專利名稱：郁金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關(guān)鍵酶及其編碼基因和探針，具體地，涉及一種郁金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針。
背景技術(shù)：
花是植物重要的生殖器官，花色是植物正常繁育后代的前提，也是觀賞植物重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值所在。研究花色物質(zhì)代謝的分子機(jī)理是為選育新異花色花卉品種的基礎(chǔ)?；ǘ涞念伾腔ㄉ胤e累的結(jié)果?；ㄉ刂饕慄S酮、類胡蘿卜素以及甜菜堿類。類黃酮的生物合成途徑是目前研究的最深入的代謝途徑之一。類黃酮生物合成途徑主要由兩類基因控制:結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。其中，結(jié)構(gòu)基因直接編碼與類黃酮次生代謝生物合成有關(guān)的各種酶類，而調(diào)節(jié)基因則是控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)方式的一類基因。調(diào)節(jié)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子中含有的能被其識(shí)別的順式作用元件結(jié)合，從而激活類黃酮生物合成途徑中多個(gè)基因的表達(dá)，有效地啟動(dòng)類黃酮生物合成途徑。因此，調(diào)節(jié)基因能一定程度上調(diào)節(jié)特定次生代謝物的形成。盡管利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將控制類黃酮次生代謝的關(guān)鍵酶基因或其反義序列導(dǎo)入植物能促進(jìn)或抑制該基因的表達(dá)，改變了類黃酮次生代謝途徑，改變花色，但植物類黃酮生物合成途徑復(fù)雜，涉及酶種類繁多，并不是個(gè)別關(guān)鍵酶所控制。通過轉(zhuǎn)錄因子作用，有可能激活類黃酮次生代謝途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，達(dá)到的效果將比導(dǎo)入某個(gè)結(jié)構(gòu)基因的作用更明顯。目前已在一些植物中發(fā)現(xiàn)了調(diào)控類黃酮生物合成途徑的調(diào)節(jié)基因，并且用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法等技術(shù)克隆了部分編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，其中MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是研究的最為廣泛的，它能調(diào)控類黃酮合成途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的共同特征是含有MYB結(jié)構(gòu)域，MYB結(jié)構(gòu)域在不同物種之間是高度保守的。郁金香遺傳分子基礎(chǔ)研究很少，目前NCBI上只登記郁金香屬(Tulipa) 245條核酸序列，其中與花色相關(guān)的基因有5個(gè)。郁金香中MYB蛋白編碼基因序列及表達(dá)模式尚不清楚，也未有任何與郁金香MYB蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)郁金香MYB基因家族成員的克隆、表達(dá)模式分析以及郁金香MYB蛋白的空白，提供了一種郁金香MYB蛋白TfMYB2，本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列以及檢測(cè)所述核酸序列的探針；本發(fā)明公開了郁金香TfMYB2蛋白及其核酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。通過分析TfMYB2基因與類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式，推測(cè)TfMYB2基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。本發(fā)明為利用基因工程技術(shù)，通過調(diào)節(jié)TfMYB2基因的表達(dá)，從而調(diào)控類黃酮生物合成途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，或?qū)fMYB2基因在另外不同的植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，有效地提高或降低轉(zhuǎn)基因植物中類黃酮的含量，達(dá)到改變花色的目的提供了基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
一方面，本發(fā)明提供了一種具有郁金香MYB蛋白活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香MYB蛋白活性的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在花朵的不同發(fā)育階段、不同器官內(nèi)的有無及活性大小存在較大差異。優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列經(jīng)過I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中I 10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。優(yōu)選的，所述核酸序列具體為:(a)堿基序列如SEQ ID N0.3第I 657位所示；或(b)與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(0)能與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸序列中I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的序列。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8 100個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼郁金香MYB蛋白相關(guān)的核酸分子。在本發(fā)明中，“分離的DNA”、“純化的DNA”是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語 “郁金香TfMYB2蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香MYB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示的第I 657位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID N0.3所示的第I 657位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQID N0.3所示的第I 657位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ IDN0.4所示的序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼天然郁金香MYB蛋白的相同功能、SEQ ID N0.3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以內(nèi)核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“郁金香TfMYB2蛋白”指具有郁金香TfMYB2蛋白活性的SEQIDN0.4所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然郁金香TfMYB2蛋白相同功能的、SEQIDN0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或?yàn)?0個(gè)以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括郁金香TfMYB2蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的郁金香TfMYB2蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與郁金香TfMYB2相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfMYB2蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“郁金香TfMYB2保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表I
權(quán)利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由如SEQID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香TfMYB2蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.按權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.4所示氨基酸序列經(jīng)過I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
3.按權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.4所示氨基酸序列中I 10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
5.按權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為: Ca)堿基序列如SEQ ID N0.3第I 657位所示； 或(b)與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.3第I 657位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
6.按權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID N0.3第I 657位所示的核酸序列中I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5 ^和/或:V端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的序列。
7.一種用于檢測(cè)如權(quán)利要求4所述核酸序列的探針，其特征在于，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種郁金香TfMYB2蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質(zhì)為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香MYB蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及檢測(cè)上述核酸序列的探針；本發(fā)明為利用基因工程技術(shù)，通過調(diào)節(jié)TfMYB2基因的表達(dá)來調(diào)控類黃酮生物合成途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，或?qū)fMYB2基因在另外不同的植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，有效提高或降低轉(zhuǎn)基因植物中類黃酮的含量，達(dá)到改變花色的目的提供了基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103087168SQ20131000261
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)