病原體抗性的柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本公開(kāi)涉及，根據(jù)一些實(shí)施方案，病原體抗性的柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法。例如，組合物可以包括肽(例如防御素肽)和/或核酸(例如防御素核酸)。病原體抗性柑橘植物可以包括，在一些實(shí)施方案中，防御素肽和/或編碼防御素肽的可表達(dá)核酸。
【專利說(shuō)明】病原體抗性的柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年1月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/591，680和2012年5 月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/641，641的優(yōu)先權(quán)，這兩個(gè)申請(qǐng)通過(guò)引用被并入本文。
[0003] 公開(kāi)領(lǐng)域
[0004] 本公開(kāi)涉及，在一些實(shí)施方案中，病原體抗性的柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法。
[0005] 公開(kāi)背景
[0006] 目前，還沒(méi)有對(duì)細(xì)菌性潰瘍?。ǜ涕贊儾【╔anthomonas axonopodi S pv. citri)) (Xac)，和 / 或由柑橘黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus) (Las) 引起的柑橘黃龍?。ㄒ郧胺Q青果?。┚哂锌剐缘母涕僭耘嗥贩N（cultivars)。實(shí)際上，在柑 橘屬中未曾發(fā)現(xiàn)對(duì)這些微生物病原體的遺傳抗性。由于柑橘物種的復(fù)雜的生殖生物學(xué)和長(zhǎng) 的生命周期，通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種產(chǎn)生抗性栽培品種的嘗試受到了阻礙。
[0007] 簡(jiǎn)沭
[0008] 相應(yīng)地，對(duì)于植物（例如柑橘）來(lái)說(shuō)，出現(xiàn)了提高對(duì)疾病的抗性的需要。進(jìn)一步出 現(xiàn)了對(duì)于用于制備基因修飾的植物（例如柑橘）的改進(jìn)的方法、組合物和系統(tǒng)的需要。
[0009] 本公開(kāi)涉及，根據(jù)一些實(shí)施方案，病原體抗性柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法。例 如，組合物可以包括核酸（例如防御素核酸）。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括核酸序列， 其（a)與防御素序列（例如SEQIDN0S :3,4,5,6,9，10，ll，12和/或29)具有大約75% 至大約100%的同一性（例如大約98%同一性），和/或（b)編碼與SEQ ID NOS :1，2, 7,8 和/或28具有大約95 %至大約100 %的同一性（例如98 %同一性）的氨基酸序列。在一 些實(shí)施方案中，核酸可以包括與選自由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5組成的組的序列具有 大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :1具有至少大約99%同一性的氨基 酸序列的肽。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括與選自由SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6組 成的組的序列具有大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :2具有至少大約 99%同一'丨生的氨基酸序列的肽。根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以包括與選自由SEQ ID NO :9 和SEQ ID NO :11組成的組的序列具有大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :7具有至少大約99%同一性的氨基酸序列的肽。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括與選 自由SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :12組成的組的序列具有大約98%同一性的核酸序列，并 編碼具有與SEQ ID NO :8具有至少大約99%同一性的氨基酸序列的肽。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及在柑橘中可操作的防御素表達(dá)載體。例如，表達(dá)載 體可以包括，在5'至3'方向上，（a)表達(dá)控制序列；(b)與表達(dá)控制序列可操作地連接的 可表達(dá)核酸（例如編碼外源多肽的核酸）；和（c)與可表達(dá)核酸可操作地連接的3'終止序 列。在一些實(shí)施方案中，外源核酸可以包括與選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12 和 SEQ ID NO :29組成的組的核酸序列具有至少大約75%同一性（例如至少大約98%同一性）的核 酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以位于細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案 中，表達(dá)載體可以在相對(duì)于編碼序列（例如由外源核酸序列編碼的）的位置-4至4包括核 苷酸序列AACAATGG。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以包括具有從大約1至大約200個(gè)核 苷酸長(zhǎng)度的接頭（例如表達(dá)控制序列的3'端和/或核酸（例如編碼外源多肽的核酸）的 5，端）。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包括表達(dá)載體的細(xì)菌細(xì)胞。例如，細(xì)菌細(xì)胞可以包 括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上，（a)表達(dá)控制序列；(b)與表達(dá)控制序列 可操作地連接的可表達(dá)核酸（例如編碼外源多肽的核酸）；和（c)與可表達(dá)核酸可操作地 連接的3'終止序列。例如，細(xì)菌細(xì)胞可以包括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括，在5'至3'方向 上，（a)表達(dá)控制序列；(b)與表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和（c)與外源核酸 可操作地連接的3'終止序列，其中外源核酸包括與選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12 組 成的組的核酸序列具有至少大約98%同一性的核酸序列。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包括表達(dá)載體的植物細(xì)胞（例如柑橘植物細(xì)胞）。 例如，植物細(xì)胞（例如柑橘植物細(xì)胞）可以包括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括，在5'至3'方 向上，（a)表達(dá)控制序列；(b)與表達(dá)控制序列可操作地連接的可表達(dá)核酸（例如編碼外源 多肽的核酸）；和（c)與可表達(dá)核酸可操作地連接的3'終止序列。例如，植物細(xì)胞（例如 柑橘植物細(xì)胞）可以包括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上，（a)表達(dá)控制序 列；(b)與表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和（c)與外源核酸可操作地連接的3' 終止序列，其中外源核酸包括與選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO :29 組成 的組的核酸序列具有至少大約98%同一性的核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，植物細(xì)胞（例 如柑橘植物細(xì)胞）可以位于植物（例如柑橘植物）中。柑橘植物的實(shí)例包括，但不限于橙 (orange)和葡萄柚（grapefruit)。植物細(xì)胞可以包括防御素肽。在一些實(shí)施方案中，防御 素肽可以具有與 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 或 SEQ ID N0:28 具有至少大約99 %同一性的氨基酸序列（例如由表達(dá)載體核酸編碼和/或從其表達(dá)的）。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包括表達(dá)載體的柑橘植物（例如橙和/或葡萄 柚）。柑橘植物可以在單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞中（例如嵌合體）或在所有細(xì)胞中包括表達(dá)載 體。