一種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行dna測序傳感器及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測DNA堿基序列的納米孔DNA測序傳感器及檢測方法，其中三通道并行DNA測序傳感器，包括堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器。本發(fā)明采用化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA，通過對原子力顯微鏡探針的操控，可以有效地控制DNA在納米孔內(nèi)的運動方向和速度，而且可以同時檢測DNA過孔時產(chǎn)生的堵塞離子電流，隧穿電流和AFM探針的牽引力的變化，實現(xiàn)三通道并行檢測和信號并行分析，相比傳統(tǒng)納米孔單分子傳感器而言大大提高了識別DNA堿基的能力，避免了有效信號的流失；本發(fā)明可以精確的用于對DNA堿基序列過孔電信號和力信號的檢測，對實現(xiàn)低成本高通量的DNA測序這一目標(biāo)意義重大。
【專利說明】—種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到一種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器及測序檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]納米孔單分子傳感器，其工作原理基于庫特計數(shù)器，因其原理和制備工藝簡單，被科學(xué)研究者們一致認(rèn)為在不久的將來將被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和技術(shù)科學(xué)等領(lǐng)域。然而DNA堿基序列精準(zhǔn)測序發(fā)展到現(xiàn)在一直受到膜片鉗放大器掃描頻率的制約，目前膜片鉗的采樣頻率還尚未突破4兆赫茲，現(xiàn)有的采樣頻率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達不到精確測序的要求。因此研究者們采用了一系列的辦法來降低DNA的過孔速度,(Meller A, Nivon L, Brandin E,et al.Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules.P Natl Acad Sci USA, 2000, 97(3): 1079-1084)文獻提出降低體系溫度來降低DNA的過孔速度，(Fologea D, Uplinger J, Thomas B, et al.Slowing DNA translocation ina solid-state nanopore.Nano Lett, 2005, 5(9): 1734-1737)文獻提出增加溶液粘度，降低外加電壓和溫度可以降低DNA的過孔速度，然而這些方法只能很有限的降低DNA的過孔速度，距離實現(xiàn)DNA測序的目標(biāo)甚遠(yuǎn)；(de Zoysa RSS, Jayawardhana DA, Zhao QT,et al.Slowing DNA translocation through nanopores using a solution containingorganic salts.J Phys Chem B, 2009, 113(40): 13332-13336)文獻提出采用有機鹽溶液要比無機鹽溶液更有效的降低DNA的過孔速度，然而有機鹽溶液相對無機鹽溶液適用范圍窄，將限制DNA測序的應(yīng)用；(Manrao EA, Derrington IM, Laszlo AH, et al.ReadingDNA at single-nucleotide resolution with a mutant mspa nanopore and phi29 DNApolymerase.Nat Biotechnol, 2012, 30(4): 349-U174)文獻提出米用聚合酶對 DNA 聚合的作用來控制DNA的遷移速度，雖然可以使得單堿基的遷移速率達到毫秒級，但是聚合酶存在的條件復(fù)雜，違背了低成本簡單高速測序的初衷；(Lu B, Hoogerheide DP, ZhaoQ, et al.Pressure-controlled motion of single polymers through solid-statenanopores.Nano Lett, 2013, 13(7): 3048-3052)文獻提出采用外載對流體加壓，使得DNA在穿過納米孔的時候除了受電場力外還受到額外的壓力，他們的這一方法可以通過調(diào)節(jié)電場方向使得作用于DNA上的總作用力降低到電場力減去壓力的差值，從而達到降低DNA過孔速度的目的，然而他們控制壓力的方法繁瑣復(fù)雜，且降低速率的程度依然有限；(Keyser UF, Koeleman BN, Van Dorp S， et al.Direct force measurements on DNA ina solid-state nanopore.Nat Phys, 2006, 2(7): 473-477)文獻指出通過光懾對DNA進行操縱以達到控制DNA過孔速度的目的，可是目前光鑷操作技術(shù)尚不成熟，嚴(yán)重制約了 DNA測序技術(shù)的應(yīng)用。此外目前基于納米孔單分子傳感器的納米孔DNA測序傳感器都是通過采集DNA過孔時候的堵塞電流信號或隧穿電流信號來辨別DNA堿基的，信號單一，包含的堿基信息有限。因此一種同時具備控制DNA過孔速度和實現(xiàn)多元化信號檢測兩種特征的DNA測序傳感器很有必要被提出，以彌補目前測序傳感器的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003](一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明要解決的是現(xiàn)有的納米孔DNA測序傳感器發(fā)展過程中DNA過孔速度太快的問題和現(xiàn)有傳感器信號檢測渠道過于單一使得不能對DNA堿基序列精準(zhǔn)測序等問題。
