齊口裂腹魚cart基因的克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種齊口裂腹魚CART基因克隆方法，通過齊口裂腹魚CART基因克隆、測序及表達分析，得到CART基因三個亞型；本發(fā)明技術(shù)提供了一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚CART基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】齊口裂腹魚CART基因的克隆方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種齊口裂腹魚CART基因克隆方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著水生動物營養(yǎng)學(xué)研究的不斷深入和完善，近年來，魚類的攝食調(diào)控已逐漸成 為營養(yǎng)學(xué)的一個研究熱點，迄今不同學(xué)者分別從營養(yǎng)與動物的生長性能，生理學(xué)參數(shù)，以及 生化酶和代謝之間的關(guān)系等方面做了大量的研究工作，但從分子水平上，尤其是攝食相關(guān) 的基因與魚類能量代謝之間關(guān)系的研究仍頗為缺乏。
[0003] 可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄膚（cocaine-andamphetamine-regulatedtranscriptpe ptides，CART)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性神經(jīng)肽。前期研究提示，CART廣泛分布于中樞神 經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，具有多種生理功能。1998年，CART肽作為腦內(nèi)源厭食因子被提出，其在 動物攝食平衡調(diào)節(jié)中的作用受到重視，隨后在哺乳動物和人上已進行了大量的研究。然而， CART基因在魚類上的研究還較為缺乏，目前僅在斑馬魚、金魚、大西洋鮭魚等一些少數(shù)魚類 上進行了基因克隆。本發(fā)明利用RACE技術(shù)快速擴增CART基因，填補了該基因在齊口裂腹 魚上的空白，為進一步研究該基因在魚類上的功能奠定了基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚CART基因的全長序列 的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了 基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明所述的方法包括如下步驟：
[0006] 1、腦組織總RNA的抽提；
[0007] 2、cDNA 第一鏈合成；
[0008] 3、CART基因核心片段的PCR擴增；
[0009] 4、RACE 擴增；
[0010] 5、目的片段的分離和回收；
[0011] 6、感受態(tài)細胞制備；
[0012] 7、連接和轉(zhuǎn)化；
[0013] 8、質(zhì)粒DNA抽提；
[0014] 9、將陽性克隆菌液送出測序。
[0015] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明技術(shù)提供了一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚 CART基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂 腹魚的該基因奠定了基礎(chǔ)。

【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0017] 實施實例1
[0018] 齊口裂腹魚CART基因克隆的方法，具體包括以下步驟：
[0019] 1、腦組織總RNA的抽提
[0020] 總RNA提取過程嚴格按無菌操作要求進行。具體操作步驟如下：
[0021] (1)從一 80°C冰箱中取出凍存組織，取100mg左右，放入高溫滅菌處理過的研缽 中，加入液氮，磨成粉末；
[0022] (2)向1. 5mL離心管中加入lmL預(yù)冷的RNAisoPlus裂解液，迅速把組織粉末放置 于離心管中，劇烈振蕩5min，使其充分溶解；
[0023] (3)4°C條件下12000g離心5min，小心吸取上清液，移入新的1. 5mL離心管中。
[0024] (4)吸取0. 2mL氯仿加入離心管中，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s，待溶液充分 乳化，再室溫靜置5min。
[0025] (5)4°C條件下12000g離心15min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1. 5mL離心管中；
[0026] (6)向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管使其充分混勻，在室溫下靜置 lOmin ；
[0027] (7)4°C條件下12000g離心lOmin，在離心管底部可見膠狀RNA沉淀；
[0028] (8)小心棄去上清液，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇lmL，輕輕上下顛倒洗滌 離心管管壁。
[0029] (9) 4°C條件下12000g離心5min后小心棄去乙醇。
[0030] (10)室溫干燥沉淀2?5min，加入適量的DNase/RNase-free去離子水溶解沉淀。
[0031] (11) 1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 2、cDNA 第一鏈合成
[0033] cDNA第一鏈合成的具體步驟如下：
[0034] 在 PCR 管中加入 5XPrimeScriptBufTer2 μ L，PrimeScriptRTEnzymeMixIO· 5 μ L， OligodTPrimerO. 5 μ L，Random6mers0. 5 μ L，TotalRNA2 μ L，RNaseFreedH204. 5 μ L，瞬時離 心，混勻試劑。然后在PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為42°C反應(yīng)15min，85°C反應(yīng)5s，于 4°C保存。