在一些實(shí)施方案中，嵌合體植物可以由嫁接產(chǎn)生。例如，柑橘植物可以包括在所有細(xì)胞 中具有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物的嫁接物（例如接穗）和在其細(xì)胞中具有不同表達(dá)載體或沒(méi) 有表達(dá)載體的植物（例如砧木）。在一些實(shí)施方案中，柑橘植物可以在單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞 (例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括第一表達(dá)載體（例如編碼第一防御素肽），并在單個(gè) 細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞（例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括第二表達(dá)載體（例如編碼第二防御 素肽）。例如，柑橘植物細(xì)胞可以包括（a)第一表達(dá)載體，該第一表達(dá)載體包括，在5'至3' 方向上，（i)第一表達(dá)控制序列；（ii)與第一表達(dá)控制序列可操作地連接的第一外源核酸； 和（iii)與第一外源核酸可操作地連接的第一 3'終止序列，其中第一外源核酸包括與選自 由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :11組成的組的核酸序列具有 至少大約98%同一性的核酸序列；和（b)第二表達(dá)載體，該第二表達(dá)載體包括，在5'至3' 方向上，（iv)第二表達(dá)控制序列；(V)與第二表達(dá)控制序列可操作地連接的第二外源核酸； 和（vi)與第二外源核酸可操作地連接的第二3'終止序列，其中第二外源核酸包括與選自 由 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO : 10 和 SEQ ID NO : 12 組成的組的核酸序列具有 至少大約98%同一性的核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，柑橘植物可以在單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞 (例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括編碼第一防御素肽（例 如SoD2)的第一核酸序列和編碼第二防御素肽（例如SoD7)的第二核酸序列。在一些實(shí)施 方案中，柑橘植物可以在單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞（例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括防御素 肽。柑橘植物可以在單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞（例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括第一防御 素肽（例如與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :7具有至少大約99%同一性的肽），并在單個(gè)細(xì) 胞、多個(gè)細(xì)胞（例如嵌合體）中或在所有細(xì)胞中包括第二防御素肽（例如與SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :8具有至少大約99%同一性的肽）。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及在柑橘植物中表達(dá)包括編碼被表達(dá)肽（例如防御 素肽）的核酸序列的外源核酸的方法。例如，方法可以包括使包括外源核酸的表達(dá)盒或者 包括外源核酸的表達(dá)載體與柑橘植物的細(xì)胞胞質(zhì)在允許外源核酸表達(dá)并允許被表達(dá)肽形 成的條件下接觸。在一些實(shí)施方案中，外源核酸可以包括與選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12 和/或SEQ ID NO :29的核酸序列具有至少98%同一性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中， 表達(dá)載體和/或表達(dá)盒可以包括，在5'至3'方向上，表達(dá)控制序列，與表達(dá)控制序列可操 作地連接的外源核酸，以及與外源核酸可操作地連接的3'終止序列。根據(jù)一些實(shí)施方案， 被表達(dá)肽可以包括與選自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8和/或 SEQ ID NO :28的氨基酸序列具有至少99%同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，使表 達(dá)載體或盒接觸可以進(jìn)一步包括將細(xì)胞與包括表達(dá)載體或表達(dá)盒的農(nóng)桿菌細(xì)胞共培養(yǎng)以 形成共培養(yǎng)的植物細(xì)胞。根據(jù)一些實(shí)施方案，可以從共培養(yǎng)的植物細(xì)胞再生植物。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及對(duì)具有微生物感染（例如細(xì)菌性潰瘍（柑橘潰瘍 病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri)) (Xac))，和 / 或由柑橘黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus) (Las)引起的柑橘黃龍?。ㄒ郧胺Q青果?。┖?或?qū)ζ溆懈腥?風(fēng)險(xiǎn)的柑橘植物進(jìn)行治療的方法。例如，方法可以包括在柑橘植物中形成至少一種防御素 肽。在一些實(shí)施方案中，在柑橘植物中形成至少一種防御素肽可以包括，在允許防御素核酸 表達(dá)的條件下，將柑橘植物嫁接到第二種柑橘植物的扦插物（cutting)(例如接穗或砧木） 上，第二種柑橘植物包括表達(dá)載體和/或表達(dá)盒，所述表達(dá)載體和/或表達(dá)盒包括，在5'至 3'方向上，表達(dá)控制序列，與表達(dá)控制序列可操作地連接的防御素核酸，以及與防御素核酸 可操作地連接的3'終止序列，其中防御素核酸包括編碼與選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8和/或SEQ ID N0:28的氨基酸序列具有至少99%同一性的 氨基酸序列的核酸序列。
[0016] 附圖簡(jiǎn)沭
[0017] 本專利的文件包含以彩色顯示的至少一幅附圖。經(jīng)請(qǐng)求并繳納必需的費(fèi)用后，具 有彩色附圖的本專利的副本將由專利和商標(biāo)局（the Patent and Trademark Office)提供。 [0018] 可以通過(guò)部分參考本公開(kāi)和附隨的附圖來(lái)理解本公開(kāi)的一些實(shí)施方案，其中：
[0019] 圖1說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼SoD2的核酸的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 構(gòu)建體；
[0020] 圖2說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼S〇D7的核酸的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 構(gòu)建體；
[0021] 圖3表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,顯示在用SoD2 (07) 核酸轉(zhuǎn)化的哈姆林（Hamlin)和路德紅（Rohde Red)中的轉(zhuǎn)基因事件中的插入數(shù)目，所述 SoD2 (07)核酸包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0022] 圖4表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,顯示在用SoD2 (09) 或S〇D7 (10)核酸轉(zhuǎn)化的哈姆林和路德紅中的轉(zhuǎn)基因事件中的插入數(shù)目，所述S〇D2 (09)或 S〇D7 (10)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的CODA-優(yōu)化序列；
[0023] 圖5表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2 (07) 或S〇D7 (08)核酸轉(zhuǎn)化的馬斯橙（Marrs)中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述S〇D2 (07) 或SoD7 (08)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0024] 圖6表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2 (09) 或S〇D7 (10)核酸轉(zhuǎn)化的哈姆林和路德紅中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述S〇D2 (09) 或SoD7 (10)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的CODA-優(yōu)化序列；