[0004](二)技術(shù)方案
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器，其特征是:包括堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器，所述的堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)包括電源I，電流表1和兩個Ag/AgCl電極；所述的原子力顯微鏡探測系統(tǒng)包括激光發(fā)射器，信號反饋處理器和原子力顯微鏡探針；所述的隧穿電流檢測系統(tǒng)包括電源II，電流表1I和兩個納米Au或Pt電極；所述的納米孔單分子傳感器包括含有納米孔的納米薄膜和基底；所述的原子力顯微鏡探針位于所述納米薄膜的上方；在所述納米薄膜的上方和下方還分別設(shè)置一個所述Ag/AgCl電極；所述兩個納米Au或Pt電極分別位于所述納米薄膜上納米孔的兩側(cè)。
[0005]一種基于三通道并行DNA測序傳感器的檢測方法，步驟如下:
步驟一、采用化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子；化學(xué)修飾的方法具體是:
a、采用磁控濺射在原子力顯`微鏡探針表面鍍上一層Au薄膜；
b、配制所要修飾的DNA溶液10-100μ M ；
C、將鍍有Au薄膜的AFM探針浸泡到步驟b中所配制的DNA溶液中，靜置12-24小時；
d、然后在步驟c的溶液中加入3-5ml的0.1%-0.2%的SDS和0.1-0.2 M的磷酸鈉，其中磷酸鈉的PH=7.4 ；
e、在室溫條件下靜置5-7天；
f、在靜置后的溶液中加入3-5ml的0.8-1 M氯化鈉6_8次，每次加入之間的時間間隔為3-4小時；
步驟二、通過操控原子力顯微鏡探針拉著DNA接近納米孔并從納米孔中穿過；
步驟三、當(dāng)DNA進入納米孔中后，通過操控原子力顯微鏡的探針，沿著納米孔軸線方向慢慢移動DNA直至DNA完全移出納米孔，并同時開始檢測DNA移動過程中的堵塞離子電流信號，隧穿電流信號和牽引DNA運動的力信號；
步驟四、重復(fù)步驟三二或三次；
步驟五、完成上述步驟后，通過比對分析本傳感器所得的三通道并行檢測數(shù)據(jù)，尋找堿基與信號之間的對應(yīng)規(guī)律，完成測序。
[0006]本發(fā)明是一種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行檢測DNA測序傳感器，該傳感器由堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器組成。
[0007]上述方案中，采用化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA。然后通過控制原子力顯微鏡探針來操縱DNA的過孔遷移速度和方向，以滿足基本的信號檢測帶寬需求。然后可以同時檢測DNA過孔時產(chǎn)生的堵塞離子電流，隧穿電流及牽引DNA過孔的力信號，實現(xiàn)三通道并行檢測。
[0008](三)有益效果
將基于力信號檢測的原子力顯微鏡探測系統(tǒng)結(jié)合基于電流信號檢測的納米孔單分子傳感器應(yīng)用于DNA測序技術(shù)上，實現(xiàn)多元化信號的檢測。
[0009]探測過程中事先通過化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測的單鏈DNA，通過對原子力顯微鏡探針的操控達到控制DNA在納米孔內(nèi)運動方向和遷移速度的目的，甚至可以控制DNA在孔內(nèi)來回運動，進行反復(fù)測序。
[0010]本發(fā)明基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器，在維持了納米孔單分子傳感器固有特點的同時，其特征在于此傳感器可以同時檢測DNA過孔時候的堵塞離子電流信號，隧穿電流信號，DNA過孔的牽引力信號，實現(xiàn)三通道并行檢測，大大提高了識別DNA堿基的能力，避免了有效信號的流失，降低了 DNA測序檢測的誤差。
[0011]基于上述基本原理，本發(fā)明提供的這種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器可以實現(xiàn)對DNA過孔速度和方向的有效控制，而且可以三通道并行檢測DNA過孔時產(chǎn)生的堵塞離子電流，隧穿電流及牽引DNA過孔的力信號，使得信號包含DNA堿基的信息多元化，提高了納米孔DNA測序傳感器的檢測靈敏度，對實現(xiàn)DNA測序堿基精確辨識意義重大。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0013]圖1為本 發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]圖中:1.電源I，2.電流表1，3.Ag/AgCl電極，4.激光發(fā)射器，5.信號處理器，6原子力顯微鏡探針，7.電源II，8.電流表1I，9.納米Au (Pt)電極，10.帶有納米孔的納米薄膜，11.基底。
【具體實施方式】
[0015]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參考附圖，對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明。
[0016]如圖1所示，本發(fā)明提供的這種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器由堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器組成。其中堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)由電源II，電流表12，Ag/AgCl電極3組成；原子力顯微鏡探測系統(tǒng)由激光發(fā)射器4，信號處理器5，原子力顯微鏡探針6組成；隧穿電流信號檢測系統(tǒng)由電源117，電流表118，納米Au或Pt電極9組成；納米孔單分子傳感器由帶有納米孔的納米薄膜10，基底11組成。本發(fā)明提供的這種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器具體布局參見圖1所示。
