一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術領域】，具體是一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，該基因核苷酸序列及編碼蛋白質的氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。本發(fā)明通過基因克隆技術克隆出基因序列，構建原核表達載體，通過對重組蛋白進行酶活性檢測，證實了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能，屬于瓊膠、淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等合成途徑的關鍵酶編碼基因。該基因對于提高藻類瓊膠、淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等經(jīng)濟成分含量具有重要的應用價值。
【專利說明】一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。特別涉及一種海帶(Saccharina japonica)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列，及其編碼蛋白以及在合成淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等的能力和在改良重要經(jīng)濟成分和抗逆性狀中的應用。
【背景技術】
[0002]海帶是全世界主要栽培的海洋植物(藻類)種類。作為一種海洋蔬菜，海帶具有很高的營養(yǎng)價值，同時，其含有的藻膠、淀粉、纖維素等經(jīng)濟成分，可以作為原材料廣泛應用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、紡織工業(yè)、科學研究等方面。
[0003]克隆產(chǎn)物合成相關基因并驗證其功能，揭示基因與產(chǎn)物之間的關系，輔助開展品種改良已成為國際農(nóng)業(yè)育種領域提高經(jīng)濟成分含量的有效途徑之一；同時，利用基因工程技術生產(chǎn)活性物質與經(jīng)濟產(chǎn)物已成為現(xiàn)代生物技術產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心內容。
[0004]尿苷二憐酸葡萄糖焦憐酸化酶(UGPase,UDP-glucose pyrophosphorylase)是生物糖代謝過程中一個關鍵酶，在植物以及藻類中主要催化可逆反應Glc-1-P+UTP —— UDPG+PPi，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化反應的產(chǎn)物之一尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG,uridine diphosphate glucose)作為體內主要活化糖的形式,可作為葡萄糖基供體參與瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白的合成代謝。
[0005]海洋藻類是自然界中瓊膠、淀粉、纖維素等重要經(jīng)濟資源產(chǎn)物的主要原料之一。尤其是以紅藻為主要原料的瓊膠可廣泛應用于各種食品和藥物領域。
[0006]瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白等不同物質的生物合成途徑不同，但都是以尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP酶)催化反應的產(chǎn)物尿苷二磷酸葡萄糖(W)PG)作為共有的初始反應底物。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化活力直接影響到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的含量水平，因此，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)被認為是一類重要的關鍵酶。
[0007]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP酶)廣泛存在于各種生物體內，如綠色植物(Green Plants)、高等動物(Animals)、娃藻(Diatom)、綠藻(Green algae)、褐藻(Brownalgae)、紅藻(Red algae)、真菌(Fungi)、細菌(Bacteria)等。目前，已經(jīng)在大量綠色植物和微生物中克隆出該酶的基因并驗證了其功能，但在藻類中該基因的克隆開展的還不多，僅有 H本凋毛藻(Griffithsia japonica)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )、龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)、江蘺(Gracilaria gracilis)得至Ij了克隆，但并未驗證該基因編碼酶的功能。
[0008]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化反應的產(chǎn)物之一尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作為合成蔗糖、纖維素、半纖維素、果膠質等經(jīng)濟成分的初始底物，使綠色植物成為提取上述物質的主要原料。同時，在合成重要海藻膠-瓊膠的生物合成中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)被認為是紅藻糖苷合成過程中的限速酶，控制著重要的產(chǎn)物UDP-D-葡萄糖的合成，對于提高紅藻中的瓊膠含量具有重要的價值，目前，植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的功能驗證主要通過檢測其催化逆反應UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，但關于紅藻、褐藻中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的克隆十分缺乏，并且其功能仍未得到確認。

【發(fā)明內容】

[0009]針對目前現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其可編碼一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶蛋白，所述蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，該基因的應用可用于提高瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白等含量。
