一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于基因芯片質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
基因芯片技術(shù)作為近年來快速發(fā)展的一項(xiàng)生物高新技術(shù)，為解決怎樣研究基因在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能提供了光輝的前景?；蛐酒夹g(shù)是指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。
[0003]與傳統(tǒng)核酸印跡雜交方法相比，基因芯片同時(shí)將大量根據(jù)靶基因的特征及檢測(cè)要求預(yù)先設(shè)計(jì)好的探針固定在支持物表面，一次雜交可檢測(cè)和分析樣品中多種靶基因的相關(guān)信息，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足，使基因芯片技術(shù)具有了高通量、多參數(shù)同步分析，快速全自動(dòng)分析，高精確度分析，高靈敏度分析的特點(diǎn)。但用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與匹配探針雜交對(duì)未知DNA序列片段進(jìn)行檢測(cè)的方法本身也存在缺陷:
I)基因芯片熒光檢測(cè)主要依賴于檢測(cè)結(jié)果的熒光強(qiáng)度，沒有熒光強(qiáng)度或者熒光強(qiáng)度弱的即判斷為陰性，但在陰性的結(jié)果中無法確定是否是探針固定上；2)多種基因芯片技術(shù)平臺(tái)得到的研究結(jié)果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成為目前基因技術(shù)研究的熱點(diǎn)，尤其是應(yīng)用型基因芯片尚無一些準(zhǔn)確、高效地有效性檢測(cè)方法，其應(yīng)用的推廣尚有困難。因此發(fā)展一種準(zhǔn)確、高效地有效性檢測(cè)方案來檢測(cè)探針是否固定成為一種迫切的需要。
[0004]基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探針、支持物制備的有效性控制、探針在支持物上的固定效率即基因芯片制備的有效性控制，以及基因芯片檢測(cè)時(shí)的有效性控制、檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化等一系列問題。本專利主要針對(duì)的是制備有效性的基因芯片。
[0005]制備有效性基因芯片的傳統(tǒng)方法有以下幾種:一種方法是利用熒光DNA染料對(duì)單鏈DNA探針染色，根據(jù)熒光DNA染料強(qiáng)度來估計(jì)芯片的有效性；利用目的探針3點(diǎn)樣液和熒光基團(tuán)I標(biāo)記的質(zhì)量控制探針8點(diǎn)樣液分別點(diǎn)樣于修飾了手臂分子6的基質(zhì)7上，形成各自的斑點(diǎn)，然后使目的探針3在斑點(diǎn)處與帶基團(tuán)有同種或異種熒光基團(tuán)標(biāo)記2的待測(cè)DNA序列雜交，根據(jù)質(zhì)量探針8點(diǎn)樣位置是否發(fā)熒光，估計(jì)芯片的有效性，根據(jù)目的探針點(diǎn)位置是否發(fā)熒光，判定待測(cè)DNA序列信息，如圖1所示。但是以上的這些方法都無法直接、有效地評(píng)價(jià)芯片制備的質(zhì)量。
[0006]這種基因芯片質(zhì)量控制的方法可減少了基因檢測(cè)中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，極大地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通?；蛐酒娜毕菔瞧渥陨碣|(zhì)量無法得到較好的控制，如果能夠有一種方法能夠?qū)@樣一種新型的基因芯片對(duì)芯片的有效性進(jìn)行控制，那么將會(huì)大大提高其檢測(cè)的可靠性，為其利用的推廣更進(jìn)一步。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法，能較直接地檢測(cè)探針是否固定在基片上，以排除因探針缺失而造成的陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，提聞了基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可罪性。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法包括以下幾個(gè)步驟:
步驟一:樣品制備:
制備含有目的探針的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡聚體序列的溶液；并將上述目的探針的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡聚體序列的溶液充分混合，制備成點(diǎn)樣溶液；