[0017]本發(fā)明的工作過程如下:
(1)按照圖1布局搭建好堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器；
(2)采用如下化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子；1.采用磁控濺射在原子力顯微鏡探針表面鍍上一層Au薄膜；
2.配制所要修飾的DNA(事先將DNA修飾上“-SH”官能團)溶液10-100 μ M ；
3.將鍍有Au薄膜的AFM探針浸泡到步驟2中所配制的DNA溶液中，靜置12-24小時； 然后在步驟3的溶液中加入3-5 ml的0.1%-0.2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1 -0.2
M的磷酸鈉(PH=7.4)；
4.在室溫條件下靜置7天；
5.在上述溶液中加入適量的0.8-1 M氯化鈉6-8次，每次加入之間的時間間隔約為3-4小時。
[0018](3)然后通過操控原子力顯微鏡探針拉著DNA接近納米孔，并通過下述方法確認(rèn)DNA是否進入納米孔中；
確認(rèn)DNA是否進入納米孔的方法:因DNA分子在溶液中帶負(fù)電，在外加堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)的電源I施加的電壓下DNA會拉直并穿過納米孔，通過下述步驟來確認(rèn)DNA是否順利進入了納米孔中；
1.打開堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，此時離子電流為開孔離子電流，無堵塞現(xiàn)象(具體表現(xiàn)為離子電流值在一穩(wěn)定值附近波動);
2.操控原子力顯微鏡探針拉著DNA逐漸靠近納米孔；
3.當(dāng)發(fā)現(xiàn)開孔離子電流堵塞后(具體表現(xiàn)為離子電流下降到某個穩(wěn)定值附近震蕩)，待堵塞穩(wěn)定之后慢慢操控原子力顯微鏡探針拉著DNA運動出并逐漸遠(yuǎn)離納米孔，若此過程中離子電流又回升到開孔離子電流值附近波動表示原子力顯微鏡探針找孔成功，并能順利操控DNA入孔和出孔。`
[0019](4)按照步驟3確認(rèn)DNA進入納米孔中后，通過操控原子力顯微鏡的探針，沿著納米孔軸線方向慢慢移動DNA直至DNA完全移出納米孔，并同時開始檢測DNA移動過程中的堵塞離子電流信號，隧穿電流信號和牽引DNA運動的力信號；
(5)重復(fù)步驟(4) 二或三次；
(6 )完成上述步驟后，通過比對分析本傳感器所得的三通道并行檢測數(shù)據(jù)，尋找堿基與信號之間的對應(yīng)規(guī)律，完成測序。
[0020]以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細(xì)。
[0021]說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米孔和原子力顯微鏡的三通道并行DNA測序傳感器，其特征是:包括堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)，原子力顯微鏡探測系統(tǒng)，隧穿電流信號檢測系統(tǒng)和納米孔單分子傳感器，所述的堵塞離子電流信號檢測系統(tǒng)包括電源1(1)，電流表1 (2)和兩個Ag/AgCl電極(3);所述的原子力顯微鏡探測系統(tǒng)包括激光發(fā)射器(4)，信號反饋處理器(5)和原子力顯微鏡探針(6);所述的隧穿電流檢測系統(tǒng)包括電源II (7)，電流表1I (8)和兩個納米Au或Pt電極(9);所述的納米孔單分子傳感器包括含有納米孔的納米薄膜(10)和基底(11)；所述的原子力顯微鏡探針(6)位于所述納米薄膜(10)的上方；在所述納米薄膜(10)的上方和下方還分別設(shè)置一個所述Ag/AgCl電極(3);所述兩個納米Au或Pt電極(9)分別位于所述納米薄膜(10)上納米孔的兩側(cè)。
2.一種基于權(quán)利要求1所述三通道并行DNA測序傳感器的檢測方法，其特征在于，步驟如下: 步驟一、采用化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子；化學(xué)修飾的方法具體是: a、采用磁控濺射在原子力顯微鏡探針表面鍍上一層Au薄膜； b、配制所要修飾的DNA溶液10-100μ M ； C、將鍍有Au薄膜的AFM探針浸泡到步驟b中所配制的DNA溶液中，靜置12-24小時； d、然后在步驟c的溶液中加入3-5ml的0.1%-0.2%的SDS和0.1-0.2 M的磷酸鈉，其中磷酸鈉的PH=7.4 ； e、在室溫條件下靜 置5-7天； f、在靜置后的溶液中加入3-5ml的0.8-1 M氯化鈉6_8次，每次加入之間的時間間隔為3-4小時； 步驟二、通過操控原子力顯微鏡探針拉著DNA接近納米孔并從納米孔中穿過； 步驟三、當(dāng)DNA進入納米孔中后，通過操控原子力顯微鏡的探針，沿著納米孔軸線方向慢慢移動DNA直至DNA完全移出納米孔，并同時開始檢測DNA移動過程中的堵塞離子電流信號，隧穿電流信號和牽引DNA運動的力信號； 步驟四、重復(fù)步驟三二或三次； 步驟五、完成上述步驟后，通過比對分析本傳感器所得的三通道并行檢測數(shù)據(jù)，尋找堿基與信號之間的對應(yīng)規(guī)律，完成測序。
【文檔編號】C12M1/34GK103820313SQ201410084787
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】陳云飛, 司偉, 沙菁潔, 劉磊 申請人:東南大學(xué)