棉花零式果枝基因的分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種零式果枝基因鑒定和分子標(biāo)記輔助育種 的分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 零式果枝是指棉花中果枝為有限果枝的一種突變性狀。表現(xiàn)為棉桃直接著生在主 莖葉腋處，或僅有一個(gè)果節(jié)。零式果枝材料由于其生長(zhǎng)特性，在棉花打頂之后，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)基 本停止，可以減少對(duì)棉花整枝管理的用工。同時(shí)由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大部分供給棉鈴的生長(zhǎng)發(fā)育， 棉鈴發(fā)育快，成熟早，單株上部和下部的棉桃有更好的成熟一致性，利于棉花的收獲。零式 果枝品種的棉鈴具有合理的空間分布，上中下部的棉鈴基本均勻分布，具有優(yōu)良的機(jī)械采 收特性。在長(zhǎng)江流域，種植零式果枝材料相比雜交棉，在管理過(guò)程中可以省工75個(gè)/公頃， 節(jié)省用工成本4500元/公頃，減少防病蟲(chóng)用藥等生產(chǎn)成本1500元/公頃，共計(jì)可節(jié)省投入 6000元/公頃。
[0003] 由于零式果枝品種具有適于密植、明顯減少管理用工，降低成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，適于 機(jī)械收獲的特點(diǎn)，攜帶零式果枝基因的棉花品種早已在我國(guó)生產(chǎn)上開(kāi)始應(yīng)用。但是，采用常 規(guī)育種技術(shù)選育和改良零式果枝材料需要很長(zhǎng)年限，且由于零式果枝為單隱性遺傳，每次 回交轉(zhuǎn)育后都需要進(jìn)行自交鑒定，以確零式果枝基因在轉(zhuǎn)育和改良過(guò)程中沒(méi)有丟失，從而 需要耗費(fèi)大量的棉田、人力和財(cái)力。因此，如何通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇方法穩(wěn)定可靠又快速 簡(jiǎn)便的進(jìn)行零式果枝材料的選育和改良成為本發(fā)明的關(guān)鍵核心。
[0004] 分子標(biāo)記直接從DNA水平反映出核苷酸序列的差異，它不受發(fā)育階段、環(huán)境因素 以及基因是否表達(dá)的影響，具有數(shù)量非常豐富，遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)。目前，隨著分子生物學(xué)的 飛速發(fā)展，分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選，比較常用的 有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng) 用，目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)越來(lái)越多的將各種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在作物育種材料的分子標(biāo)記輔 助選擇育種中。SNP(Single nucleotide polymorphisms)主要是指在基因組水平上由單 個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在所有真核生物基因組中均存在并且含量非常 豐富，具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、位點(diǎn)專一性、共顯性等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中含零式果枝基因的棉花品系選育田間鑒定檢測(cè) 方法所需時(shí)間長(zhǎng)，消耗大、準(zhǔn)確性差等的問(wèn)題，提供一種零式果枝基因的分子鑒定方法，從 而可以加快零式果枝品系選育和改良進(jìn)程。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明以棉花零式果枝基因的位于第4外顯子的第33 個(gè)堿基處的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)圖1。該SNP位點(diǎn)導(dǎo)致零式果枝基因功能的缺失，在這個(gè) SNP位點(diǎn)堿基為T的即為零式果枝材料。因此，這個(gè)SNP位點(diǎn)與性狀100%共分離，不會(huì)發(fā)生 交換。設(shè)計(jì)引物為： THOl引物對(duì)： 正向引物 5' - CAGATGCCACATTTGGTAAG-3'（SEQ ID No. 1) 反向引物 5' - CTGTGGATCCCTATGTTAGA-3'（SEQ ID Νο·2) 一種棉花零式果枝基因的分子鑒定方法，包括如下步驟： 步驟（1 )，對(duì)棉花進(jìn)行DNA提取； 步驟（2)，以SEQ ID No. 1所示正向引物和SEQ ID No. 2所示反向引物對(duì)步驟（1)得到 的 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，95°C 預(yù)變性 2min，94°C 變性 30sec，55°C 退火 45sec，72°C 延伸 45sec， 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存； 步驟（3)，對(duì)步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并采用銀染的方法染色，若在 195bp處出現(xiàn)特異性條帶，則含零式果枝基因；若無(wú)特異性條帶，則不含零式果枝基因。
