一種基于胃液多重實時pcr檢測的幽門螺桿菌（hp）個體化治療輔助診斷方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于胃液多重實時PCR檢測的幽門螺桿菌（HP）個體化治療輔助診斷方法。本發(fā)明所述方法能從10-500μl胃液標(biāo)本中同時檢測出HP的特異基因、HP克拉霉素耐藥突變位點A2143G和A2142G、以及相應(yīng)患者CYP2C19基因位點（CYP2C19*2（G681A）、CYP2C19*3（G636A））多態(tài)性，選取人上皮細(xì)胞核糖核酸酶P（Rnase?P）作為內(nèi)參基因。該檢測方法快速準(zhǔn)確、樣品需求量小，可在一次試驗中從10-500μl胃液標(biāo)本中檢測出是否存在HP的感染、并報告HP對克拉霉素耐藥情況及患者CYP2C19的基因類型，為HP感染的個體化根除治療提供用藥指導(dǎo)。
【專利說明】—種基于胃液多重實時PCR檢測的幽門螺桿菌(HP)個體化治療輔助診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于胃液的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,簡稱H.pylori或HP)感染個體化治療輔助診斷多重實時(Real-Time) PCR 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]HP能夠引起慢性胃炎、胃潰瘍等消化道相關(guān)疾病，是WHO癌癥協(xié)會規(guī)定的原核生物中唯一的I類致癌因子。以質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor, PPI)結(jié)合阿莫西林和克拉霉素(或者甲硝唑)等抗生素的三聯(lián)療法或四聯(lián)治療等，是國內(nèi)外公認(rèn)的一線抗HP感染治療組合。然而，由于克拉霉素的耐藥率的不斷上升，這種療法的成功率正在逐漸的下降。另一個影響這種三聯(lián)用藥的成功率的是人類的細(xì)胞色素P450的同工酶CYP2C19基因的多態(tài)性，其基因類型決定了 PPI在人體內(nèi)降解的速度。因此，在使用三聯(lián)療法治療HP感染之前，如果能提供準(zhǔn)確的克拉霉素藥敏結(jié)果和CYP2C19基因類型，進(jìn)行針對性的選擇藥物，能夠很好地保證治療的成功率。然而，傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗以及其他快速檢測方法，并不能滿足這一要求。我們設(shè)想通過實時PCR方法在一次實驗中能夠從盡可能少量的胃液標(biāo)本中檢測HP感染，評價克拉霉素耐藥情況，并提供患者CYP2C19基因類型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為了解決上述問題，提供了一種基于胃液的HP感染個體化治療多重實時PCR檢測方法，僅需待檢者提供10-500 μ I胃液，即可在一次試驗中從胃液標(biāo)本中檢測到是否存在HP感染、評價其克拉霉素耐藥情況，同時完成患者CYP2C19的基因類型檢測。
[0004]一種基于胃液的幽門螺桿菌個體化治療多重實時PCR檢測方法，包括:
[0005]a)用胃液中脫落上皮細(xì)胞的核糖核酸酶P (Rnase P)內(nèi)參基因、幽門螺桿菌特異基因cagH、HP23S rRNA克拉霉素耐藥突變位點A2143G和A2142G、CYP2C19基因(CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3 (G636A))分型檢測的引物和探針及熒光標(biāo)記；
[0006]b)胃液的預(yù)處理方法；
[0007]c)檢測所需胃液量；
[0008]d)多重實時PCR分管組合、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件；
[0009]e)檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)；
[0010]f)陽性對照、陰性對照。 [0011]所謂的基于胃液的幽門螺桿菌個體化治療多重實時PCR檢測方法是指通過提取患者胃液中的核酸，能同時檢測HP特異基因cagH (提示患者是否感染HP)、HP23S rRNA克拉霉素耐藥突變位點(評價HP克拉霉素耐藥情況)及CYP2C19基因多態(tài)性(提示CYP2C19酶代謝類型)。
[0012]所謂的內(nèi)參基因(Rnase P)是為了保證試驗中模板提取的正確性和初步估計模板的濃度。
[0013]本發(fā)明通過分析我國HP流行菌株cagPAI上的一段保守區(qū)cagH及HP23S rRNA克拉霉素耐藥突變位點和人類CYP2C19PPI代謝相關(guān)基因，分別設(shè)計了不同的引物和熒光標(biāo)記探針，建立了包括胃液預(yù)處理方法、檢測所需最小胃液量及多重實時PCR檢測技術(shù)在內(nèi)的綜合方案。
[0014]本發(fā)明所述方法僅需要待檢者提供胃液，屬于非侵入性檢測，患者依從性好，檢測所需胃液量小(為10-500μ I)。所述的檢測所需最少胃液量指的是每次試驗僅需患者提供10-500 μ I胃液進(jìn)行預(yù)處理后再進(jìn)行核酸的提取，即可滿足后續(xù)包括檢測到HP的感染、評價其克拉霉素耐藥情況，同時完成患者CYP2C19的基因類型檢測。
[0015]為避免胃液中的離子濃度、pH值影響核酸的質(zhì)量從而影響PCR的擴(kuò)增效率，本發(fā)明提供了一種胃液預(yù)處理方法，即將新鮮(或融化的凍存)的胃液標(biāo)本進(jìn)行渦旋震蕩至均勻，取出10-500μ I胃液標(biāo)本，加入等量的Tris緩沖液(0.67Μ，ρΗ7.4)，振蕩均勻，室溫放置2h。13000rpm離心5min,棄上清留沉淀。后續(xù)步驟按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。所述的Tris緩沖液(0.67M,pH7.4)的配制方法如下:取81.16g Tris至800ml dd H2O中，滴加濃鹽酸至PH7.4，加入ddH20定容至1L。