[0025] 圖7表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2 (07) 或S〇D7 (08)核酸轉(zhuǎn)化的哈姆林和路德紅中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述S〇D2 (07) 或SoD7 (08)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0026] 圖8表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,證明在用SoD2 (11) 或SoD7(12)核酸轉(zhuǎn)化的哈姆林植物中插入SoD2或SoD7,所述SoD2(ll)或SoD7(12)核酸 每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的DNA 2.0-優(yōu)化序列；
[0027] 圖9表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,證明在用SoD2 (09、 11)核酸、SoD7 (08、12)核酸或SoD2和SoD7 (13)二者的核酸轉(zhuǎn)化的Ruby Red(Ol)或哈姆 林（04)中插入防御素，所述S〇D2(09、11)核酸、S〇D7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者 的核酸均包括用于在柑橘中表達(dá)的使用序列優(yōu)化算法（08和13用GenScript ;09用Coda, 并且11和12用DNA 2. 0)優(yōu)化的序列；
[0028] 圖10表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2 (11) 核酸、S〇D7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者的核酸轉(zhuǎn)化的Ruby Red(Ol)或哈姆林 (04)中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述S〇D2(ll)核酸、S〇D7(08、12)核酸或S 〇D2和 S〇D7(13)二者的核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列（08和13)或DNA 2.0-優(yōu)化序列（11和12);
[0029] 圖11表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,證實(shí)在用SoD2 (07) 或SoD7 (08)核酸轉(zhuǎn)化的卡里佐積橙（Carrizo Citrange) (CC)中插入防御素，所述 S〇D2 (07)或S〇D7 (08)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0030] 圖12表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2 (07) 或SoD7 (08)核酸轉(zhuǎn)化的卡里佐枳橙（CC)中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述SoD2 (07) 或SoD7 (08)核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0031] 圖13A是根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，從用柑橘潰瘍病原體接種的非轉(zhuǎn)基 因葡萄柚樹(shù)上切掉的葉片的照片；
[0032] 圖13B是根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，從用柑橘潰瘍病原體接種的SoD2轉(zhuǎn) 基因葡萄柚樹(shù)上切掉的葉片的照片；
[0033] 圖14是根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，將未感染的非轉(zhuǎn)基因接穗嫁接在感 染柑橘青果病的非轉(zhuǎn)基因砧木上獲得的嵌合葡萄柚樹(shù)（左邊和中間），或者將未感染的 S〇D2轉(zhuǎn)基因接穗嫁接在感染柑橘青果病的非轉(zhuǎn)基因砧木上獲得的嵌合葡萄柚樹(shù)（右邊）的 照片；
[0034] 圖15A說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待檢材料進(jìn)行第一次、第 二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代柑橘植物百分比；
[0035] 圖15B是圖15A的柱狀圖續(xù)，其說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待 檢材料進(jìn)行第一次、第二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代柑橘植物百分比；
[0036] 圖15C是圖15A的柱狀圖續(xù)，其說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待 檢材料進(jìn)行第一次、第二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代柑橘植物百分比；
[0037] 圖16A說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待檢材料進(jìn)行第一次、第 二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；
[0038] 圖16B是圖16A的柱狀圖續(xù)，其說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待 檢材料進(jìn)行第一次、第二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；
[0039] 圖16C是圖16A的柱狀圖續(xù)，其說(shuō)明了根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的，在對(duì)待 檢材料進(jìn)行第一次、第二次和第三次采樣時(shí)被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；并且
[0040] 圖17表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的Southern blot,證實(shí)在用SoD2和 SoD7(13)二者的核酸轉(zhuǎn)化的Rio Red(Ol)中插入防御素，所述SoD2和SoD7(13)二者的核 酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；
[0041] 圖18表示根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的northern blot,顯示在用SoD2和 S〇D7 (13)二者的核酸轉(zhuǎn)化的Rio Red(Ol)或哈姆林（04)中的轉(zhuǎn)基因事件中的RNA轉(zhuǎn)錄物， 所述S〇D2和S〇D7 (13)二者的核酸每個(gè)包括用于在柑橘中表達(dá)的GenScript-優(yōu)化序列；并 且
[0042] 圖19是Western blot,其說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的抗-SoD7與包含 S〇D7的樣品的結(jié)合。
[0043] 序列表簡(jiǎn)沭
[0044] 可以通過(guò)部分參考本公開(kāi)和附隨的序列表理解本公開(kāi)的一些實(shí)施方案，其中：
[0045] SEQ ID NO :1說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的菠菜（Spinacta oleracea) 防御素（SoD2)的氨基酸序列；
[0046] SEQ ID NO :2說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的菠菜（Spinacta oleracea) 防御素（S〇D7)的氨基酸序列；
[0047] SEQ ID NO :3說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的GenScript-優(yōu)化核酸序列；
[0048] SEQ ID NO :4說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的GenScript-優(yōu)化核酸序列；
[0049] SEQ ID NO :5說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的CODA-優(yōu)化核酸序列；
[0050] SEQ ID NO :6說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的CODA-優(yōu)化核酸序列；
