一種能預(yù)防禽流感的藻類(lèi)飼料與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種能預(yù)防禽流感的藻類(lèi)飼料與應(yīng)用，公開(kāi)了一種人工合成的經(jīng)萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因，構(gòu)建了適于在萊茵衣藻中表達(dá)禽流感抗原基因的重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入到宿主萊茵衣藻，獲得的轉(zhuǎn)基因萊菌衣藻，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明食用所述轉(zhuǎn)基因萊菌衣藻的小鼠可產(chǎn)生禽流感抗體，是一種具有廣闊的應(yīng)用前景的能預(yù)防禽流感的藻類(lèi)飼料。
【專利說(shuō)明】一種能預(yù)防禽流感的藻類(lèi)飼料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能預(yù)防禽流感的藻類(lèi)飼料、其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來(lái)，有關(guān)數(shù)據(jù)和事實(shí)表明，僅對(duì)于亞洲來(lái)說(shuō)，爆發(fā)一個(gè)相對(duì)比較溫和的禽流感，損失900-1100億美元。如果是全球的禽流感大爆發(fā),可能會(huì)對(duì)造成全球經(jīng)濟(jì)衰退。同時(shí)，據(jù)經(jīng)濟(jì)學(xué)家估計(jì)，當(dāng)處在禽流感爆發(fā)的時(shí)期，禽流感對(duì)受害地區(qū)的貿(mào)易和旅游業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失也是無(wú)法用數(shù)字衡量的。從上個(gè)世紀(jì)爆發(fā)的四次世界性流感中，有三次給人類(lèi)帶來(lái)了極大的傷害，即為在1918年西班牙爆發(fā)的甲型流感病毒的傳播、在1957年爆發(fā)的甲2 (H2N2)亞型流感病毒的傳播和1968年爆發(fā)的的甲3 (H3N2)亞型流感的傳播，并造成了社會(huì)的動(dòng)蕩，直接經(jīng)濟(jì)損失過(guò)百億美元。從1878年意大利爆發(fā)禽流感以來(lái)，H5、H7禽流感亞型病毒株在世界各地時(shí)有時(shí)無(wú)的檢測(cè)到有他們對(duì)當(dāng)?shù)厍蓊?lèi)的感染并造成流感爆發(fā)和流行。例如，在美國(guó)1978年明尼蘇達(dá)州有40多個(gè)火雞群爆發(fā)禽流感，直接造成政府500多萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失。又如1983年在美國(guó)賓夕法尼亞州爆發(fā)了 H5N2病毒株引起的禽類(lèi)大量死亡，直接使1900多萬(wàn)只火雞死亡，當(dāng)?shù)丶爸苓吳蓊?lèi)養(yǎng)殖農(nóng)場(chǎng)全部倒閉，造成6500萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)1997年香港特別行政區(qū)新界多個(gè)養(yǎng)殖農(nóng)場(chǎng)爆發(fā)了由H5N1亞型毒株引起的流感傳播，造成多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)倒閉，9000只雞、鴨等禽類(lèi)的突然死亡。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)也時(shí)有報(bào)道禽流感的傳播，雖然對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)沒(méi)有產(chǎn)生大的負(fù)面影響，但是已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，雖然在市面上已經(jīng)有了一些免疫疫苗和抗病毒藥物，也取得了一些較好的療效，但是，這些藥物也有一定的局限性，并且成本較高、價(jià)格昂貴、供應(yīng)有限，導(dǎo)致市場(chǎng)化商品價(jià)格難以取得消費(fèi)者滿意。因此，許多學(xué)`者和國(guó)內(nèi)外專家就把目光轉(zhuǎn)移到生物學(xué)手段，利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)出具有免疫原性的、可食性的禽流感植物疫苗。
[0003]禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)俗稱真性雞痕,是由禽流感病毒引起的一種流行于禽類(lèi)之中的一種高致病烈性傳染病。多呈球形，一般直徑在80~120nm之間，由一個(gè)內(nèi)部的核衣殼和囊膜組成，在囊膜的表面分布著許多放射狀排列的纖維突出。根據(jù)蛋白抗原性的不同，可以將病毒分為15個(gè)H亞型和9個(gè)N亞型。主要經(jīng)呼吸道傳播，也可從禽類(lèi)的排泄物、分泌物以及食用被病毒污染的水源傳播。迄今為止，還沒(méi)有確實(shí)的證據(jù)證明禽流感病毒直接可以感染人類(lèi)，也沒(méi)有人與人之間直接傳播的例子。國(guó)際獸疫中心已經(jīng)將禽流感列為I類(lèi)傳染病，各國(guó)農(nóng)業(yè)部也已經(jīng)將其列為甲類(lèi)監(jiān)測(cè)傳染病。