[0035] 3、CART基因核心片段的PCR擴增
[0036] 根據(jù)GenBank中公布硬骨魚類CARTcDNA的保守序列設(shè)計引物(核心序列引物 CART-1F1、R1 ;CART-2F1、R1 ;CART-3F1、R1)，在 Bio-RadPCR 擴增儀上進行，變性溫度、退火 溫度和延伸溫度根據(jù)引物的Tm值和目的片段大小而定。將PCR擴增得到的核心片段送出 測序。
[0037] 4、RACE 擴增
[0038] 4.1RACE 引物設(shè)計
[0039] 根據(jù)已獲得CART核心序列分別設(shè)計設(shè)計RACE的巢式引物：5'下游特異性引 物 1 (5, RACE 引物 CART-1F1 ;CART-2F1 ;CART-3F1)，5' 下游特異性引物 2 (5, RACE 引物 CART-1F2 ;CART-2F2 ;CART-3F2)，3'上游特異性引物 1 (3'RACE 引物 CART-1R1 ;CART-2R1 ; CART-3R1)，3' 上游特異性引物 2 (3, RACE 引物 CART-1R2 ;CART-2R2 ;CART-3R2)。
[0040] 4. 2RACE_ReadycDNA 的準備
[0041] RACE-ReadycDNA合成的具體操作步驟如下：
[0042] (1)準備 2 個 PCR 管，向其加入 First-StrandBuffer2y L，DTT1 μ L 和 dNTPMixl μ L，瞬時離心，混勻試劑。
[0043] (2)向以上反應(yīng)管中加入RNA2 μ L。其中向5' RACE反應(yīng)管中加入 5' -CDSPrimerAl μ L，并定容至 3. 75 μ L。3' RACE 反應(yīng)管中加入 3' -CDSPrimerA，并定容至 4. 75 μ L。瞬時離心，混勻試劑。
[0044] (3) 72°C孵育 3min，然后 42°C冷卻 2min。最后 14000rpm 離心 10s。
[0045] (4) 5' RACE反應(yīng)管中各加入1 μ LSMARTerllAoligo,混勻后瞬時離心。
[0046] (5)5, RACE 和 3' RACE 反應(yīng)管都加入 BufferMix4y L，RNaseInhibitorO. 25μ L和 ReverseTranscriptasel μ L,瞬時離心。
[0047] (6) 42 °C 孵育 90min。
[0048] (7) 70°C加熱 lOmin 終止反應(yīng)。
[0049] (8)用TE緩沖液稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0050] 4. 35' -RACE 擴增
[0051] (1)準備50μ L的5' -RACE反應(yīng)體系，按照順序混勻以下試劑： 34.5yLPCR-GradeWater、5yL10XAdvantage2PCR 緩沖液、lyLdNTP(10mmoL/L)、 1 μ L50XAdvantage2PolymeraseMix。旋潤混勻試劑，瞬時離心。
[0052] (2)再向 50 μ L 的 5' -RACE 反應(yīng)體系加入 2. 5 μ L5' RACE-ReadycDNA、5 μ LUPM 和 1 μ L5' 下游特異性引物 1 (5' RACE 引物 CART-1F1 ;CART-2F1 ;CART-3F1)。然后在 Bio-RadPCR儀上進行"Touchdown'TCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：94°C變性5min ;94°C反應(yīng)30s， 72°C反應(yīng)3min，進行5次循環(huán)；94°C反應(yīng)30s，70°C反應(yīng)30s，72°C反應(yīng)2min，進行5次循環(huán)； 94°C反應(yīng)30s，68°C反應(yīng)30s，72°C反應(yīng)2min，進行25次循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。
[0053] (3)將上一步獲得的反應(yīng)液為模板，以5'下游特異性引物2 (5' RACE引物 CART-1F2 ;CART-2F2 ;CART-3F2)和 UPM 為引物，再次進行"Touchdown" PCR 反應(yīng)。
[0054] 4. 43' -RACE 擴增
[0055] "Touchdown"PCR 方法和體系同 5' -RACE。
[0056] 5、目的片段的分離和回收
[0057] (1)從電泳板上切割目的DNA片段的凝膠塊(割膠盡可能的小，提供后續(xù)回收效 率)。
[0058] (2)凝膠稱重后并將其放入1. 5mL管中，將其適當(dāng)切小，加速溶解。每100mg凝膠 加入 400 μ LSolutionSN。
[0059] (3)凝膠溶解：55?6(TC，保溫5?lOmin,每2min混勻一下，使凝膠溶解，膠完全 融化后每 400 μ LSolutionSN 中加入 SolutionBlOO μ L，混勻。
[0060] (4)將3S柱裝入2mL洗管，將上述混合液轉(zhuǎn)移至3S柱，室溫放置2min.室溫 10000r/min 離心 lmin，穩(wěn)定 45S。
[0061] (5)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入 700μ LWashSolution，室溫 10000r/min 離心 lmin。
[0062] (6)重復(fù)步驟5-次。
[0063] (7)取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10000r/min 離心2min。
[0064] (8)將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30μ LddH20,室溫放置2min。
[0065] (9)蓋上離心管，室溫10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片 段，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0066] 6、感受態(tài)細胞制備