[0051] SEQ ID NO :7說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括PR-Ib信號(hào)肽和菠菜 (Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的嵌合肽的氨基酸序列；
[0052] SEQ ID NO :8說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括PR-Ib信號(hào)肽和菠菜 (Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的嵌合肽的氨基酸序列；
[0053] SEQ ID NO :9說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的核 酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的GenScript-優(yōu)化核酸序列 的嵌合核酸序列；
[0054] SEQ ID NO: 10說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的GenScript-優(yōu)化核酸序 列的嵌合核酸序列；
[0055] SEQ ID NO :11說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的CODA-優(yōu)化核酸序列的 嵌合核酸序列；
[0056] SEQ ID NO: 12說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的CODA-優(yōu)化核酸序列的 嵌合核酸序列；
[0057] SEQ ID NO :13說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的GenScript-優(yōu)化核酸序 列的表達(dá)盒；
[0058] SEQ ID NO: 14說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的GenScript-優(yōu)化核酸序 列的表達(dá)盒；
[0059] SEQ ID NO :15說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的CODA-優(yōu)化核酸序列的 表達(dá)盒；
[0060] SEQ ID NO: 16說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼PR-Ib信號(hào)肽的 核酸序列和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的CODA-優(yōu)化核酸序列的 表達(dá)盒；
[0061] SEQ ID NO : 17說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)控制序列（CaMV 35S 啟動(dòng)子）；
[0062] SEQ ID NO : 18說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的非翻譯區(qū)（TEV 5' UTR);
[0063] SEQ ID NO : 19說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的表達(dá)控制序列（CaMV 35S 終止子）；
[0064] SEQ ID NO :20說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為Zn5的引物的核酸 序列；
[0065] SEQ ID NO :21說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為Zn6的引物的核酸 序列；
[0066] SEQ ID NO :22說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為Fcp的引物的核酸 序列；
[0067] SEQ ID NO :23說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為Rcp的引物的核酸 序列；
[0068] SEQ ID NO :24說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為GUSF的引物的核酸 序列；
[0069] SEQ ID NO :25說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的被稱為GUSR的引物的核酸 序列；
[0070] SEQ ID NO :26說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括被修飾的PR-Ib信號(hào) 肽和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的具有單個(gè)缺失的GenScript-優(yōu) 化核酸序列的嵌合肽的氨基酸序列；
[0071] SEQ ID NO :27說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的包括編碼被修飾的 PR-Ib信號(hào)肽和用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的具有單個(gè)缺失的 GenScript-優(yōu)化核酸序列的嵌合核酸序列；
[0072] SEQ ID NO :28說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的防御素的核心氨基酸序 列；
[0073] SEQ ID NO :29說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的用于表達(dá)核心防御素的核 酸序列；
[0074] SEQ ID NO :30說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD2)的DNA 2.0-優(yōu)化核酸序列；并且
[0075] SEQ ID NO :31說(shuō)明根據(jù)本公開(kāi)的具體示例實(shí)施方案的用于表達(dá)菠菜（Spinacia oleracea)防御素（SoD7)的DNA 2.0-優(yōu)化核酸序列。
[0076] 詳細(xì)描沭
[0077] 本公開(kāi)涉及，在一些實(shí)施方案中，用于增強(qiáng)植物對(duì)與病原體（例如細(xì)菌、酵母、真 菌、病毒）接觸（例如感染）的反應(yīng)的天生能力（如果有的話）的組合物、生物體、系統(tǒng)和方 法。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及用于在植物（例如柑橘）中表達(dá)基因產(chǎn)物（例如抗微 生物肽）的組合物、生物體、系統(tǒng)和方法。例如，本公開(kāi)涉及包括一種或更多種抗微生物肽 和/或編碼一種或更多種抗微生物肽的一種或更多種核酸的表達(dá)控制序列（例如啟動(dòng)子）、 表達(dá)盒、表達(dá)載體、微生物和/或植物。
[0078] I.鉬合物
[0079] A.抗微牛物狀
[0080] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開(kāi)涉及具有殺蟲(chóng)活性、抗微生物活性和/或抗病毒活性 的肽和/或蛋白，其可以包括但不限于抗生物素蛋白，營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（例如Vip3A)，來(lái)自 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)的殺蟲(chóng)晶體蛋白（例如Cryl、CrylAb、Cry2、 Cry9)，豌豆白蛋白（例如PAlb)，多毛菌素 A(hirsutellin A)，凝集素（例如雪花蓮凝集素 (snow drop lily lectin)、大蒜凝集素，洋蔥凝集素），淀粉酶抑制劑（例如α淀粉酶抑制 劑），arcelins (例如來(lái)自豆類的arcelins)，蛋白酶抑制劑，溶菌酶（例如牛溶菌酶、人溶 菌酶、軟體動(dòng)物溶菌酶），防御素（例如S 〇D2和/或S〇D7)，幾丁質(zhì)酶，β-1，3-葡聚糖酶， 其變體和/或其組合?？刮⑸镫目梢园ǎ?，一種或更多種屬于植物防御素家族的抗 微生物肽。這些多肽最初是從菠菜葉片（Spinacia oleracea)中分離的。在一些實(shí)施方案 中，防御素可以是小的（大約5kDa)，可以是堿性的和/或可以是富含半胱氨酸的。在一些 實(shí)施方案中，防御素可以包括具有與SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO: 2共享至少大約95 % 同一性，至少大約96%同一性，至少大約97%同一性，至少大約98%同一性，至少大約99% 同一性，和/或大約100%同一性的氨基酸序列的肽。在一些實(shí)施方案中，抗微生物肽可以 進(jìn)一步包括獨(dú)立地和/或共同地是各自中性的（例如不會(huì)有害地影響抗細(xì)菌功能），和/或 增強(qiáng)抗細(xì)菌功能（例如通過(guò)將肽指向所期望的部位（例如細(xì)胞中和/或胞外）的一個(gè)或更 多個(gè)氨基酸。例如，防御素可以包括來(lái)源于煙草病程相關(guān)的（PR)-Ib蛋白的信號(hào)肽，其允許 肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的質(zhì)外體中（例如通過(guò)分泌途徑）和/或在葉片、莖、花、果實(shí)、種子和 /或根的細(xì)胞間隙空間中積聚。根據(jù)一些實(shí)施方案，防御素可以包括具有與SEQ ID NO :7和 /或SEQ ID NO :8共享至少大約95%同一性，至少大約96%同一性，至少大約97%同一性， 至少大約98%同一性，至少大約99%同一性，和/或大約100%同一性的氨基酸序列的肽。
