一種雙段控溫并流加吐溫60提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，具體涉及一種雙段控溫并流加吐溫60來提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭多糖是一種類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)微生物胞外多糖，是葡萄糖以α-1，4_糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6_糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而成高分子聚合物。普魯蘭多糖已作為乳化劑、懸浮劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑、成膜劑和潤滑劑等廣泛應(yīng)用于食品、制藥、石油、化工等多個(gè)領(lǐng)域。其將是今后新型發(fā)酵工程的一個(gè)重要發(fā)展方向，越來越受到國內(nèi)企業(yè)的重視。
[0003]表面活性劑，是指加入少量能使其溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質(zhì)。具有固定的親水親油基團(tuán)，在溶液的表面能定向排列。吐溫60是一種常見常用的非離子型表面活性劑，其可以改善細(xì)胞膜通透性。
[0004]目前文獻(xiàn)當(dāng)中關(guān)于普魯蘭多糖產(chǎn)量提高主要是通過菌種誘變、培養(yǎng)基成分優(yōu)化，往往效果不太明顯，發(fā)酵周期長，且底物的轉(zhuǎn)化率不高，導(dǎo)致普魯蘭多糖成本居高不下。申請?zhí)枮?01210594876.4的中國發(fā)明專利《大量生產(chǎn)普魯蘭多糖的誘變菌株及其培養(yǎng)方法》，公開了一株產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉CGMCC N0.7055，并公開了利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，以及發(fā)酵培養(yǎng)基組成。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)BCSffGHPLlOl在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖產(chǎn)量為96g/L，較原始菌株68 ±5.2g/L的產(chǎn)量，提高了 41.2%，發(fā)酵條件為28°0，200±20印111下培養(yǎng)3(1。但仍存在發(fā)酵周期較長，且底物轉(zhuǎn)化率較低，底物利用率不高的問題，導(dǎo)致普魯蘭多糖成本較高，不利于大批量、規(guī)?；a(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了縮短普魯蘭多糖發(fā)酵周期，提高底物轉(zhuǎn)化率，有針對性的提高普魯蘭多糖產(chǎn)量，本發(fā)明提供了一種雙段控溫并流加吐溫60來提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，不僅操作方便，而且在提高產(chǎn)量的同時(shí)也減少了色素的產(chǎn)生。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0007]一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0008]I)種子培養(yǎng)
[0009]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28_32h。
[0010]所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化鈉0.25，磷酸氫二鉀0.2，硫酸銨0.1，硫酸鎂0.04，硫酸亞鐵0.05，蒸餾水定容至10mL后用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，121°C滅菌20分鐘。
[0011]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0012]5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)菌體生長處于適應(yīng)期(發(fā)酵液OD62(i< 0.5)時(shí)，控制溫度32°C，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期初期(發(fā)酵液OD 620^ 0.5)時(shí)，控制溫度至28°C，并流加發(fā)酵液體積0.08% -0.12%的吐溫60，縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵時(shí)間為 58-63ho
[0013]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氫二鉀7，硫酸鎂0.4，氯化鈉3，硫酸亞鐵0.05，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，按0.1%。量添加泡敵(植物油)，121°C滅菌20分鐘。
[0014]3)普魯蘭多糖的分離
[0015]發(fā)酵液過濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。
[0016]所述出芽短梗霉菌株優(yōu)選使用專利CN103060204B公開的一株保藏編號為CGMCCN0.7055的出芽短梗霉。
[0017]有益效果:
[0018]本發(fā)明針對出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖過程中存在周期長、底物轉(zhuǎn)化率低的缺陷，進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論為在菌體處于適應(yīng)期時(shí)，菌體最適生長溫度為32°C，菌體處于對數(shù)期時(shí)溫度控制在28°C更有利于次級代謝產(chǎn)物即普魯蘭多糖的積累，并流加一定量吐溫60可以促進(jìn)菌體細(xì)胞膜的通透性，使之產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物即普魯蘭多糖能夠及時(shí)排到細(xì)胞膜外，為后續(xù)普魯蘭多糖的大量積累提供了保證。本發(fā)明根據(jù)菌體在不同生長周期最適生長溫度不同以及菌體在次級代謝產(chǎn)物合成時(shí)流加適量吐溫60來提高普魯蘭多糖產(chǎn)量，操作便捷，效果明顯，較大地縮短了發(fā)酵周期，提高了底物的轉(zhuǎn)化率，降低了普魯蘭多糖的成本。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]實(shí)施例1:
[0021]以發(fā)酵過程不流加吐溫60作為對照。
[0022](I)種子培養(yǎng)
[0023]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28h。
[0024](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0025]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)菌體生長處于穩(wěn)定期前期時(shí)(OD62tl
<0.5)溫度32°C，轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期前期時(shí)(OD62CI> 0.5)，溫度設(shè)定為28 °C。
[0026](3)普魯蘭多糖的分離
[0027]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品65.5g/L，發(fā)酵周期為72h。
