基因dna序列捕獲探針的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基因DNA序列捕獲探針的制備方法，技術(shù)方案為：1）、設(shè)計(jì)兩條部分互補(bǔ)的引物，經(jīng)退火處理后形成一個(gè)部分雙鏈結(jié)構(gòu)的開(kāi)叉形接頭，與目標(biāo)基因的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（A1）進(jìn)行連接反應(yīng)，得到兩端帶有接頭的目標(biāo)基因（A2）；2）、針對(duì)接頭序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，對(duì)所述A2進(jìn)行擴(kuò)增，得到帶有T7啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物（A3）；3）、對(duì)上述產(chǎn)物（A3）進(jìn)行定量后，在一定的條件下，加入帶有生物素標(biāo)記的NTP(其中UTP上標(biāo)記生物素，其他ATP，CTP，GTP不標(biāo)記)，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終得到帶有生物素標(biāo)記的RNA探針（基因DNA序列捕獲探針）。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基因DNA序列捕獲探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種可用于多個(gè)目標(biāo)基因序列進(jìn)行捕獲后進(jìn)行二代測(cè)序的探針制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為現(xiàn)代基因組學(xué)的研究打開(kāi)了新的局面，使得普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)整個(gè)人類(lèi)基因組進(jìn)行測(cè)序成為可能，然而全基因組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)成本和對(duì)科研人員的分析能力的要求還是很高，而且由于大部分基因的功能還不是很清楚，對(duì)所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析將是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。
[0003]在新一代測(cè)序技術(shù)以前，人們對(duì)基因組大片段特定區(qū)域的研究主要通過(guò)PCRwalking后進(jìn)行傳統(tǒng)毛細(xì)管測(cè)序的方法。這種方法的問(wèn)題是目標(biāo)片段大于500kb時(shí)PCR和測(cè)序的成本會(huì)變得讓研究人員難以承受。而傳統(tǒng)的單基因疾病的解決方案是家系連鎖定位，最后定位的區(qū)域往往是以兆(M) bp來(lái)計(jì)算的，這就為后續(xù)的研究工作帶來(lái)了困難。
[0004]隨著新的研究方法的產(chǎn)生，目標(biāo)序列捕獲、全外顯子捕獲等方法能更加經(jīng)濟(jì)有效的靶定基因組的相應(yīng)區(qū)域。而且這些方法產(chǎn)生的大量DNA片段非常適合使用新一代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)這些技術(shù)的組合，人們對(duì)于遺傳疾病的研究的效率大大的提高。
[0005]分子診斷市場(chǎng)無(wú)比廣大，但是診斷市場(chǎng)對(duì)成本的要求更為苛刻，至少全基因組測(cè)序在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)無(wú)法進(jìn)入分子診斷市場(chǎng)，這就是目標(biāo)序列捕獲測(cè)序的機(jī)會(huì)。例如DMD基因，長(zhǎng)度2500kb，由79個(gè)外顯子和78個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其突變是引起杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良病的原因，非常適合采用靶向測(cè)序。還有一些遺傳病在表型上非常相似，但可能是目前已知基因變異的一種，這樣我們也可以把這些變異區(qū)域并在一起，設(shè)計(jì)目標(biāo)序列探針并捕獲測(cè)序，這比傳統(tǒng)的PCR后毛細(xì)管測(cè)序通量高，速度快，深度深。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行有效捕獲的探針的制作方法。應(yīng)用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多個(gè)靶基因區(qū)域同時(shí)進(jìn)行快速高效地捕獲，以更快更有效地鎖定致病位點(diǎn)。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基因DNA序列捕獲探針的制備方法，包括以下步驟:
[0008]一、制備接頭:
[0009]1)、設(shè)計(jì)兩條部分互補(bǔ)的引物，所述兩條引物之間的互補(bǔ)度為30~50% (較佳為35~45%，進(jìn)一步較佳為40%);其中一條引物中含有T7啟動(dòng)子序列
-...TAATACGACTCACTATAGC^,且該條弓丨物的5’末端有一個(gè)突出的T ；
[0010]2)、配制反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng):
[0011]
【權(quán)利要求】
1.基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是包括以下步驟: 一、制備接頭: 1)、設(shè)計(jì)兩條部分互補(bǔ)的引物，所述兩條引物之間的互補(bǔ)度為30~50%;其中一條引物中含有T7啟動(dòng)子序列—
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟四中: 將擴(kuò)增產(chǎn)物(A3)定量至濃度為22.6ng/ μ l ； 體外轉(zhuǎn)錄體系為:

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟一中:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟三中: 通用引物 1: ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT 通用引物 2:CGGCTTAATA CGACTCACTA TAGGGATCGC。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103898210SQ201410064762
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】譚海芹, 洪旭濤, 余文菁, 張珊珊, 余科, 宓婭娜 申請(qǐng)人:紹興銳創(chuàng)生物科技有限公司