[0081] B.核酸
[0082] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包括編碼一種或更多種抗微生物肽的一種或更多 種序列的核酸（例如盒、載體）。例如，核酸可以包括盒，所述盒包括合成的S 〇D2和/或S〇D7 基因的核酸序列。合成的S〇D2和/或S 〇D7密碼子可以指定與天然菠菜相同的氨基酸序列， 它們的密碼子按柑橘密碼子使用被優(yōu)化。包括S〇D2和/或S 〇D7編碼序列的核酸可以包括 編碼信號(hào)肽（例如PR-Ib)的序列。在一些實(shí)施方案中，包括編碼抗微生物肽的序列的核酸 的表達(dá)可以通過(guò)將起始密碼子放置在有利的（例如最優(yōu)的）5'上下游序列（context)中 而被優(yōu)化。根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以包括表達(dá)控制序列（例如與編碼序列可操作地連 接）。例如，核酸可以包括在具有TEV植物馬鈴薯Y病毒（TEV plantpotyvirus)的5' UTR 的雙重增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子（為了提供對(duì)防御素基因的翻譯增強(qiáng)活性）控制下的編碼 基因序列。
[0083] 根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以包括與SEQ ID NOS :3,4, 5,6,9,10,11，12, 29, 30和 /或 31 具有至少大約 75% 同一性，與 SEQ ID 勵(lì)5:3,4,5,6,9，10，11，12,29,30 和/或29 具有至少大約80%同一性，與SEQ ID勵(lì)5:3,4,5,6,9，10，11，12,29,30和/或31具有至 少大約85%同一性，與SEQ ID NOS :3,4, 5,6,9,10,11，12, 29, 30和/或31具有至少大約 90% 同一性，與 SEQ ID N0S:3,4,5,6,9，10，11，12,29,30 和 / 或 31 具有至少大約 95% 同 一性，與 SEQ ID NOS :3,4, 5,6,9,10,11，12, 29, 30 和 / 或 31 具有至少大約 97% 同一性，與 SEQIDN0S:3,4,5,6,9，10，11，12,29,30 和/或31具有至少大約98%同一性，與SEQID NOS :3,4, 5,6,9,10,11，12, 29, 30 和 / 或 31 具有至少大約 99 % 同一性，和 / 或與 SEQ ID 勵(lì)5:3,4,5,6,9，10，11，12,29,30和/或31具有大約100%同一性的核苷酸序列。在一些 實(shí)施方案中，核苷酸序列可以編碼與SEQ ID NOS :1，2, 7,8和/或28具有至少大約98%同 一性，與SEQ ID NOS :1，2, 7,8和/或28具有至少大約99%同一性，和/或與SEQ ID NOS : 1，2,7,8和/或28具有大約100%同一'丨生的氨基酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以與 參考核酸序列具有第一量級(jí)的序列同一性，并且可以編碼與參考氨基酸序列具有第二量級(jí) 的序列同一'I"生的氨基酸序列。例如，根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以與SEQ ID NOS :3,4,5,6， 9,10,11，12, 29, 30和/或31具有大約85%的同一性，并且編碼與SEQ ID NOS :1，2, 7,8和 /或28具有大約100%同一性的氨基酸序列。
[0084] 根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸序列可以與具有SEQ ID NOS :3,4, 5,6,9,10,11，12, 29， 30和/或31的核苷酸序列的核酸在嚴(yán)格條件下雜交。嚴(yán)格條件可以包括，例如，（a)4X SSC， 65°C，然后0. IX SSC，65°C，60分鐘，和/或（b)50%甲酰胺，4X SSC，65°C。核酸可以包括具 有SEQIDN0S:3,4,5,6,9，10，ll，12,29,30 和/或31的序列的核酸的缺失片段（例如從 大約1至大約12個(gè)堿基的缺失），該片段保留了對(duì)能夠感染柑橘植物的至少一種微生物的 抗微生物活性。得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制備具有SEQ ID NOS :3,4,5,6， 9，10，11，12，29，30和/或31的序列的核酸的一個(gè)或更多個(gè)缺失片段，并對(duì)得到的片段進(jìn)行 針對(duì)能夠感染柑橘植物的至少一種微生物的抗微生物活性的篩選。
[0085] 可以通過(guò)用其序列或元件作為查詢序列，使用Gapped BLAST算法（Altschul等， 1997Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402)，使用 BL0SUM62 矩陣，缺 口成本（gap cost)為 11， 存留成本（persistence cost)為每殘基1，并且E值為10,進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)識(shí)別具有如 SEQ ID勵(lì)5:3,4,5,6,30和/或31的序列的核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，可以通過(guò)任 何可利用的方法來(lái)評(píng)估序列同一'I"生。例如，可以在FASTA應(yīng)用組件（Pearson和Lipman, 1988Proc. Nat. Acad. Sci. 85 :2444-2448 ；Pearson,1990Methods in Enzymology 183 ： 63-98)中用ALIGN(全球比對(duì)）或LALIGN(本地同源性比對(duì)），使用BL0SUM50矩陣，缺口 罰分為 _16、-4,來(lái)比較兩個(gè)序列?？梢愿鶕?jù)ClustalW(Larkin等，2007，Bioinformatics 23 (21) :2947-2948)、BLAST、FASTA或類似的算法評(píng)估序列相似性。
[0086] C.表汰盒和載體
[0087] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及用于在細(xì)胞中表達(dá)核酸序列（例如編碼序列），并 包括表達(dá)控制序列和與該表達(dá)控制序列可操作地連接的核酸序列的表達(dá)載體和/或表達(dá) 盒。因此，例如，表達(dá)盒可以包括被期望在植物中表達(dá)的異源編碼序列。
[0088] L表汰載體
[0089] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及表達(dá)載體，其可以包括，例如，具有表達(dá)控制序列 和與該表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼序列的核酸。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列 可以包括一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)或更多個(gè)操縱子，一個(gè)或更多個(gè)增強(qiáng)子，一個(gè)或更多個(gè) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和/或其組合。表達(dá)控制序列可以包括，例如，具有啟動(dòng)子活性的核酸。根 據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以是在（a)選自根、葉片、莖、花、種子和/或果實(shí)的器官 中，和/或（b)選自表皮、周皮薄壁組織厚角組織厚壁組織木質(zhì)部韌皮部和/或分泌結(jié)構(gòu)的 器官中是組成性活性的或條件性活性的。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以是可操作 的以驅(qū)動(dòng)核酸序列（例如編碼序列）在細(xì)胞中的表達(dá)。表達(dá)的度量可以包括，例如，基因產(chǎn) 物（例如RNA和/或蛋白質(zhì)）出現(xiàn)和/或積聚的速度和/或到一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（例如 起始點(diǎn)之后經(jīng)過(guò)的時(shí)間和/或發(fā)育階段）為止基因產(chǎn)物的總積聚量。在一些實(shí)施方案中， 基因產(chǎn)物的比較試驗(yàn)可以是定性的、半定量的和/或定量的。比較試驗(yàn)可以間接地和/或 直接地評(píng)估基因產(chǎn)物的存在和/或量。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以對(duì)一種或更 多種刺激（例如，一種或更多種小分子，一種或更多種植物防御誘導(dǎo)試劑，機(jī)械損傷，溫度， 壓力）敏感。例如，在被微生物（例如細(xì)菌或病毒）感染后，表達(dá)控制序列的活性可以被增 強(qiáng)或被抑制。