[0067] 用無菌鉬絲直接醮取E. coliDH5a菌株，在LB平板表面劃線，37°C倒置培養(yǎng)過 夜；從LB平板上挑取單菌落，接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；取30 μ L 培養(yǎng)液接種于3mLLB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)2. 5h，至肉眼能看到微微渾濁；將培養(yǎng)液 轉(zhuǎn)入 1. 5mLEppendorf 管，冰浴 10min ;4°C、4000r/minX5min，棄上清；用預(yù)冷的 75mmol/ LCaC12750y L輕輕懸浮細胞，冰浴30min ;4°C、4000r/minX4min，棄上清；加入預(yù)冷的 75mmol/LCaC12 (內(nèi)含甘油終濃度為15%)200yL，輕輕懸浮，冰浴至少4h，即成感受態(tài)細胞 懸液，分裝后_80°C保存。
[0068] 7、連接和轉(zhuǎn)化
[0069] (1)連接：在微離心管中依次加入PCR純化產(chǎn)物4 μ L (約0. 4 μ g)，載體 pMD19-TlyL，Solution I 5yL;16°C水浴反應(yīng) 12h。
[0070] (2)轉(zhuǎn)化：取200 μ LToplO感受態(tài)細胞懸液，加入連接溶液10 μ L，輕輕混勻，冰上 放置30min ;42°C水浴1. 5min，冰上放置2. 5min，加入lmL37°C預(yù)熱的液體培養(yǎng)基，37°C預(yù) 表達111，使細胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)；41：，350〇1'/1^11\51^11，將菌液濃縮至20(^1^，分別加 入10 μ L的IPTG和X-gal，輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上， 37°C正面放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
[0071] 8、質(zhì)粒DNA抽提
[0072] 挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落，分別接種于2mL含適當(dāng)Amp+抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C 下225r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒的說明書進行操作。
[0073] 9、將陽性克隆菌液送出測序：
[0074] 將抽提出來的質(zhì)粒用BamH I和Sal I酶切，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性 克隆菌液大約500mL進行測序。
[0075] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0001] SEQUENCE LISTING \110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué) <120〉齊口裂腹魚CART基因的克隆方法 <130>說明書 <160〉 24 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213〉齊口裂腹魚CART-1亞型核苷酸序列 <400> 1 acatggggaa tctcagtgca cagggcgagc ttggctgtga ccatggagag ctccaaactc 60 tggaccacag cgatggcatg cgcggtgctg gtctcctgca ttcagggtgc tgaaatggac 120 tttgacaacg aatccgactt agaaacgaga gctttgagag agttttaccc aaaggacccg 180 aatctgacca acgaaaagca gctcctcggg gctttacatg acgttctgga gaaactgcag 240 agtaaacgca tctcactctg ggaaaagaag tttgggcgcg ttcctacatg cgatgttggg 300 gagcaatgcg ccatcaggaa aggatcaaga atcggcaaaa tgtgcgactg tccacgtgga 360 gcgttttgca attacttttt gctgaaatgt ttgtaaagat aaaaatggat tgtgaattgg 420 aaatatacac atgatcttgc agatatttat acattatgtc atttctattt ttatgattat 480
[0002] ggagtacaat gagaagaaca gatgaatttg aaagattgtt taattatttg ctgctcttga 540 tgtgtaatta atcctgaata aactgtggac ttttgttttc aaaaaaaaaa aaaaaaa 597 <210〉 2 <211〉 694 <212〉 DNA <213〉齊口裂腹魚CART-2亞型核苷酸序列 <400> 2 acatgggggg gtgcaaggct gtcgagatgg ttatttgcgc caaaactttg catagagacg 60 tataacggca ttgcgcgctc aggtgacaaa gttccctaaa gtcaggacca tggagagctc 120 cagtctgaag acgcgcatgg ctgtgtgcgc gctgctgccc tgcttgttga ccggagccaa 180 agcgaacgag tcagagccgg agatagaggt ggaactggac acaagagcca tcagagactt 240 ctaccccaaa gacccaaacc tgacaagtga aaaacagctt ctcggggctc tgcaagaagt 300 tctggaaaag ctgcagacga aacgaattcc accttgggag aagaaatttg gtcaagttgc 360 catgtgtgat ttgggggagc agtgcgcgat cagaaaaggc tctcgaatcg gcaagatgtg 420 cgactgtccg cgcggggctt tctgcaactt tttcttgtta aagtgcttgt gatggaaagt 480 ccatatgcat tatatatcat aaataactac agttttattt agattaatat ttttttaagt 540 gaagagactg aagacactga agcaaagttg taaagaaatt gttcttcaaa tatttgcgtg 600
