一種昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，屬淡水水生生物細胞培養(yǎng)和超低溫冷凍保存【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法是以昆明裂腹魚腹鰭組織為材料，采用組織塊法，在含有胎牛血清和細胞生長因子，pH值為7.0-7.2的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)；采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)；具體包括制備細胞培養(yǎng)液、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)步驟。本發(fā)明的有益效果在于：1、原代培養(yǎng)耗時短，細胞量大，能用于染色體分析；2、構(gòu)建的昆明裂腹魚鰭細胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對昆明裂腹魚種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要；3、該構(gòu)建方法也適用于其他魚類構(gòu)建鰭細胞系。
【專利說明】一種昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，屬淡水水生生物細胞培養(yǎng)和超低溫冷凍保存【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]魚類細胞培養(yǎng)起于20世紀60年代，發(fā)展至今形成了一套包括培養(yǎng)基、抗生素、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法等相對完善的細胞培養(yǎng)體系，截止目前，已建立了 280余株細胞系。我國魚類細胞培養(yǎng)歷經(jīng)30余年，也只建立了 50余株魚類細胞系，涉及的種類有約30種，主要以海洋種類為主?！囊陨鲜吕梢钥闯?，一套成熟的細胞培養(yǎng)技術(shù)流程并不是一株細胞系建立成功的必備條件，成熟的技術(shù)流程并不能使細胞培養(yǎng)獲得成功，細胞培養(yǎng)仍然需要從提供原代細胞物種本身的生物學(xué)特性入手，經(jīng)過艱苦的野外調(diào)查和大量的室內(nèi)實驗，對細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件進行調(diào)整，找到最優(yōu)的培養(yǎng)條件，才能使細胞培養(yǎng)獲得成功。云南土著淡水魚類近600種，占中國淡水魚類的50%，因此，云南土著魚類種質(zhì)資源保存顯得尤為重要，但細胞培養(yǎng)研究鮮見報道。
[0003]昆明裂腹魚Schizothoraxgrahami(Ragen, 1904)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚屬(Schizothorax),俗名細鱗魚，白魚，主要分布在金沙江下游支流，在IUCN(世界自然保護聯(lián)盟)物種紅色名錄中被列為極度瀕危物種。經(jīng)過多年努力，昆明裂腹魚人工繁殖技術(shù)于2013年研發(fā)成功，并計劃將繁殖魚苗放流回滇池和牛欄江等流域，但由于養(yǎng)殖魚類本身的局限性，塘養(yǎng)環(huán)境下人工繁殖易造成染色體異常，如多倍化和異倍化，需要細胞短期培養(yǎng)用于核型分析以檢測人工繁殖品種的質(zhì)量，保證放流個體的成活率和繁殖率；另一方面，野外引種個體需要一段時間才能適應(yīng)塘養(yǎng)環(huán)境，而此適應(yīng)階段是各種疾病的爆發(fā)期，可能會給引種個體帶來滅頂之災(zāi)，如何進行病害防治顯得尤為重要，而研究藥物的抗病作用機理是病害防治的重要環(huán)節(jié)，在分子細胞水平研究藥物的抗病作用機理不可或缺，因此，需要研究一種昆明裂腹魚細胞系的建構(gòu)建方法，建立昆明裂腹魚細胞系。
[0004]經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明的相同報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便易行的昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，以滿足對昆明裂腹魚快速核型分析、種質(zhì)資源保存和理論研究的需要。
[0006]本發(fā)明的昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下:
[0007]( I)制備PBS消毒液和細胞培養(yǎng)液
[0008]PBS消毒液:向PBS中加入抗生素，使青霉素濃度為200IU/ml,鏈霉素濃度為200 μ g/ml，慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ；
[0009]基礎(chǔ)培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清，使胎牛血清體積占總體積的10% ；
[0010]原代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為200IU/ml，鏈霉素濃度為200 μ g/ml，慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ；
[0011]傳代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為6ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為10 μ g/ml ；
[0012]調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0-7.2，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0013](2)原代培養(yǎng)
[0014]以75%的酒精消毒昆明裂腹魚魚體三次，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腹鰭，置于無菌培養(yǎng)皿中，PBS消毒液清洗腹鰭組織5次后，用無菌器械剪成組織小塊，并將其接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入原代培養(yǎng)液5ml于20°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第2天細胞開始從組織塊中遷移，20天長成細胞單層；
[0015](3)傳代培養(yǎng)
[0016]原代腹鰭細胞鋪滿瓶底80%后開始傳代，傳代培養(yǎng)具體方法如下，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，細胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液Iml以中和胰酶反應(yīng)，吹打瓶底，使貼壁細胞脫落，首次傳代按體積比1:1傳，此后按體積比1:2或1:3進行傳代，于20°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第10代時，細胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時，細胞系建立成功；
[0017](4)細胞凍存與復(fù)蘇
[0018](a)配制細胞凍存保護液:凍存液包括DMEM/F12培養(yǎng)液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0019](b)細胞凍存:取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細胞懸液1200rpm離心8min，棄掉上清液，向細胞沉淀中加入配制的細胞凍存液，重懸，使細胞的濃度為I 乂106個/ml，將Iml細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，_80°C過夜，然后放入液氣中長期保存；
[0020](c)細胞復(fù)蘇:將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化，然后在無菌操作臺中，將解凍細胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，IOOOrpm離心8min，除上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天細胞即長成單層。
[0021]本發(fā)明的各步驟中所用百分比均為體積百分比
[0022]本發(fā)明的顯著效果在于:
[0023]1、操作簡便易行。
[0024]2、腹鰭組織塊中剛遷移出來的細胞具有活性，且細胞量大，能用于染色體分析。
[0025]3、構(gòu)建的昆明裂腹魚腹鰭細胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對昆明裂腹魚種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要；