[0090] 表達(dá)控制序列可以在允許編碼序列表達(dá)（例如轉(zhuǎn)錄）的條件下與細(xì)胞（例如植物 細(xì)胞）接觸。表達(dá)載體的實(shí)例可以包括圖1和圖2中所示的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。根據(jù)一些 實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以在允許編碼序列在源自植物細(xì)胞的一個(gè)和/或更多個(gè)細(xì)胞中 表達(dá)的條件下與植物細(xì)胞（例如胚細(xì)胞、干細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞）接觸。在一些實(shí)施方案 中，表達(dá)載體可以在允許該表達(dá)載體的至少一部分遺傳給細(xì)胞后代的條件下與細(xì)胞（例如 植物細(xì)胞）接觸。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以包括一個(gè)或更多個(gè)選擇標(biāo)記。例如，當(dāng) 載體在細(xì)菌宿主、酵母宿主和/或植物宿主中時(shí)，表達(dá)載體可以包括用于選擇的標(biāo)記。
[0091] 2.表汰倉(cāng)
[0092] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開(kāi)涉及表達(dá)盒，其可以包括，例如，具有表達(dá)控制序列和 與該表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼序列的核酸。表達(dá)盒可以被包括在表達(dá)載體中。在 一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括在至少一種植物細(xì)胞中可表達(dá)的任何編碼序列。例如， 編碼序列可以包括植物序列、酵母序列、細(xì)菌序列、病毒序列（例如植物病毒）、人工序列、 其反義序列、其片段、其變體，和/或其組合。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括編碼具 有殺蟲(chóng)、抗細(xì)菌、抗真菌、抗微生物和/或抗病毒活性的一種或更多種基因產(chǎn)物的序列。在 一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括起始密碼子、內(nèi)含子和/或翻譯終止序列。根據(jù)一些實(shí) 施方案，編碼序列可以包括一種或更多種天然的或人工的編碼序列（例如編碼單個(gè)蛋白或 嵌合體）。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)盒可以可選地包括終止序列。在一些實(shí)施方案中，編碼 序列可以包括至少部分被進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在感興趣的生物體（例如柑橘植物）中表達(dá)的 序列。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以被用于構(gòu)建表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括，在5' 至3'方向上，（a)表達(dá)控制序列，（b)在該表達(dá)控制序列控制之下的異源基因或編碼序列， 或與天然植物基因互補(bǔ)的序列，和/或（c)3'終止序列（例如包括聚腺苷酸化位點(diǎn)的終止 序列）。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒的實(shí)例可以包括SEQ ID NOS :13-16所示的盒。表達(dá)盒 可以被合并到各種自主復(fù)制載體中以便構(gòu)建表達(dá)載體。例如，可以通過(guò)將表達(dá)控制序列連 接到要被表達(dá)的序列（例如編碼序列）上來(lái)構(gòu)建表達(dá)盒。
[0094] 一些用于構(gòu)建表達(dá)盒的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。例如，可利 用各種策略連接DNA片段，所述策略的選擇取決于DNA片段末端的性質(zhì)。得益于本公開(kāi)的 普通技術(shù)人員，編碼序列（例如具有抗微生物活性）和/或其部分可以通過(guò)其它手段，例如 化學(xué)或酶促合成被提供。根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以包括，在5'至3'方向上，表達(dá)控制 序列、接頭（可選的）和編碼序列。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括表達(dá)控制序列、接頭 和/或編碼序列之間的一個(gè)或更多個(gè)限制性位點(diǎn)和/或接合位點(diǎn)。
[0095] II.微牛物
[0096] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及微生物，所述微生物包括抗微生物肽（例如異源 抗微生物肽）和/或包括編碼抗微生物肽的核酸序列的核酸（例如異源的和/或可表 達(dá)的核酸）。例如，微生物可以包括細(xì)菌、酵母和/或病毒。微生物的實(shí)例包括但不限于 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)、大腸桿菌（Escherichia coli)、鱗翅類細(xì) 胞系、水稻東格魯病桿狀病毒（Rice tungro bacilliform virus)、鴨妬草屬黃花葉病毒 (Commelina yellow mosaic virus)、香蕉條紋病毒（Banana streak virus)、芋桿狀病毒 (Taro bacilliform virus)和/或桿狀病毒。根據(jù)一些實(shí)施方案，抗微生物肽對(duì)其宿主微 生物來(lái)說(shuō)可以是耐受的和/或無(wú)害的。微生物可以包括表達(dá)控制序列和與該表達(dá)控制序列 可操作地連接的抗微生物肽編碼序列。在一些實(shí)施方案中，包括編碼抗微生物肽的核酸序 列的核酸（例如異源的和/或可表達(dá)的核酸）可以存在于基因組核酸上和/或基因組外核 酸上。
[0097] III.棺物
[0098] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包括抗微生物肽（例如異源抗微生物肽）和/或 包括編碼抗微生物肽的核酸序列的核酸（例如異源的和/或可表達(dá)的核酸）的植物細(xì)胞 (例如胚細(xì)胞、干細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞）、組織和/或植物。在一些實(shí)施方案中，植物和/或植 物細(xì)胞可以是雙子葉植物。雙子葉植物的實(shí)例可以包括但不限于咖啡、番茄、胡椒、煙草、利 馬豆、擬南芥、橡膠、橙、葡萄柚、朽 1檬、酸橙（lime)、柑（tangerine)、橘（mandarin)、柚子、 馬鈴薯、南瓜、豌豆和/或甜菜。在一些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞可以被包括在植物組織、植物 器官和/或整株植物中。根據(jù)一些實(shí)施方案，組織、器官和/或整株植物中的植物細(xì)胞可以 與一個(gè)或更多個(gè)同基因的（isogenic)細(xì)胞和/或一個(gè)或更多個(gè)異種的（heterogenic)細(xì) 胞相鄰。在一些實(shí)施方案中，植物可以包括原代轉(zhuǎn)化株和/或其后代。在一些實(shí)施方案中， 包括編碼抗微生物肽的核酸序列的核酸（例如異源的和/或可表達(dá)的核酸）可以進(jìn)一步包 括與該核酸可操作地連接的表達(dá)控制序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼抗微生物肽的核酸序 列可以在植物中在一個(gè)或更多個(gè)直至所有的（例如基本上所有的）器官、組織和/或細(xì)胞 類型中被表達(dá)，所述器官、組織和/或細(xì)胞類型包括但不限于莖桿（stalk)、葉片、根、種子、 花、果實(shí)、分生組織、薄壁組織、貯藏薄壁組織、厚角組織、厚壁組織、表皮、葉肉、維管束鞘、 保衛(wèi)細(xì)胞、原生木質(zhì)部、后生木質(zhì)部韌皮部韌皮部伴隨物（phloem companion)和/或其組 合。在一些實(shí)施方案中，核酸和/或其基因產(chǎn)物（例如抗微生物肽）可以位于和/或轉(zhuǎn)移 至一個(gè)或更更多個(gè)細(xì)胞器（例如液泡、葉綠體、線粒體、質(zhì)體）。
[0099] IV.方法
[0100] A.轉(zhuǎn)化棺物