[0004]完整的禽流感病毒包含內(nèi)中外三層結(jié)構(gòu)，其中外層的雙層脂囊膜有兩種糖蛋白纖突，即為血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA),其比例在在4:1至5:1之間。病毒具有侵染性，首先必須將宿主蛋白酶裂解為HAl和HA2，其次裂解后的HA2暴露出疏水區(qū)，并且與宿主細(xì)胞膜的脂雙層相互結(jié)合，所以禽流感病毒具有致病性HA被裂解為HAl和HA2是非常關(guān)鍵的。在病毒的內(nèi)層和中層還包含著有核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(MA)、聚合酶和非結(jié)構(gòu)蛋白[8-11]。其中核蛋白是核衣殼的主要構(gòu)成成份，在病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯中起著重要作用。基質(zhì)蛋白是一種非糖基化蛋白，存在于囊膜的內(nèi)側(cè)，也可以叫它內(nèi)膜蛋白，它在病毒粒子的裝配和釋放過(guò)程中發(fā)揮著作用。聚合酶由PA、PB1和PB2三種亞基組成，在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中三者隨復(fù)制或轉(zhuǎn)錄鏈的延長(zhǎng)而移動(dòng)，可以推測(cè)三者共同構(gòu)成了 RNA聚合體。非結(jié)構(gòu)蛋白可編碼NSl和NS2，其中NS2在后期復(fù)制，而NSl則病毒侵染的早期大量復(fù)制，從而參與細(xì)胞核的侵染工作。這里主要對(duì)血凝素和神經(jīng)氨酸酶的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)理進(jìn)行分析。
[0005]從上個(gè)世紀(jì)開(kāi)始，轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)就廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，從而培育出一些高性能的抗逆、高產(chǎn)的農(nóng)業(yè)新品種，從傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)中突破出來(lái)。從本世紀(jì)開(kāi)始，人們的視野又有了新的轉(zhuǎn)變，不僅僅將轉(zhuǎn)基因植物作為普通食品來(lái)對(duì)待，而是利用植物作為生產(chǎn)加工的場(chǎng)所，開(kāi)發(fā)出一些生物藥品，從而服務(wù)于人類(lèi)。轉(zhuǎn)基因疫苗的提出就是其中之一。他是利用植物基因工程技術(shù)和免疫學(xué)知識(shí)，選取某種植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)出能夠使機(jī)體在服用后得到特異性抗病能力的疫苗。在當(dāng)前，對(duì)各種傳染病的防治主要是以接種疫苗來(lái)防治，但是，現(xiàn)在這些疫苗的生產(chǎn)和注射都存在很多弊端，比如說(shuō)其生產(chǎn)工藝復(fù)雜、不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，其次在免疫注射的時(shí)候往往由于針頭的消毒工作不徹底而容易引起交叉感染。但是，選用植物作物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服植物疫苗就免去了這些后顧之憂。首先，植物屬于高等生物，有著高等生物的修飾免疫系統(tǒng)，同時(shí)植物的種植和培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不需要特別的技術(shù)和巨大的投資，對(duì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸也沒(méi)有太多的要求。其次，采用植物作為生物反應(yīng)器相對(duì)比較安全，重組出的蛋白經(jīng)糖基化、磷酸化等修飾后不會(huì)對(duì)人類(lèi)造成巨大傷害，相反，利用動(dòng)物作為生物反應(yīng)器不等對(duì)真核蛋白進(jìn)行正確的加工，容易引起許多病原菌的產(chǎn)生，造成疾病傷害(Hiatt A, Caferkey R, Bowdish B.Production of antibodies in transgenetisplants[J].Nature, 1989，342:76-78 ;Mason HS, Ba UJM, s1.ExPression of Norwalk viruscapsid protein in ransgenic tobacco and potato and its oral imrauno genieiryin miee[J], Pro Natl Aead Sci USA, 1996，93:5335_5340)。最后，轉(zhuǎn)基因植物能夠?qū)ν庠椿蜻M(jìn)行準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄、翻譯等加工修飾。通過(guò)有性或者無(wú)性繁殖穩(wěn)定的遺傳給后代。目前，已經(jīng)有很多病毒基因和細(xì)胞因子通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段在水稻、馬鈴薯或煙草等植物中得到表達(dá)，并且得到很好的植物基因疫苗效`果。比如說(shuō)，在1992年，Mason和他的團(tuán)隊(duì)在煙草中就對(duì)乙型肝炎病毒的表面抗原進(jìn)行成功的表達(dá)，并得到成功(Mason HS, Lam DM, ArntaenCJ.Expresion of hepatitis Bsurface antigen in transgenic plants.Proc Natl AcadSci USA, 1992,89(24):11745-9.)。1995年，Verwoerd等人，成功的將植酸酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入油菜中，經(jīng)過(guò)對(duì)植酸酶的檢測(cè)，在第15代中同樣可以檢測(cè)到植酸酶的存在。在2008年，McCormick等在煙草中表達(dá)了抗非霍奇金病淋巴瘤抗獨(dú)特型ScFv,通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn),檢測(cè)出小鼠產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。同時(shí)也進(jìn)行了人體免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物更易對(duì)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