[0028]實(shí)施例2
[0029](I)種子培養(yǎng)
[0030]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28h。
[0031](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0032]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)菌體生長處于穩(wěn)定期前期時(shí)(OD62tl
<0.5)溫度32°C，轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期前期時(shí)(OD62CI> 0.5)，溫度設(shè)定為28°C并流加0.08%的吐溫60，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物即普魯蘭多糖的積累。
[0033](3)普魯蘭多糖的分離
[0034]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品74.9g/L。發(fā)酵周期為61h，與未添加吐溫60發(fā)酵周期需要72h相比，縮短了 llh，普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 14.35%。
[0035]實(shí)施例3
[0036](I)種子培養(yǎng)
[0037]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為30h。
[0038](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0039]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)菌體生長處于穩(wěn)定期前期時(shí)(OD62tl
<0.5)溫度32°C，轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期前期時(shí)(OD62CI> 0.5)，溫度設(shè)定為28°C并流加0.1 %的吐溫60，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物即普魯蘭多糖的積累。
[0040](3)普魯蘭多糖的分離
[0041]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品75.3g/L。發(fā)酵周期為60h ;與未添加吐溫60發(fā)酵周期需要72h相比，縮短了 12h，普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 14.96%。
[0042]實(shí)施例4
[0043](I)種子培養(yǎng)
[0044]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為32h。
[0045](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0046]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)菌體生長處于穩(wěn)定期前期時(shí)(OD62tl
<0.5)溫度32°C，轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期前期時(shí)(OD62CI> 0.5)，溫度設(shè)定為28°C并流加0.12%的吐溫60，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物即普魯蘭多糖的積累。
[0047](3)普魯蘭多糖的分離
[0048]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品75.5g/Lo發(fā)酵周期為58h，與未添加吐溫60發(fā)酵周期需要72h相比，縮短了 14h ;普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 15.23%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟: 1)種子培養(yǎng): 將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后挑一環(huán)轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28_32h ； 2)發(fā)酵培養(yǎng): 5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，當(dāng)發(fā)酵液0D62(i< 0.5時(shí)，控制溫度32°C，當(dāng)發(fā)酵液OD62tl^ 0.5時(shí)，控制溫度至28°C，并流加發(fā)酵液體積0.08% -0.12%的吐溫60，發(fā)酵時(shí)間為58-63h ； 3)普魯蘭多糖的分離 發(fā)酵液過濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為:單位g/L，蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化鈉0.25，磷酸氫二鉀0.2，硫酸銨0.1，硫酸鎂0.04，硫酸亞鐵0.05，蒸餾水定容至10mL后用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，121°C滅菌20分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:單位g/L，蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氫二鉀7，硫酸鎂0.4，氯化鈉3，硫酸亞鐵0.05，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，按0.1%。量添加泡敵，121°C滅菌20分鐘。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的一種提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述出芽短梗霉菌株為保藏編號為CGMCC N0.7055的出芽短梗霉。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過雙段控溫并流加吐溫60來提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，在出芽短梗霉發(fā)酵培養(yǎng)過程中，當(dāng)菌體生長處于適應(yīng)期(發(fā)酵液OD620＜0.5)時(shí)，控制溫度32℃，當(dāng)菌體生長處于對數(shù)期初期(發(fā)酵液OD620≥0.5)時(shí)，控制溫度至28℃，并流加發(fā)酵液體積0.08％-0.12％的吐溫60，縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵時(shí)間為58-63h。本發(fā)明根據(jù)菌體在不同生長周期最適生長溫度不同以及菌體在次級代謝產(chǎn)物合成時(shí)流加適量吐溫60來提高普魯蘭多糖產(chǎn)量，操作便捷，效果明顯，較大地縮短了發(fā)酵周期，提高了底物的轉(zhuǎn)化率，降低了普魯蘭多糖的成本。
【IPC分類】C12R1-645, C12Q3-00, C12P19-10
【公開號】CN104711374
【申請?zhí)枴緾N201410830995
【發(fā)明人】喬長晟, 王建梓, 李振海, 郝華璇, 馮杰
【申請人】天津北洋百川生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2014年12月26日