[0101] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開(kāi)涉及用于柑橘（例如柑橘植物的天然基因組）的獨(dú)立 轉(zhuǎn)化的方法。例如，方法可以包括用根癌農(nóng)桿菌（At)獨(dú)立轉(zhuǎn)化橙（甜橙，Citrus sinensis) 栽培品種"路德紅"、"哈姆林"和/或"馬斯橙"的天然基因組。根據(jù)一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)化方 法可以包括使包括S〇D2和/或S 〇D7序列（例如S〇D2和/或S〇D7合成基因序列）的核酸 與柑橘植物接觸。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的植物（例如新橙栽培品種的轉(zhuǎn)化的基因組）可 以獨(dú)立地包含編碼在柑橘屬的天然基因庫(kù)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的微生物抗性的S 〇D2基因和/或S〇D7 基因的序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)化的橙栽培品種植物可以包括由S 〇D2基因和/或S〇D7 基因編碼的肽。在一些實(shí)施方案中，包括S〇D2基因和/或S 〇D7基因的序列的和/或包括 由S〇D2基因和/或S〇D7基因編碼的肽的轉(zhuǎn)化植物可以呈現(xiàn)出對(duì)一些（例如廣泛的）細(xì)菌 和/或真菌病原體的抗性。例如，包括S 〇D2基因和/或S〇D7基因的序列的和/或包括由 S〇D2基因和/或S〇D7基因編碼的肽的轉(zhuǎn)化植物可以呈現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌性潰瘍?。ǜ涕贊儾?菌）（Xac)，和/或由柑橘黃龍病菌（Las)引起的柑橘黃龍?。ㄒ郧胺Q青果?。┑目剐?。參 見(jiàn)下面的實(shí)施例部分。
[0102] B.嫁接
[0103] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開(kāi)涉及將第一種植物（例如柑橘植物）的至少一部分與 第二種植物（例如柑橘植物）的至少一部分嫁接。第一種植物可以處于任何所期望的狀 態(tài)，包括但不限于健康狀態(tài)、疾病狀態(tài)、損傷狀態(tài)、應(yīng)激狀態(tài)（stressed condition)(例如 熱、冷、水等）和/或其組合。第一種植物可以具有任何所期望的基因型，包括但不限于野 生型、轉(zhuǎn)基因的、突變的，和/或關(guān)于感興趣的基因和/或性狀的等等基因型。
[0104] 第二種植物可以處于任何所期望的狀態(tài)，包括但不限于健康狀態(tài)、疾病狀態(tài)、損傷 狀態(tài)、應(yīng)激狀態(tài)（例如熱冷水等）和/或其組合。第二種植物可以具有任何所期望的基因 型，包括但不限于野生型、轉(zhuǎn)基因的、突變的，和/或關(guān)于感興趣的基因和/或性狀的等等基 因型。第一種和/或第二種植物可以包括至少一種抗微生物肽和/或包括編碼至少一種抗 微生物肽的序列的至少一種核酸。在第一種植物包括至少一種抗微生物肽和/或包括編碼 至少一種抗微生物肽的序列的至少一種核酸，并且第二種植物包括至少一種抗微生物肽和 /或包括編碼至少一種抗微生物肽的序列的至少一種核酸的情況下，符合期望的是第一種 和第二種植物具有相同的和/或不同的抗微生物肽和/或編碼抗微生物肽的核酸。嫁接可 以包括切割第一種植物的一部分以形成新鮮的切割位點(diǎn)，切割第二種植物的一部分以產(chǎn)生 第二切割位點(diǎn)，和/或使第一切割位點(diǎn)和第二切割位點(diǎn)接觸。切割位點(diǎn)可以包括至少一個(gè) 維管束。嫁接可以包括形成嫁接接點(diǎn)和/或，任選地，封閉嫁接接點(diǎn)（例如通過(guò)在嫁接接點(diǎn) 周圍涂覆一種或多種阻隔材料）。
[0105] C.治療棺物疾病
[0106] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及預(yù)防、減輕和/或治療植物疾?。ɡ绺涕偌膊。?和/或植物疾病的至少一種癥狀的組合物、生物體、系統(tǒng)和方法。例如，方法可以包括將具 有植物疾病和/或表現(xiàn)植物疾病的至少一種癥狀的的植物（例如柑橘植物）的至少一部 分，與包括抗微生物肽的植物（例如柑橘植物）的至少一部分嫁接。植物疾病的實(shí)例包括 但不限于細(xì)菌性潰瘍?。ǜ涕贊儾【╔ac)，和/或由柑橘黃龍病菌（Las)引起的柑橘黃 龍?。ㄒ郧胺Q青果病）。根據(jù)一些實(shí)施方案，預(yù)防、減輕和/或治療植物疾?。ɡ绺涕偌??。┖?或植物疾病的至少一種癥狀可以包括治療和/或治愈柑橘的一種或更多種毀滅性 細(xì)菌疾病。例如，包括以可表達(dá)的方式穩(wěn)定整合的S 〇D2和S〇D7轉(zhuǎn)基因的植物可以呈現(xiàn)出 對(duì)細(xì)菌性潰瘍?。ǜ涕贊儾【╔ac)，和/或由柑橘黃龍病菌（Las)引起的柑橘黃龍病 (以前稱青果?。幌抻谶@些病的抗性。這種抗性已被觀察到，如下述實(shí)施例中所述。
[0107] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開(kāi)涉及用于增加植物對(duì)植物疾?。ɡ绺涕偌膊。┑奶?然抗性，和/或給植物賦予對(duì)植物疾?。ɡ绺涕偌膊。┑目剐缘慕M合物、生物體、系統(tǒng)和 方法。例如，方法可以包括使植物與抗微生物肽和/或包括編碼抗微生物肽的核酸序列的 可表達(dá)的核酸接觸。在一些實(shí)施方案中，包括編碼抗微生物肽的核酸序列的可表達(dá)的核酸 可以是和/或可以包括表達(dá)盒。根據(jù)一些實(shí)施方案，接觸可以包括將目標(biāo)植物的至少一部 分與包括抗微生物肽和/或包括編碼抗微生物肽的核酸序列的可表達(dá)的核酸的植物嫁接。 在一些實(shí)施方案中，接觸可以包括使目標(biāo)植物的至少一部分與載體接觸，所述載體（例如 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化）包括抗微生物肽和/或包括編碼抗微生物肽的核酸序列的可表達(dá) 的核酸。植物疾病的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌性潰瘍?。ǜ涕贊儾【╔ac)，和/或由柑橘 黃龍病菌（Las)引起的柑橘黃龍?。ㄒ郧胺Q青果病）。
[0108] D.制各坩橘-可表汰的抗微牛物狀
[0109] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及用于形成柑橘-可表達(dá)的核酸的組合物、生物體、 系統(tǒng)和方法，所述柑橘-可表達(dá)的核酸包括編碼至少一種源自菠菜的抗微生物肽的核酸序 列。例如，方法可以包括識(shí)別感興趣的抗微生物肽的氨基酸序列，反向翻譯氨基酸序列以產(chǎn) 生第一核酸序列；為在柑橘中表達(dá)對(duì)第一核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以產(chǎn)生第二核酸序列， 和/或合成具有第二核酸序列的核酸。在一些實(shí)施方案中，方法可以包括，使具有第二核酸 序列的核酸與一個(gè)或更多個(gè)具有表達(dá)控制序列的核酸共價(jià)結(jié)合，所述表達(dá)控制序列相對(duì)于 具有第二核酸序列的核酸在可操作的方向和/或位置上從而在柑橘中是可操作的。
[0110] 如得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以預(yù)期其他等同的或可選擇的病 原體抗性柑橘組合物、生物體、系統(tǒng)和方法，而不背離本文所包含的描述。相應(yīng)地，所顯示的 和所描述的實(shí)現(xiàn)本公開(kāi)的方式僅僅被解釋為舉例說(shuō)明。
[0111] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在形狀、大小、數(shù)量和/或部件的排布上進(jìn)行各種變化，而不 背離本公開(kāi)的范圍。例如，表達(dá)控制序列、編碼序列、接頭和/或終止序列的位置和數(shù)量可 以變化。根據(jù)一些實(shí)施方案，每個(gè)公開(kāi)的方法和方法步驟可以與任何其他公開(kāi)的方法或方 法步驟聯(lián)合實(shí)施或以任何順序?qū)嵤?。?dāng)出現(xiàn)動(dòng)詞"可以"的時(shí)候，它是要表達(dá)可選條件和/ 或許可條件，但是它的使用不是要表示任何可操作性的缺乏，除非另有說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以在制備和使用本公開(kāi)的組合物、裝置和/或系統(tǒng)的方法上進(jìn)行各種變化。例如，組 合物、裝置和/或系統(tǒng)可以以適合微生物和/或植物的方式被制備和或使用（例如關(guān)于衛(wèi) 生、傳染性、安全性、毒性、生物計(jì)量以及其他考慮）。在期望的情況下，可以實(shí)施本公開(kāi)的一 些實(shí)施方案，而排除其他實(shí)施方案。例如，可以實(shí)施一些多肽實(shí)施方案，而排除特定的氨基 酸序列（例如SEQ ID NO :26)，和/或可以實(shí)施一些核酸實(shí)施方案，而排除特定的核酸序列 (例如 SEQ ID NO :27)。
