。
[0003]茶多糖是一種白色、略帶綠茶香氣的粉末狀固體。該產(chǎn)品是由單糖和蛋白組成的蛋白復(fù)合多糖，不同的提取方法其單糖組成不同，通常由阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、果糖、鼠李糖和半乳糖醛酸中的幾種組成。茶多糖的降血糖效果非常顯著，其降血糖機(jī)理為調(diào)節(jié)糖代謝酶的活性和清除自由基作用，對(duì)糖代謝的影響與胰島素類似。高純度的茶多糖可以制成飲片或膠囊劑直接供糖尿病患者長期服用；也可加到燕麥粥等糖尿病人專用食品中，用于康復(fù)治療產(chǎn)品及日常營養(yǎng)補(bǔ)充品。
[0004]目前，茶多糖的提取工藝多采用水提法，在提取之前要用有機(jī)溶劑脫脂，不僅增加了生產(chǎn)成本，還易污染環(huán)境。此外，水提法的提取率低，雖然有的工藝增加了超聲波或微波輔助浸提，但提取效果還是不理想。因此，需要一種操作簡單、成本低、提取率高、環(huán)境友好、茶多糖產(chǎn)品活性高，且工業(yè)化生產(chǎn)前景和市場(chǎng)前景廣闊的提取茶多糖的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于為解決上述技術(shù)中存在的技術(shù)難題，提供一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法。本發(fā)明利用微生物生長繁殖中產(chǎn)生的多種酶系(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶等)將茶葉細(xì)胞中多種大分子物質(zhì)水解，有利于茶多糖的浸出，制備條件溫和、工藝簡單、綠色環(huán)保，茶多糖的提取率大、純度高、活性強(qiáng)。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，其步驟包括:
一、發(fā)酵和提取:茶葉粉或茶柏粉加入營養(yǎng)鹽溶液，滅菌，接入菌種分步固態(tài)發(fā)酵，加入水恒溫水浸提，離心，保留上清液；
二、分離純化:上清液經(jīng)二級(jí)超濾膜分離，真空濃縮，乙醇沉淀，離心，沉淀經(jīng)冷凍干燥得到茶多糖。
[0007]優(yōu)選地，步驟一所述的茶葉粉或茶柏粉為低檔茶、粗老茶、提取茶油后的茶柏粉碎過200目篩下物，營養(yǎng)鹽溶液(IL體積)所含的成分包括0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖，茶葉粉或茶柏粉與營養(yǎng)鹽溶液的質(zhì)量與體積比為1:1.0-2.0 (g/ml)，滅菌的條件為121°C滅菌15min，接入的第一種菌種為菌齡為60_84h的米曲霉或菌齡為30-40h的啤酒酵母，茶葉粉或茶柏粉與菌種的接入體積比為1:0.2-0.4(g/ml，108個(gè)菌種/ml)，第一步發(fā)酵條件為30°C下靜置發(fā)酵36h，接入的第二種菌種為菌齡為16-24h的枯草芽孢桿菌或菌齡為9-15h的乳酸菌，茶葉粉或茶柏粉與菌種的接入體積比為1:0.1-0.2(g/ml, 108個(gè)菌種/ml)，第二步發(fā)酵條件為40°C下靜置發(fā)酵42h，加入水的質(zhì)量是茶葉粉或茶柏粉的質(zhì)量的4.5倍，恒溫水浸提條件為45-55°C恒溫水浴中浸提3-6h，離心條件為6000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min。
[0008]優(yōu)選地，步驟二所述的微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，其特征在于:步驟(2)所述的一級(jí)超濾膜分離條件為截留分子量為IOOkDa的聚砜中空纖維超濾膜，以0.2-0.3MPa壓力，25°C下超濾，二級(jí)超濾膜分離條件為截留分子量為40kDa的聚砜中空纖維超濾膜，以0.5-0.6MPa壓力，25°C下超濾，真空濃縮條件為真空度0.1MPa，60°C恒溫水浴中濃縮，加入4倍于濃縮液體積的無水乙醇，離心條件為6500r/min離心25min，冷凍干燥條件為_55°C、真空度0.1MPa，干燥24h。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:根據(jù)本發(fā)明，能夠提供提取率大，純度高，具有清除自由基、降血糖功能活性的茶多糖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]采用蒽酮-硫酸法測(cè)定茶多糖中多糖含量；采用微量凱氏定氮法測(cè)定茶多糖的蛋白含量。
[0011]實(shí)施例1