步驟二:基因芯片制備
將上述混合后的點(diǎn)樣溶液點(diǎn)樣于修飾了手臂分子的基片上形成N個(gè)探針斑點(diǎn)，N為自然數(shù)，經(jīng)固定，在低溫!\下，低溫T1范圍為0~30 ° C，所述所有探針斑點(diǎn)中目的探針與第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡聚體序列發(fā)生雜交反應(yīng)，獲得每個(gè)探針斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液；清除未固定的探針和未雜交的寡聚體序列，完成基因芯片的制備；
步驟三:通過檢測(cè)寡聚體序列(4)的信號(hào)檢測(cè)目的探針通過手臂分子固定在基片上:檢測(cè)上述所有第一雜交產(chǎn)物溶液發(fā)出的熒光信號(hào)，若在第一熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下檢測(cè)到熒光，則表示寡聚體序列通過手臂分子固定在基片上，同時(shí)說明目的探針通過手臂分子固定在基片上，從而判定基因芯片質(zhì)量合格；
否則，若任一個(gè)斑點(diǎn)中在第一突光基團(tuán)的激發(fā)波長下未檢測(cè)到突光，表不寡聚體序列未通過手臂分子固定在基片上，判定為基因芯片質(zhì)量不合格。
[0009]本發(fā)明混合型探針檢測(cè)基因芯片有效性的方法，還包括以下步驟:
步驟四:雜交
將第二熒光基團(tuán)標(biāo)記的待測(cè)序列與質(zhì)量合格的基因芯片上點(diǎn)樣的斑點(diǎn)中的目的探針在高溫T2下進(jìn)行雜交，高溫T2范圍為20~60° C，雜交后，目的探針中的探針和待測(cè)序列結(jié)合形成第二雜交產(chǎn)物；
步驟五:確定待測(cè)序列的序列信息
對(duì)所述第二雜交產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下檢測(cè)到熒光，則確定目的探針與待測(cè)序列互補(bǔ)，并確定待測(cè)序列的序列信息；
若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下未檢測(cè)到熒光，則表示不能確定目的探針與待測(cè)序列互補(bǔ)，無法確定待測(cè)序列的序列信息。
[0010]所述的低溫和高溫相差不小于10° C。
[0011]所述的目的探針是脫氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
[0012]所述的基片為玻璃片、硅膠晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微型磁珠或者管蓋。
[0013]所述的第一熒光基團(tuán)和所述的第二熒光基團(tuán)可為Cy3、Cy5、Fite, FAM或者Rhodamine，但是所述的第一熒光基團(tuán)和所述的第二熒光基團(tuán)使用時(shí)不相同，并且在檢測(cè)時(shí)兩種熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射峰要大于40nm的差異，防止兩者在檢測(cè)時(shí)由于吸收峰重疊而無法正確得出結(jié)果。
[0014]所述的第一熒光基團(tuán)和第二熒光基團(tuán)為生物素-親和素與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記復(fù)合物。
[0015]所述的標(biāo)記物質(zhì)為熒光蛋白、鐵蛋白、膠體金、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
[0016]本專利所提的目的探針是一段已知的核酸或核酸類似物序列片斷，并在核酸或核酸類似物鏈上修飾了活性基團(tuán)，可通過化學(xué)反應(yīng)固定在被修飾手臂分子的基底上；寡聚體序列是一段已知的、較短核酸或核酸類似物序列片斷，末端標(biāo)記了發(fā)光基團(tuán)或標(biāo)記復(fù)合物；待測(cè)序列是一段未知的核酸或核酸類似物序列片斷，末端標(biāo)記了發(fā)光基團(tuán)或標(biāo)記復(fù)合物；手臂分子是多個(gè)碳原子組成兩端均含有活性基團(tuán)的小分子有機(jī)化合物，一端活性基團(tuán)可與基底發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，另一端活性基團(tuán)可與修飾了活性基團(tuán)的核酸或核酸類似物鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
I)傳統(tǒng)的檢測(cè)，只是把一定濃度的質(zhì)量控制探針固定在目的探針的周圍，質(zhì)量控制探針與目的探針分開點(diǎn)樣于基片上，沒有考慮到目的探針與待測(cè)DNA序列的雜交通常位于固相表面，有一定程度的空間阻礙，若目的探針濃度過高，導(dǎo)致目的探針固定不上去，而本發(fā)明是先將目的探針與第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡聚體序列雜交，為后續(xù)目的探針與待測(cè)DNA序列的提供雜交空間位置，這樣大大方便了待檢測(cè)的DNA序列與目的探針雜交。