[0003] atgtaaacat gtaatactgt catatttaat gttaatctgc tgttttgtgc attaaagtgc 660 aatataactt gttttgtaaa aaaaaaaaaa aaaa 694 <210> 3 <211> 749 <212> DNA <213〉齊口裂腹魚CART-3亞型核苷酸序列 <400> 3 acatggggga agcaatagaa agaggcaaca agagcacaag cgccgagaaa actaaaacag 60 aaaatagcaa acgattttgt attttaaatt ctcagtttta ccttactgac gccaaagcat 120 tcagcaccat ggacagcgtc cgcgccgcgg tttacctgag cgttttcctc tcgctgctct 180 gcgtctgcag gggtcagatg tcactggaca accgactgag cgcgcaagag gagcagtt.ca 240 txaaaacaga cctggctgag gcgctcgatg aacttttgaa tggagatcag gacaatcgga 300 tatctgtgga gaaaaaagct agcgtcattc caaggtgtga tgtgggggag cgctgcgcca 360 tgaagcacgg accgcgcatc gggcgactgt gtgattgcat gcgaggaaca gcctgcaata 420 ctttcttctt gcgctgctac tgatggagct cgcgcagctt tcctctctct caggcgctgt 480 gctaagagac tcgtgacagc aatgcgtggg acacctcatc tatttaacgc gtgaaattac 540 atgggtgatg tattgatagt gttttgttcg taaccgtgtc tatatgtgtt tgtgtttttt 600
[0004] taagttaata aaacgtcttt aaggctcatt cgttttgaac actgtttact ctaaatgaaa 660 gtatatgtat acattctctg tgagtttata atgtatctgt ttaataaaaa ccgtaaaaac 720 8,3,8,3,8,3,3.3,8,3, 3,8,3,8,3,3.3,8,3, 749 <210〉 4 <211> 120 <212> PRT <213〉齊口裂腹魚CART-1亞型編碼的氨基酸序列 <400〉 4 Met Glu Ser Ser Lys Leu Trp Thr Thr Ala Met Ala Cys Ala Val Leu 15 10 15 Val Ser Cys lie Gin Gly Ala Glu Met Asp Phe Asp Asn Glu Ser Asp 20 25 30 Leu Glu Thr Arg Ala Leu Arg Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Pro Asn Leu 35 40 45 Thr Asn Glu Lys Gin Leu Leu Gly Ala Leu His Asp Val Leu Glu Val 50 55 60
[0005] Leu Glu Lys Leu Gin Ser Lys Arg lie Ser Leu Trp Glu Lys Lys Phe 65 70 75 80 Gly Arg Val Pro Thr Cys Asp Val Gly Glu Gin Cys Ala lie Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Arg lie Gly Lys Met Cys Asp Cys Pro Arg Gly Ala Phe Cys 100 105 110 Asn Tyr Phe Leu Leu Lys Cys Leu 115 120 <210〉 5 <211> 120 <212〉 PRT <213〉齊口裂腹魚CART-2亞型編碼的氨基酸序列 <400〉 5 Met Glu Ser Ser Ser Leu Lys Thr Arg Met Ala Val Cys Ala Leu Leu 15 10 15 Pro Cys Leu Leu Thr Gly Ala Lys Ala Asn Glu Ser Glu Pro Glu lie 20 25 30
[0006] Glu ￥al Glu Leu Asp Thr Arg Ala lie Arg Asp Phe Tyr Pro Lys Asp 35 40 45 Pro Asn Leu Thr Ser Glu Lys Gin Leu Leu Gly Ala Leu Gin Glu Val 50 55 60 Leu Glu Lys Leu Gin Thr Lys Arg 丄丄e Pro Pro 1'rp Glu Lys Lys Phe 65 70 75 80 Gly Gin Val Ala Met Cys Asp Leu Gly Glu Gin Cys Ala lie Arg Lys 85 90 9b Gly Ser Arg lie Gly Lys Met Cys Asp Cys Pro Arg Gly Ala Phe Cys 100 105 110 Asn Phe Phe Leu Leu Lys Cys Leu 115 120 <210〉 6 <211〉 104 <212> PRT 〈213〉齊口裂腹魚CART-3亞型編碼的氦基酸序列 <400〉 6