低檔綠茶粉碎過200目篩，取篩下物作為原料，以1:1.25 (g/ml)的比例向低檔綠茶粉中加入營養(yǎng)鹽溶液(IL體積含有0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C滅菌15min,以低檔綠茶粉:米曲霉(108個(gè)米曲霉/ml)=l:0.3 (g/ml)的比例接入菌齡為72h的米曲霉，在30°C下進(jìn)行第一步靜置發(fā)酵36h，發(fā)酵結(jié)束后，以低檔綠茶粉:乳酸菌(108個(gè)乳酸菌/ml)=1:0.2 (g/ml)的比例接入菌齡為12h的乳酸菌，在40°C下進(jìn)行第二步靜置發(fā)酵42h，發(fā)酵結(jié)束后，加入4.5倍于低檔綠茶粉的水，在48°C恒溫水浴中浸提4.5h,6000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min,保留上清液；上清液經(jīng)截留分子量為IOOkDa的聚砜中空纖維超濾膜，在0.2MPa壓力，25°C下進(jìn)行一級(jí)超濾處理，保留透過液，透過液經(jīng)截留分子量為40kDa的聚砜中空纖維超濾膜，在0.5MPa壓力，25°C下進(jìn)行二級(jí)超濾處理，保留濃縮液1，濃縮液I在真空度0.lMPa，60°C恒溫水浴中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2，加入4倍于濃縮液2體積的無水乙醇，冰箱中靜置12h，6500r/min離心25min，沉淀在真空度
0.1MPa, -55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率為4.51%，純度為72.54%，蛋白含量為2.15% ;茶多糖的中性單糖約占87.6%，由阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成，己糖醛酸約占4.3%，戊糖約占14.6%，氨基糖約占0.8% ； 10mg/ml的茶多糖對(duì)DPPH自由基清除率為35.48%，對(duì)羥自由基的清除率為27.92%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為67.88% ；10mg/ml的茶多糖對(duì)葡萄糖激酶和己糖激酶的相對(duì)活性分別提高了 189.34%和194.23% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg體重茶多糖21d后，血糖下降78%，肝糖原大量增加。
[0012]實(shí)施例2粗老綠茶粉碎過200目篩，取篩下物作為原料，以1:1.50 (g/ml)的比例向粗老綠茶粉中加入營養(yǎng)鹽溶液(IL體積含有0.52%的(NH4)2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C滅菌15min，以粗老綠茶粉:啤酒酵母(108個(gè)啤酒酵母/ml) =1:0.4 (g/ml)的比例接入菌齡為36h的啤酒酵母，在30°C下進(jìn)行第一步靜置發(fā)酵36h，發(fā)酵結(jié)束后，以粗老綠茶粉:枯草芽孢桿菌(108個(gè)枯草芽孢桿菌/ml)=1:0.1 (g/ml)的比例接入菌齡為24h的枯草芽孢桿菌，在40°C下進(jìn)行第二步靜置發(fā)酵42h，發(fā)酵結(jié)束后，加入4.5倍于粗老綠茶粉的水，在55?恒溫水浴中浸提6h,6000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min,保留上清液；上清液經(jīng)截留分子量為IOOkDa的聚砜中空纖維超濾膜，在0.3MPa壓力，25°C下進(jìn)行一級(jí)超濾處理，保留透過液，透過液經(jīng)截留分子量為40kDa的聚砜中空纖維超濾膜，在0.6MPa壓力，25°C下進(jìn)行二級(jí)超濾處理，保留濃縮液1，濃縮液I在真空度0.lMPa，60°C恒溫水浴中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2，加入4倍于濃縮液2體積的無水乙醇，冰箱中靜置12h，6500r/min離心25min，沉淀在真空度0.1MPa，_55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率為5.25%，純度為78.66%，蛋白含量為2.37% ;茶多糖的中性單糖約占89.3%，由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖組成，己糖醛酸約占5.2%，戊糖約占12.5%，氨基糖約占0.9% ；10mg/ml的茶多糖對(duì)DPPH自由基清除率為37.94%，對(duì)羥自由基的清除率為29.26%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為79.01% ；10mg/ml的茶多糖對(duì)葡萄糖激酶和己糖激酶的相對(duì)活性分別提高了 192.03%和205.64% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg體重茶多糖21d后，血糖下降83%，肝糖原大量增加。
[0013]實(shí)施例3