[0010]本發(fā)明的目的之一在于提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，所述基因是從海帶(Saccharina japonica)中分離出來的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，命名為SjUGP ;所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示。
[0011]本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述基因編碼的蛋白，所述蛋白由SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其具有可逆催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性。
[0012]本發(fā)明目的之三是所述基因及其編碼蛋白在合成瓊膠、淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖中的應用。[0013]本發(fā)明目的之四是所述基因及其編碼蛋白在改良經(jīng)濟成分性狀以及在進行發(fā)酵工程中的應用。
[0014]本發(fā)明通過基因克隆的方法，從海帶中克隆到了一個尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并通過實驗證明了其編碼的蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，是合成瓊膠、淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖的關鍵基因?？寺『头治龊蜍斩姿崞咸烟墙沽姿峄富蛴兄谏钊肜斫夂У群衷宓矸?、纖維素、海藻糖、蔗糖合成機制，同時也會為相關產(chǎn)物基因工程和分子育種提供了基因資源。本發(fā)明首次從海帶(Saccharina japonica)中分離到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并通過原核表達載體對重組蛋白進行酶活性檢測，證實了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性功能，具有淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖基因工程和分子育種的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的SjUGP基因cDNA全長的PCR擴增圖。
[0016]圖2為本發(fā)明的SjUGP基因及其編碼氨基酸序列(方框中分別為起始密碼子和終止密碼子)。
[0017]圖3為本發(fā)明的SjUGP基因轉化pET32a載體后PCR檢測陽性克隆PCR擴增圖(I泳道為pET32a用EcoRI和NotI雙酶切產(chǎn)物；2泳道為SjUGP基因轉化pET32a載體用EcoRI和NotI雙酶切產(chǎn)物；M為DNA標準分子量)。
[0018]圖4為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物純化后SDS-PAGE檢測圖。
[0019]圖5為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的Western-Blot檢測圖。[0020]圖6為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的不同溫度對酶活性的檢測圖。
[0021]圖7為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的pH對酶活性的檢測圖。
[0022]圖8為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的不同金屬離子對酶活性的檢測圖。
[0023]圖9為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的不同底物濃度酶活性變化圖。
[0024]圖10為本發(fā)明的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產(chǎn)物的不同底物濃度雙倒數(shù)曲線圖。【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實驗指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]實施例1:基因全長編碼區(qū)的克隆與分析
[0027]海帶采集自山東省榮成市，采集時間為2011年7月。采用Trizol法提取海帶雌配子體總 RNA,使用 TAKARA 公司 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒以海帶配子體總RNA反轉錄的第一鏈cDNA為模板，采用Touchdown PCR技術進行海帶SjUGP基因的CDS全長序列的擴增，擴增引物包括2組(5' -CAGCGGATCCATGTCTAGTGTCAGCATGAACGCGG-3'和 5' -ATTAGCGGCCGCCGCACCCTCAGCCGA-3' ；5/ -CAGCGGATCCATGTCTAGTGTCAGCATGAACGCGG-3'和 5' -ATTAGCGGCCGCCGCACCCTCAGCCGA-3' )。PCR 擴增程序為:94°C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min，15 個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低 1°C ;94°C 30s, 45°C30s, 72°C 2min，20個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，于_20°C保存?；厥盏哪康钠?，于16°C金屬浴過夜連接至克隆載體pMD19-T，并轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli ToplO中，涂布于含有100mg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)，經(jīng)過IPTG/X-gal藍白斑篩選后，挑取4-10個陽性克隆進行測序。將測序結果通過序列比對，分離到了一個海帶UGP基因，命名為SjUGP。SjUGP⑶S序列全長為1446bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼482個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。