[0018]2)目的探針與標(biāo)記第一熒光的寡聚體序列混合，點(diǎn)樣，雜交，因目的探針和寡聚體序列互補(bǔ)，存在分子之間的力，通過檢測(cè)第一種熒光，可確定目的探針是否通過手臂分子結(jié)合在基片上，保證了芯片制作的質(zhì)量，這種方式也達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)芯片的有效性。
[0019]3)因寡聚體序列相對(duì)于目的探針較短，低溫0~30 ° C時(shí)，目的探針與與標(biāo)記第一熒光的寡聚體序列雜交，高溫20~60 ° C時(shí)，目的探針與標(biāo)記第二熒光基團(tuán)的待測(cè)序列雜交，通過雜交溫度的控制達(dá)到與目的探針雜交與寡聚體序列還是待測(cè)序列的類型，設(shè)計(jì)精巧，操作簡便。
[0020]4)本發(fā)明檢測(cè)基因芯片有效性的方法，若應(yīng)用于基因芯片制備中，則能夠大大提高基因檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性；同時(shí)，不僅可以為基因芯片的制造者提供有效性控制的方法，提高生產(chǎn)質(zhì)量，又可以為基因芯片的使用者在使用之前對(duì)芯片做出評(píng)價(jià)，簡單有效地查出實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題，從而減少了實(shí)驗(yàn)中的分析過程，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
【附圖說明】
[0021]圖1為現(xiàn)有技術(shù)中的基因芯片有效性的方法的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2 Ca)為本發(fā)明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法低溫下的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2 (b)為本發(fā)明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法高溫下的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3 (a)為本發(fā)明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法低溫下結(jié)構(gòu)局部放大示意圖；
圖3 (b)為本發(fā)明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法高溫下結(jié)構(gòu)局部放大示意圖。
[0022]圖中:1、第一熒光基團(tuán)，2、第二熒光基團(tuán)，3、目的探針，4、寡聚體序列，5、待測(cè)序列，6、手臂分子，7、基片，8、質(zhì)量控制探針。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0024]本發(fā)明基于溫度差異性探針基因芯片檢測(cè)方法，包括以下幾個(gè)步驟: 1、樣品制備:
如圖2 a、2b、3a、3b所示，制備含有目的探針3的溶液和第一熒光基團(tuán)I標(biāo)記的寡聚體序列4的溶液；并將上述目的探針3的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記I標(biāo)記的寡聚體序列4的溶液充分混合，制備成點(diǎn)樣溶液；
2、基因芯片制備
將上述混合后的點(diǎn)樣溶液點(diǎn)樣于修飾了手臂分子6的基片7上形成N個(gè)探針斑點(diǎn)，N為自然數(shù)，經(jīng)固定，在低溫1\下，低溫T1范圍為0~30 ° C，所述所有探針斑點(diǎn)中目的探針3與第一熒光基團(tuán)I標(biāo)記的寡聚體序列4發(fā)生雜交反應(yīng)，獲得每個(gè)探針斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液；清除未固定的探針3和未雜交的寡聚體序列4，完成基因芯片的制備；
3、通過檢測(cè)寡聚體序列4的信號(hào)檢測(cè)目的探針3通過手臂分子6固定在基片7上: 檢測(cè)上述所有第一雜交產(chǎn)物溶液發(fā)出的熒光信號(hào)，若在第一熒光基團(tuán)I的激發(fā)波長下檢測(cè)到熒光，則表示寡聚體序列4通過手臂分子6固定在基片7上，同時(shí)說明目的探針3通過手臂分子6固定在基片7上，從而判定基因芯片質(zhì)量合格；
否則，若任一個(gè)探針斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液在第一熒光基團(tuán)I的激發(fā)