[0007] 本發(fā)明技術(shù)方案中對(duì)棉花進(jìn)行DNA提取的具體方法為： 取棉花材料真葉期幼嫩葉片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于離心管中，然后向離心管中 加入ΙΟΟΟμΙ?ΝΑ提取液，混勻后，65°C水浴30min，且每間隔IOmin輕搖下；所述的DNA提取 液中含有：〇.〇5M Tris-Cl，0.01 M EDTA，2% SDS，1% PVP，0.5% 山梨醇，0.705M NaCl 和 1% β -巰基乙醇，pH值為8. 0,高壓滅菌；其中，1% β -巰基乙醇為使用前加入，體系中的％代 表體積分?jǐn)?shù)； 水浴結(jié)束后，再向離心管中加入80〇μ1苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，混合溶劑中苯 酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1，混合均勻后，離心分離； 吸取上清液，加入2μ1濃度為10mg/ml RNase酶，混勻后，37°C水浴30min ;然后再加 入ιοοομ?苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，混合溶劑中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為 25:24:1，混合均勻后，離心分離； 取上清液，加入體積為上清液體積〇. 7倍的異丙醇，靜置30min，絮狀DNA成團(tuán)析出； 將絮狀DNA取出，用體積濃度為70%的乙醇浸泡,浸泡兩次,每次IOmin,再用無(wú)水乙醇 浸泡過(guò)夜后，倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入ddH 20,溫室溶解2h，測(cè)定濃度后稀釋到25ng/ μ1，-20?保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的離心分離的速度為12000rpm，時(shí)間為10min。
[0009] 本發(fā)明技術(shù)方案中步驟（2)具體方法如下： 取?μ?濃度為25ng/^l的DNA溶液與9μ1 PCR反應(yīng)液混合，進(jìn)行PCR反應(yīng)；其中，PCR反 應(yīng)液中含有以下物質(zhì)：l〇XPCR Buffer L 〇μ1，IOmM dNTPs 0·2μ1，25πιΜ MgCL2 0·8μ1，IOmM SEQ ID No. 1 所示正向引物(λ 5μ1，IOmM SEQ ID No. 2 所示反向引物(λ 5μ1，2υ/μ1 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ1 和 CldH2O 5. 8μ1。
[0010] 本發(fā)明技術(shù)方案中步驟（3)具體方法如下： 向步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μ1溴酚藍(lán)混勻，制備質(zhì)量濃度為6%的聚丙烯酰 胺凝膠，在IXTBE的電泳緩沖液中電泳檢測(cè)，電泳電壓為220伏，電流為164毫安，時(shí)間為 50min ;電泳結(jié)束后采用銀染的方法進(jìn)行染色，具體步驟如下：固定液中固定IOmin ;染色液 中染色12min ;用蒸饋水快速洗兩遍,在顯色液中顯色5min,直至條帶清晰為止；蒸饋水速 洗兩遍，放入終止液中終止反應(yīng)；若在195bp處出現(xiàn)特異性條帶，則為零式果枝；若無(wú)特異 性條帶，則不為零式果枝； 其中，所述的固定液為40ml體積濃度為95%的乙醇、2ml的純乙酸和358ml的蒸餾水 的混合溶液；所述的染色液的制備方法為將〇. 6g硝酸銀溶于300ml蒸餾水，即得；所述的 顯色液的制備方法為先將6g氫氧化鈉和5ml甲醛加入400ml蒸餾水中混合均勻后，再加入 3ml的質(zhì)量濃度為0. 2%的硫代硫酸鈉水溶液，混合均勻，即得；所述的終止液的制備方法為 將3g碳酸鈉溶于400ml蒸餾水，即得。
[0011] 正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0012] 本發(fā)明采用SNP標(biāo)記對(duì)含零式果枝材料進(jìn)行了分子水平的多態(tài)性檢測(cè)，從本研究 的結(jié)果中可以看出，標(biāo)記鑒定的結(jié)果條帶清晰、穩(wěn)定、可靠，因此該方法非常適用于含零式 果枝材料真實(shí)性的室內(nèi)鑒定和新零式果枝材料的分子標(biāo)記輔助選育。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為： (1)速度快：基因特異標(biāo)記鑒定對(duì)輔助選育零式果枝基因的棉花品系具有重要作用。在 零式果枝的回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中，涉及大量的自交鑒定等試驗(yàn)，并且需要調(diào)查大量的外部性狀， 需要投入大量的時(shí)間、人力和物力，且易受環(huán)境因素影響，因此，常規(guī)手段并不能完全準(zhǔn)確、 真實(shí)地反映零式果枝材料的遺傳情況。本發(fā)明只需提供棉花材料的種子或葉片，提取DNA 后，用基因特異引物對(duì)進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，利用相應(yīng)分子鑒定體系可以很快地鑒定出零式 果枝基因，同時(shí)利用本發(fā)明可以在零式果枝育種的分子標(biāo)記輔助選擇過(guò)程中有效跟蹤零式 果枝基因的存在與否，免去自交鑒定，從而極大加快零式果枝選育和改良過(guò)程。
[0014] (2)準(zhǔn)確率高：本發(fā)明的基因特異標(biāo)記具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，很容 易通過(guò)PCR快速擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。本發(fā)明利用一對(duì)基因特異引物對(duì)零式果 枝進(jìn)行鑒定，其與零式果枝性狀完全共分離，可靠性高，且分子鑒定不受環(huán)境因素的影響， 真正從DNA水平上鑒定零式果枝的遺傳情況，提高了準(zhǔn)確性。
[0015] (3)實(shí)用簡(jiǎn)單：本發(fā)明鑒定零式果枝基因和分子標(biāo)記輔助選擇育種的整個(gè)程序只 是幾次機(jī)械式的加樣過(guò)程，易于操作，具有很好的商業(yè)化應(yīng)用前景。
[0016] 總之，本發(fā)明提供的基因特異標(biāo)記及其引物能夠快速鑒定攜帶零式果枝基因的棉 花品系，其鑒定方法簡(jiǎn)單實(shí)用，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，所以本發(fā)明提供的基因特異標(biāo)記及其 引物能夠快速有效的輔助棉花育種，對(duì)推動(dòng)育種進(jìn)程起了決定性的作用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明基因特異引物在基因位置的示意圖； 圖2為本發(fā)明零式果枝材料及其后代的基因特異標(biāo)記分析；其中，M :marker，1 :零式 果枝品種"新海18"，2 :正常果枝品系"ΤΜ-1"，3-32 :從新海18XTM-1的群體中隨機(jī)選取的 30株零式果枝單株。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為