茶柏粉碎過200目篩，取篩下物作為原料，以1:1.80 (g/ml)的比例向茶柏粉中加入營養(yǎng)鹽溶液(IL體積含有0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C滅菌15min，以茶柏粉:米曲霉(108個(gè)米曲霉/ml) =1:0.2 (g/ml)的比例接入菌齡為84h的米曲霉，在30°C下進(jìn)行第一步靜置發(fā)酵36h，發(fā)酵結(jié)束后，以茶柏粉:乳酸菌(108個(gè)乳酸菌/ml) =1:0.1 (g/ml)的比例接入菌齡為15h的乳酸菌，在40°C下進(jìn)行第二步靜置發(fā)酵42h，發(fā)酵結(jié)束后，加入4.5倍于茶柏粉的水，在45°C恒溫水浴中浸提3h，6000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min，保留上清液；上清液經(jīng)截留分子量為IOOkDa的聚砜中空纖維超濾膜，在
0.3MPa壓力，25°C下進(jìn)行一級(jí)超濾處理，保留透過液，透過液經(jīng)截留分子量為40kDa的聚砜中空纖維超濾膜，在0.6MPa壓力，25 °C下進(jìn)行二級(jí)超濾處理，保留濃縮液1，濃縮液I在真空度0.1MPa, 60°C恒溫水浴中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2，加入4倍于濃縮液2體積的無水乙醇，冰箱中靜置12h，6500r/min離心25min，沉淀在真空度0.1MPa, -55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率為5.06%，純度為71.13%，蛋白含量為2.42% ;茶多糖的中性單糖約占84.5%，由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖組成，己糖醛酸約占4.6%，戊糖約占13.4%，氨基糖約占0.7% ； 10mg/ml的茶多糖對(duì)DPPH自由基清除率為36.03%,對(duì)羥自由基的清除率為24.15%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為70.23% ；10mg/ml的茶多糖對(duì)葡萄糖激酶和己糖激酶的相對(duì)活性分別提高了 190.95%和200.37% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg體重茶多糖21d后，血糖下降80%，肝糖原大量增加。
[0014]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，包括以下步驟: (1)茶葉粉或茶柏粉加入營養(yǎng)鹽溶液，滅菌，接入菌種分步固態(tài)發(fā)酵，加入水恒溫水浸提，離心； (2)二級(jí)超濾膜分離，真空濃縮，乙醇沉淀，離心，冷凍干燥得到茶多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，其特征在于:步驟(I)所述的茶葉粉或茶柏粉為低檔茶、粗老茶、提取茶油后的茶柏粉碎過200目篩下物，營養(yǎng)鹽溶液(IL體積)所含的成分包括0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖，茶葉粉或茶柏粉與營養(yǎng)鹽溶液的質(zhì)量與體積比為1:1.0-2.0 (g/ml)，滅菌的條件為121°C滅菌15min，接入的第一種菌種為菌齡為60_84h的米曲霉或菌齡為30_40h的啤酒酵母，茶葉粉或茶柏粉與菌種的接入體積比為1:0.2-0.4(g/ml, 108個(gè)菌種/ml)，第一步發(fā)酵條件為30°C下靜置發(fā)酵36h，接入的第二種菌種為菌齡為16-24h的枯草芽孢桿菌或菌齡為9-15h的乳酸菌，茶葉粉或茶柏粉與菌種的接入體積比為1:0.1-0.2 (g/ml, 108個(gè)菌種/ml)，第二步發(fā)酵條件為40°C下靜置發(fā)酵42h，加入水的質(zhì)量是茶葉粉或茶柏粉的質(zhì)量的4.5倍，恒溫水浸提條件為45-55°C恒溫水浴中浸提3-6h，離心條件為6000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分步固態(tài)發(fā)酵制備茶多糖的方法，其特征在于:步驟(2)所述的一級(jí)超濾膜分離條件為截留分子量為IOOkDa的聚砜中空纖維超濾膜，以.0.2-0.3MPa壓力，25°C下超濾，二級(jí)超濾膜分離條件為截留分子量為40kDa的聚砜中空纖維超濾膜，以0.5-0.6MPa壓力，25°C下超濾，真空濃縮條件為真空度0.1MPa，60°C恒溫水浴中濃縮，加入4倍于濃縮液體積的無水乙醇，離心條件為6500r/min離心25min，冷凍干燥條件為_55°C、真空度0.1MPa，干燥24h。
【文檔編號(hào)】C12R1/69GK103865966SQ201410138882
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】齊宏濤 申請(qǐng)人:青島博之源生物技術(shù)有限公司