[0028]實施例2 =SjUGP編碼蛋白的制備及分析
[0029]海帶SjUGP PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切下目的條帶，瓊脂糖凝膠回收，回收產(chǎn)物SjUGP和pET32a質粒進行EcoRI和NotI雙酶切，在37°C金屬浴3-4h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段SjUGP和質粒pET32a進行連接，16°C過夜，構建好的重組質粒命名為pET32a_SjUGP。
[0030]將重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21，挑取BL21陽性克隆，搖菌并保存菌株。PCR檢測重組子。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠圖像分析儀成像。挑取電泳檢測插入條帶正確的克隆測序，檢測有無突變，移碼框是否改變。
[0031]將成功連接了目的片段的BL21菌株，以按照1:1000比例(10ml LB液體培養(yǎng)基+IOul AP+1OuI菌液)搖菌培養(yǎng)，每隔一個小時測OD值，直到0D600nm值達到0.6 (3_4h)。用0.1mM的IPTG濃度誘導菌液，誘導條件為25°C，160rpm，誘導6_8h。誘導結束后取2ml菌液4°C 12000rpm 5min離心，棄上清，將管倒置于吸水紙上；沉淀加入1/2體積提前預冷好的IXPBS (PH=7.5)中(即2ml離心后的沉淀中加入Iml 1XPBS)，充分混勻。超聲法破碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45 μ m的濾膜過濾，Ni柱純化后，收集的蛋白樣品放入透析袋中透析，以除去不需要的離子，獲得重組SjUGP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，采用SDS-PAGE、Western-Blot檢測重組蛋白的表達。
[0032]實施例3 =SjUGP編碼蛋白的功能驗證
[0033]UGP 酶活測定:反應體系如下:IOOmM I X PBS, 0.85mM UDPG, 0.5mM PPi, 5mMMgcl2, 0.3mM NADP, 5unit PGM, 5unit GDH和適量實施例2制備的重組SjUGP蛋白，總的反應體系為lmL，加入底物M-6-P起始反應。將上述除去底物的體系混合后在相應溫度條件下孵育2min后起始反應，以相應的緩沖液為空白對照，在340nm處分別測定反應0min、6min和12min吸光值的變化，每個反應設置4個平行樣。經(jīng)檢測，酶活為373.38U/g，對UDPG的Km為4.33窗01，最適反應溫度為371:，最適？!1為8.0。該酶為高溫酶，堿性蛋白；Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+可以促進酶活，Pb2+、Cu2+抑制其活性。
[0034]目前UGP酶相關的基因及蛋白在一些植物和細菌中得到了檢測，例如細菌 Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus (參見非專利文獻:Ma Z, Fan HJ, LuCP.Molecular cloning and analysis of the UDP-Glucose Pyrophosphorylase inStreptococcus equi subsp.zooepidemicus.Mol Biol Rep.2011 Apr;38(4):2751-60.),細菌 Sphingomonas paucimobilis (參見非專利文獻:Marques AR, FerreiraPB,Sa-Correia I,Fialho AM.Characterization of the UgpG gene encoding aUDP-glucose pyrophosphorylase from the gelIan gum producer Sphingomonaspaucimobilis ATCC 31461.Mol Genet Genomics.2003 Mar;268(6):816-24.),細菌 Mycobacterium tuberculosis (參見非專利文獻:Lai X，Wu J, Chen S，ZhangX，Wang H.Expression,purification, and characterization of a functionalIyactive Mycobacterium tuberculosis UDP-glucose pyrophosphorylase.ProteinExpr Purif.2008 Sep; 61 (I): 50-6.),植物大麥(barley)(參見非專利文獻:DeckerD, Meng M, Gornicka A, Hofer A, Wilczynska M, Kleczkowski LA.Substrate kineticsand substrate effects on the quaternary structure of barley UDP-glucosepyrophosphorylase.Phytochemistry.2012 Jul; 79:39-45.);但其各自的酶活性都遠遠小于本研究分析的海帶UGP基因，上述幾種UGP酶與本發(fā)明制備的UGP酶的Km值對比如下:
[0035]
【權利要求】
1.一種編碼海帶中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種由權利要求1所述基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能。
3.權利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其編碼蛋白在合成瓊膠、淀粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等中的應用，以及在該成分對生物性狀改良中的應用。
4.權利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其編碼蛋白在改良經(jīng)濟成分性狀以及在進行發(fā)酵工程中的·應用。
【文檔編號】C12N9/14GK103710365SQ201410002943
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權日:2014年1月3日
【發(fā)明者】劉濤, 池姍 申請人:中國海洋大學