[0006]萊茵衣藻是一種蛋白含量高、生長(zhǎng)速率快、營(yíng)養(yǎng)配比合理并且無(wú)內(nèi)毒素產(chǎn)生和無(wú)任何毒副作用的可食用動(dòng)物飼料，被認(rèn)為是最理想的可食性基因工程疫苗受體生物。此外，萊茵衣藻自身在光照培養(yǎng)下能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)，并且在黑暗條件下能進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，它擁有兩根鞭毛，能在水中自由游動(dòng)(Rochaix JD.Chlamydomonas reinhardtii as thephotosynthetic yeast [J].Annu Rev Genet, 1995，29:209-230.)。從上個(gè)世紀(jì)以來(lái)，萊茵衣藻作為模式生物在分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、葉綠體起源、線粒體功能、生理節(jié)律和趨光性等領(lǐng)域的研究起著重要作用(Harris E.Chlamydomonas as amodel organism [J].AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol, 2001，52:363-406.)。然而，現(xiàn)有技術(shù)中尚不存在有關(guān)使用萊茵衣藻作為宿主來(lái)表達(dá)禽流感抗原基因的技術(shù)方案或相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種經(jīng)萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因，具有選自如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有所述禽流感抗原基因的重組表達(dá)載體。所述的重組表達(dá)載體，為選自pH124HAVl、pNCFHAV2、pH423HAV3，分別具有如圖1、圖2和圖3所示的結(jié)構(gòu)。
[0009]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有所述經(jīng)萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻；所述的轉(zhuǎn)基因衣藻在制備畜禽飼料添加劑中的用途，尤其是具有禽流感疫苗作用的畜禽飼料添加劑；并進(jìn)一步提供了所述重組表達(dá)載體在制備可食性轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻禽流感疫苗中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的制備方法及由所述制備方法獲得的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。所述制備方法包括以下三種具體操作方法:
[0011]1.一種表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)合成并擴(kuò)增萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1 所 示；
[0013](2)將萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因與萊茵衣藻細(xì)胞核遺傳轉(zhuǎn)化載體PH124可操作地連接，獲得萊茵衣藻細(xì)胞核遺傳轉(zhuǎn)化載體pH124HAVl，其中所述PH124HAV1具有如圖1所示的結(jié)構(gòu)；
[0014](3)采用珠磨法，將pH124HAVl轉(zhuǎn)化到萊菌衣藻細(xì)胞核中；
[0015](4)培養(yǎng)和篩選表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊菌衣藻。
[0016]2.一種表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的制備方法，包括以下步驟:
[0017](I)合成并擴(kuò)增萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因，其核苷酸序列如SEQID N0.3 所示；
[0018](2)將萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因與萊茵衣藻線粒體遺傳表達(dá)載體pNCF可操作地連接，獲得萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化載體PNCFHAV2，其中所述pNCFHAV2具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)；
[0019](3)采用基因槍法，將PNCFHAV2轉(zhuǎn)化到萊菌衣藻線粒體中；
[0020](4)培養(yǎng)和篩選表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊菌衣藻。
[0021]3.一種表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的制備方法，包括以下步驟:
[0022](I)合成并擴(kuò)增萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因，其核苷酸序列如SEQID N0.5 所示；
[0023](2)將萊茵衣藻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的禽流感抗原基因與載體p423可操作地連接，獲得萊茵衣藻葉綠體遺傳表達(dá)盒5’atpA::HAV3:: 3’rbcL,再與載體pH423可操作地連接獲得萊茵衣藻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化載體PH423HAV3，其中所述pH423HAV3具有如圖3所示的結(jié)構(gòu)；