[0016]本發(fā)明根據(jù)HP克拉霉素耐藥相關(guān)突變的流行狀況，結(jié)合HP特異基因及CYP2C19等位基因特點，進(jìn)行了多重實時PCR方法的構(gòu)建。選擇人上皮細(xì)胞中核糖核酸酶P (RnaseP)為內(nèi)參，合成一條標(biāo)記HEX的TaqMan探針；從中國CDC傳染病診斷室測序的全國各地來源的74株HP的cag致病島(cagPAI)中選擇一段保守基因，作為HP檢測特異基因，合成一條標(biāo)記FAM的TaqMan探針；將HP23SrRNA基因的野生型、A2143G和A2142G作為HP克拉霉素耐藥監(jiān)測的位點，合成三條LNA-TaqMan探針，分別標(biāo)記FAM和/或HEX ;選擇人CYP2C19第五外顯子G681A和第四外顯子G636A為參照，分別針對這兩處設(shè)計兩對LNA-TaqMan探針，并標(biāo)記FAM和HEX。以上探針經(jīng)過特異性驗證和條件優(yōu)化，然后將Rnase P和HP特異探針、三條HP23S rRNA基因探針、CYP2C19基因的兩對探針進(jìn)行組合，對組合探針進(jìn)行驗證和優(yōu)化。本發(fā)明所合成探針都有良好的特異性，并可實現(xiàn)組合檢測。通過以上實驗成功構(gòu)建了多重實時PCR方法，能夠在一次實時PCR試驗中，通過四個反應(yīng)體系，實現(xiàn)HP感染診斷、HP克拉霉素耐藥評價、CYP2C19等位基因分析三個目的。
[0017]引物、探針序列和多重組合如表1所示，其中FAM、HEX為不同波長的熒光報告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)。
[0018] 表1多重實時PCR檢測方法引物和探針序列
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種基于胃液的幽門螺桿菌個體化治療多重實時PCR檢測方法所用的引物和探針組合，其特征在于，
2.包含權(quán)利要求1所述的引物和探針的試劑盒。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于， 其中，胃液預(yù)處理方法包括將新鮮(或融化的凍存)的胃液標(biāo)本進(jìn)行渦旋震蕩至均勻，取出10-500 μ I胃液標(biāo)本，加入等量的Tris緩沖液(0.67Μ，ρΗ7.4)，振蕩均勻，室溫放置2h。13000rpm離心5min,棄上清留沉淀。
4.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述的Tri s緩沖液(0.6 7M，PH7.4)的配制方法如下:取81.16g Tris至800ml ddH20中，滴加濃鹽酸至pH7.4，加入ddH20定容至1L。
5.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于， 還包括在每一反應(yīng)體系中提供相應(yīng)的陽性對照和陰性對照。
6.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于， 陽性對照、陰性對照包括九種陽性對照和一種大腸桿菌陰性對照，其中九種陽性對照分別為含有 cag H,RNase P、HP23S rDNA_AA、HP23S rDNA_GA、HP23S rDNA_AG、CYP2C19_2A、CYP2C19-2G、CYP2C19-3A、CYP2C19-3G 目的基因的質(zhì)粒。
7.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，對照濃度均為IXlO6Copies/μ I。
8.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于， 當(dāng)多重實時PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ I反應(yīng)體系時，其優(yōu)選配置為:
9.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于， 多重實時PCR反應(yīng)程序為:95°C IOmin ；95°C 10s，58°C 45s，45個循環(huán)，讀板。
10.前述任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于， 對有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測結(jié)果可信，否則試驗需要重復(fù)；在檢測中的陽性對照為有效擴(kuò)增時，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下: (0.組合①中綠色曲線起峰，表示DNA標(biāo)本提取正確，在此基礎(chǔ)上，其他結(jié)果判定有效；如果沒有綠色曲線擴(kuò)增，表示DNA提取失敗，其他結(jié)果均不可信； (2).組合①中藍(lán)色曲線起峰，表示有HP感染，Ct值應(yīng)小于38； (3).組合②中藍(lán)色曲線起峰，表示HP23SrRNA基因為野生型；(4).組合②中綠色曲線起峰，表示HP23SrRNA基因為A2143G或A2142G突變型； (5).組合②中藍(lán)色和綠色曲線起峰，表示患者被兩株(或三株)HP感染，一株為HP23SrRNA基因野生型，一株為突變型； (6).組合①中綠色曲線,而組合②中藍(lán)色或綠色曲線起峰，Ct值小于38表示被cagH缺失的HP感染； (7).組合③中藍(lán)色曲線先起峰表示CYP2C19*3為G型；綠色起峰，表示CYP2C19*3為A型； (8).組合④中藍(lán)色曲線先起峰表示CYP2C19*2為G型；綠色起峰，表示CYP2C19*2為A型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911446SQ201410131307
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】張建中, 彭賢惠, 劉杰, 何利華, 趙飛, 閆笑梅, 張茂俊, 張慧芳 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所