[0026]4、該 構(gòu)建方法也適用于其他魚類構(gòu)建腹鰭細胞系。
【具體實施方式】:
[0027]本實施例的昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下:[0028]( I)制備PBS消毒液和細胞培養(yǎng)液
[0029]PBS消毒液:向PBS中加入抗生素，使青霉素濃度為200IU/ml,鏈霉素濃度為200 μ g/ml，慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ；
[0030]基礎(chǔ)培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清，使胎牛血清體積占總體積的10% ；
[0031]原代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為200IU/ml，鏈霉素濃度為200 μ g/ml，慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ；
[0032]傳代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為6ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為10 μ g/ml ；
[0033]調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0或7.2，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0034](2)原代培養(yǎng)
[0035]以75%的酒精消毒昆明裂腹魚魚體三次，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腹鰭，置于無菌培養(yǎng)·皿中，PBS消毒液清洗腹鰭組織5次后，用無菌器械剪成組織小塊，并將其接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入原代培養(yǎng)液5ml于20°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第2天細胞開始從組織塊中遷移，20天長成細胞單層；
[0036](3)傳代培養(yǎng)
[0037]原代腹鰭細胞鋪滿瓶底80%后開始傳代，傳代培養(yǎng)具體方法如下，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，細胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液Iml以中和胰酶反應(yīng)，吹打瓶底，使貼壁細胞脫落，首次傳代按體積比1:1傳，此后按體積比1:2或1:3進行傳代，于20°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第10代時，細胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時，細胞系建立成功；
[0038](4)細胞凍存與復(fù)蘇
[0039](a)配制細胞凍存保護液:凍存液包括DMEM/F12培養(yǎng)液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0040](b)細胞凍存:取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細胞懸液1200rpm離心8min，棄掉上清液，向細胞沉淀中加入配制的細胞凍存液，重懸，使細胞的濃度為I 乂106個/ml，將Iml細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，_80°C過夜，然后放入液氣中長期保存；
[0041](c)細胞復(fù)蘇:將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化，然后在無菌操作臺中，將解凍細胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，IOOOrpm離心8min，除上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天細胞即長成單層。
[0042](5)各步驟中所用百分比均為體積百分比。
【權(quán)利要求】
1.一種昆明裂腹魚鰭細胞系的構(gòu)建和超低溫冷凍保存方法，其特征在于該方法的具體步驟如下: (1)制備PBS消毒液和細胞培養(yǎng)液 PBS消毒液:向PBS中加入抗生素,使青霉素濃度為200IU/ml,鏈霉素濃度為200 μ g/ml,慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ； 基礎(chǔ)培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清，使胎牛血清體積占總體積的10% ； 原代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為200IU/ml，鏈霉素濃度為`200 μ g/ml，慶大霉素濃度為20 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ； 傳代培養(yǎng)液:向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為6ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為`100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為10 μ g/ml ； 調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的PH值為7.0-7.2，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫? (2)原代培養(yǎng) 以75%的酒精消毒昆明裂腹魚魚體三次，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腹鰭，置于無菌培養(yǎng)皿中，PBS消毒液清洗腹鰭組織5次后，用無菌器械剪成組織小塊，并將其接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入原代培養(yǎng)液5ml于20°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第2天細胞開始從組織塊中遷移，20天長成細胞單層； (3)傳代培養(yǎng) 原代腹鰭細胞鋪滿瓶底80%后開始傳代，傳代培養(yǎng)具體方法如下，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，細胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液Iml以中和胰酶反應(yīng)，吹打瓶底，使貼壁細胞脫落，首次傳代按體積比1:1傳，此后按體積比1:2或1:3進行傳代，于20°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第10代時，細胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時，細胞系建立成功； (4)細胞凍存與復(fù)蘇 Ca)配制細胞凍存保護液:凍存液包括DMEM/F12培養(yǎng)液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配； (b)細胞凍存:取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細胞懸液1200rpm離心8min，棄掉上清液，向細胞沉淀中加入配制的細胞凍存液，重懸，使細胞的濃度為I X IO6個/ml，將Iml細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，_80°C過夜，然后放入液氣中長期保存； (c)細胞復(fù)蘇:將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化，然后在無菌操作臺中，將解凍細胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，IOOOrpm離心8min，除上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天細胞即長成單層。 (5)各步驟中所用百分比均為體積百分比。
【文檔編號】C12N5/071GK103436490SQ201310400065
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】王曉愛, 潘曉賦, 楊君興, 陳小勇, 劉倩 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所