[0024](3)采用電擊轉(zhuǎn)化法，將pH423HAV3轉(zhuǎn)化到萊菌衣藻葉綠體中；[0025](4)培養(yǎng)和篩選表達(dá)禽流感抗原基因的轉(zhuǎn)基因萊菌衣藻。
[0026]為了實(shí)現(xiàn)上述目的轉(zhuǎn)基因受體，本發(fā)明的具體方案如下:
[0027]萊茵衣藻藻株的篩選:在進(jìn)行萊茵衣藻外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的同時(shí)，不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法可以選擇萊茵衣藻不同的品系來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，例如采用“基因槍”或者“電擊轉(zhuǎn)化法”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，可以選擇細(xì)胞壁缺陷型或非細(xì)胞壁缺陷型的萊茵衣藻藻株，如果采用“珠磨法”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，則可以選擇細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻這樣有助于提高外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化效率(CN101255438A)。在轉(zhuǎn)基因受體藻株篩選標(biāo)記的選擇中，以上幾種遺傳轉(zhuǎn)化方法均可以選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型藻株或抗生素篩選標(biāo)記。在本發(fā)明的實(shí)施案例中，選擇的是基因缺陷型或細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻作為轉(zhuǎn)基因受體藻株。萊茵衣藻是一種蛋白含量高、生長(zhǎng)速率快、營(yíng)養(yǎng)配比合理并且無(wú)內(nèi)毒素產(chǎn)生和無(wú)任何毒副作用的單細(xì)胞真核生物。萊茵衣藻的培養(yǎng):本發(fā)明選擇了 Tris-acetate-phosphate (TAP)培養(yǎng)基作為萊茵衣藻的培養(yǎng)基。選擇IL的配制方法為例，先選擇好適當(dāng)?shù)娜萜骷尤?75mL去離子水，然后加入ImLlM(K)POj^沖溶液、2.42gTris>25mL4XBeijerinck salts、ImL Trace微量元素混合溶液,并使用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值到6.98~7.02。從藻種室將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的萊茵衣藻單藻落從固體TAP平板中接種到新鮮無(wú)菌的液體TAP培養(yǎng)基中，在22°C、2000LUX連續(xù)光照強(qiáng)度下靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。
[0028]人工對(duì)外源目的基因的合成:選擇的外源目的基因即為適合于在萊茵衣藻中表達(dá)的禽流感抗原基因(GenBank登錄號(hào):AY609312)。根據(jù)禽流感抗原基因序列(GenBank登錄號(hào):AY609312)和萊茵衣藻基因組偏愛(ài)密碼子，對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化出合適于在萊茵衣藻中能夠高效表達(dá)的禽流感抗原基因，同時(shí)采用人工合成的方法合成該基因；所述適合于萊茵衣藻表達(dá)的禽流感抗原基可以為適合于萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)的禽流感抗原基因、適合于萊茵衣藻線粒體表達(dá)的禽流感抗原基因、適合于萊茵衣藻葉綠體表達(dá)的禽流感抗原基因。
[0029]構(gòu)建含有所述的外源目的基因的萊茵衣藻表達(dá)載體:所述表達(dá)載體可以為禽流感抗原基因萊茵衣藻細(xì)胞核遺傳表達(dá)載體、禽流感抗原基因萊茵衣藻線粒體遺傳表達(dá)載體、禽流感抗原基因萊茵衣藻葉綠體遺傳`表達(dá)載體。為提高外源禽流感抗原基因在萊茵衣藻細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)量，在細(xì)胞核表達(dá)載體Phl24中接入了一段非編碼區(qū)RBCS2內(nèi)含子(CN101255438A)，當(dāng)外源目的基因與合適的真核表達(dá)載體重組后可以表達(dá)出相應(yīng)的目的蛋白。在真核表達(dá)過(guò)程當(dāng)中，可以依賴宿主細(xì)胞的特性將RBCS2剪切，知道成熟的mRNA的合成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)萊茵衣藻細(xì)胞核偏愛(ài)密碼子替換并人工合成的外源目的基因?yàn)镠AVl基因，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，人工合成的HAVl基因在其3’末端帶有6個(gè)組氨酸親和標(biāo)記，有利于對(duì)重組的禽流感抗原蛋白進(jìn)行親和層析純化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，含有外源目的基因HAVl的禽流感抗原基因萊茵衣藻細(xì)胞核遺傳表達(dá)載體為PH124HAV1，其構(gòu)建過(guò)程如下:從含有外源目的基因的質(zhì)粒Puc57質(zhì)粒(TaKaRa生物(大連)有限公司)中得到HAVl(1815bp)基因，并插入到萊茵衣藻細(xì)胞核遺傳表達(dá)載體pH124 (詳見(jiàn)專利
【發(fā)明者】胡章立, 李建成 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)