[0007] Met Asp Ser Val Arg Ala Ala Val Tyr Leu Ser ￥al Phe Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Cys Val Cys Arg Gly Gin Met Ser Leu Asp Asn Arg Leu Ser Ala 20 25 30 (iln G_Lu Glu Gin Phe 丄le Lys Thr Asp Leu Ale G丄u Ala leu Asp G丄u 35 40 45 Leu Leu Asn Gly Asp Gin Asp Asn Arg lie Ser Yal Glu Lys Lys Ala 50 55 60 Ser Val lie Pro Arg Cys Asp Val Gly Glu Arg Cys Ala Met Lys His 65 70 75 80 Gly Pro Arg lie Gly Arg Leu Cys Asp Cys Met Arg Gly Thr Ala Cys 85 90 95 Asn Thr Phe Phe Leu Arg Cys Tyr 100 <210〉 7
[0008] <211> 18 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-1上游引物F1 <400> 7 actctggacc acagcgat 18 <210〉 8 <211〉 18 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-1下游引物R1 <400> 8 gcacattttg ccgattct 18 <210〉 9 <211〉 18 <212> DNA <213>核心序列引物CART-2上游引物F2 <400〉 9 gagccaaagc gaacgagt 18 <210〉 10 <211> 18 <212> DNA
[0009] <213〉核心序列引物CART-2下游引物R2 <400〉 10 gcggacagtc gcacatct 18 <210〉 11 <211> 18 <212〉 DNA <213〉核心序列引物CART-3上游引物F3 <400〉 11 gcggtttacc tgagcgtt 18 <210> 12 <211〉 22 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-3下游引物R3 <400〉 12 agaagaaagt attgcaggct gt 22 <210〉 13 <211> 28 <212> DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-1 R1 <400> 13
[0010] gtggacagtc gcacattttg ccgattct 28 <210〉 14 <211> 26 <212> DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-1 R2 〈400〉 14 acttcttttc ccagagtgag atgcgt 26 〈210〉 15 〈211〉 26 〈212〉 DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-2 R1 <400> 15 gctcccccaa atcacacatg gcaact 26 <210〉 16 <211> 28 〈212〉 DNA 〈213〉5'-RACE 引物 CART-2 R2 〈400〉 16 tcacttgtca ggtttgggtc tttggggt 28
[0011] <210> 17 <211〉 28 <212〉 DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-3 R1 <400〉 17 aggtgtccca cgcattgctg tcacgagt 28 <210〉 18 〈211〉 26 <212〉 DNA 〈213〉5'-RACE 引物 CART-3 R2 〈400〉 18 ccacatcaca ccttggaatg acgcta 26 <210> 19 <211〉 28 <212> DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-1 FI <400> 19 cagggtgctg aaatggactt tgacaacg 28 <210> 20
[0012] <211> 28 <212〉 DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-1 F2 <400> 20 tctcactctg ggaaaagaag tttgggcg 28 <210> 21 <211> 28 〈212〉 DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-2 FI <400> 21 ctaccccaaa gacccaaacc tgacaagt 28 <210> 22 <211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉3'-RACE 引物 CART-2 F2 <400> 22 cgaatcggca agatgtgcga ctgt 24 <'210> 23 <211> 30 〈212〉L)M
[0013]
【權(quán)利要求】
1. 齊口裂腹魚CART基因，其特征在于，所述的CART基因含有CART-1、CART-2和CART-3 三個亞型；所述CART-1亞型的核苷酸序列是SEQIDNO : 1，所述CART-2亞型的核苷酸序列是 SEQIDN0 :2,所述CART-3亞型的核苷酸序列是SEQIDN0 :3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述齊口裂腹魚CART基因，其特征在于，所述CART-1亞型核苷酸編 碼的蛋白序列是SEQIDNO :4,所述CART-2亞型核苷酸編碼的蛋白序列是SEQIDNO :5,所述 CART-3亞型核苷酸編碼的蛋白序列是SEQIDNO :6。
3. -種攜帶有CART基因 DNA序列的載體。
4. 一種宿主，其由權(quán)利要求3所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核生物或真核生物宿主得 至IJ，所述的宿主為細菌、酵母或哺乳動物細胞。
【文檔編號】C12N5/10GK104059922SQ201410133601
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】陳德芳, 袁登越, 李志瓊 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)