[0112] 而且，在已經(jīng)提供范圍的情況下，公開(kāi)的端點(diǎn)可以被認(rèn)為是如特定的實(shí)施方案所 期望或所需要的精確值和/或近似值。當(dāng)端點(diǎn)是近似的時(shí)，靈活度可以根據(jù)范圍的數(shù)量級(jí) 相稱地改變。例如，一方面,在大約5至大約50的范圍的情況中，大約50的范圍端點(diǎn)可以 包括50. 5,但不包括52. 5或55,而另一方面，在大約0. 5至大約50的范圍的情況中，大約 50的范圍端點(diǎn)可以包括55,但不包括60或75。此外，在一些實(shí)施方案中，混合和搭配范圍 端點(diǎn)可能是符合期望的。而且，在一些實(shí)施方案中，每個(gè)公開(kāi)的數(shù)字（例如在一個(gè)或更多個(gè) 的實(shí)施例、表格和/或附圖中）可以成為范圍的基礎(chǔ)（例如所述值+/_大約10%，所述值 +/_大約50%，所述值+/-大約100% )和/或范圍端點(diǎn)。關(guān)于前者，實(shí)施例、表格和/或附 圖中描述的50的值可以成為例如大約45至大約55,大約25至大約100,和/或大約0至 大約100的范圍的基礎(chǔ)。
[0113] 這些等同方式和替代方式以及顯而易見(jiàn)的改變和修飾是要被包括在本公開(kāi)的范 圍內(nèi)。相應(yīng)地，前述公開(kāi)是要舉例說(shuō)明，而不是要限制由所附的權(quán)利要求說(shuō)明的本公開(kāi)的范 圍。 實(shí)施例
[0114] 本公開(kāi)的一些具體的示例實(shí)施方案可以由本文中提供的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施例進(jìn) 行說(shuō)明。
[0115] 實(shí)施例1 :棺物材料
[0116] 通常如Yang等，Plant Cell Reports (植物細(xì)胞報(bào)告）（2000) 19 :1203及下列等 等所述制備用于轉(zhuǎn)化的植物材料（例如甜橙（Citrus sinensis))。
[0117] 實(shí)施例2 :質(zhì)粒構(gòu)律和細(xì)菌菌株
[0118] 通常如Yang等，Plant Cell Reports (2000) 19 :1203及下列等等所述進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu) 建和細(xì)菌菌株。
[0119] 實(shí)施例3 :農(nóng)桿菌共培養(yǎng)和棺物轉(zhuǎn)化
[0120] 通常如Yang等，Plant Cell Reports (2000) 19 :1203及下列等等所述進(jìn)行農(nóng)桿菌 共培養(yǎng)和植物轉(zhuǎn)化。
[0121] 實(shí)施例4 :轉(zhuǎn)某閔幼苗的詵擇和再牛
[0122] 通常如Yang等，Plant Cell Reports (2000) 19 :1203及下列等等所述進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 幼苗的選擇和再生。
[0123] 實(shí)施例5 :轉(zhuǎn)某閔幼苗的嫁接
[0124] 通常如Yang等，Plant Cell Reports (2000) 19 :1203及下列等等所述進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 幼苗的嫁接。
[0125] 實(shí)施例 6 :Southern 和 Northern 分析
[0126] 通常如 Yang 等，Plant Cell Reports (2000) 19 :1203 及下列等等所述進(jìn)行 Southern 和 Northern 分析。
[0127] 實(shí)施例7 :在坩橘樹(shù)中表汰
[0128] 表1說(shuō)明用于柑橘的密碼子優(yōu)化的核酸序列的具體示例實(shí)施方案。所顯示的信號(hào) 肽和編碼序列的結(jié)構(gòu)基因的兩側(cè)是特定的限制性酶切位點(diǎn)。這些序列被用于構(gòu)建用于制備 轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)盒、載體和轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。
[0129] 表1.抗微生物基因的特定核苷酸序列的示例實(shí)施方案。為柑橘中密碼子使用對(duì) 核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化。
[0130]
【權(quán)利要求】
1. 一種核酸，所述核酸包括與選自由SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :5組成的組的序列 具有大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :1具有至少99%同一性的氨基 酸序列的肽。
2. -種核酸，所述核酸包括與選自由SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:6組成的組的序列 具有大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :2具有至少99%同一性的氨基 酸序列的肽。
3. -種核酸，所述核酸包括與選自由SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 11組成的組的序列 具有大約98%同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :7具有至少99%同一性的氨基 酸序列的肽。
4. 一種核酸，所述核酸包括與選自由SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12組成的組的序列 具有大約98 %同一性的核酸序列，并編碼具有與SEQ ID NO :8具有至少99 %同一性的氨基 酸序列的肽。
5. -種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上： 表達(dá)控制序列； 與所述表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和 與所述外源核酸可操作地連接的3'終止序列，其中所述外源核酸包括與選自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31組成的組的核酸序列具有至少98%同 一性的核酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體位于細(xì)菌細(xì)胞中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體位于植物細(xì)胞中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中位置-4至+4的核苷酸序列是AACAATGG。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括所述表達(dá)控制序列的3'、所 述外源核酸的5'的接頭，并且所述接頭具有從大約1至大約200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
10. -種細(xì)菌細(xì)胞，所述細(xì)菌細(xì)胞包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括，在5'至3'方向 上： 表達(dá)控制序列； 與所述表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和 與所述外源核酸可操作地連接的3'終止序列，其中所述外源核酸包括與選自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31組成的組的核酸序列具有至少98%同 一性的核酸序列。
11. 一種柑橘植物細(xì)胞，所述柑橘植物細(xì)胞包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括，在5'至 3'方向上 ： 表達(dá)控制序列； 與所述表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和 與所述外源核酸可操作地連接的3'終止序列，其中所述外源核酸包括與選自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31組成的組的核酸序列具有至少98%同 一性的核酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的柑橘植物細(xì)胞，其中所述柑橘植物細(xì)胞位于柑橘植物中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的柑橘植物細(xì)胞，其中所述植物選自由橙和葡萄柚組成的組。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11的柑橘植物細(xì)胞，所述柑橘植物細(xì)胞進(jìn)一步包括肽，所述肽具有 與 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:7 或 SEQ ID N0:8 具有至少大約 99% 同一性的 氨基酸序列。
15. -種柑橘植物，所述柑橘植物包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括，在5'至3'方向 上： 表達(dá)控制序列； 與所述表達(dá)控制序列可操作地連接的外源核酸；和 與所述外源核酸可操作地連接的3'終止序列，其中所述外源核酸包括與選自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31組成的組的核酸序列具有至少98%同 一性的核酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的柑橘植物，其中所述植物選自由橙和葡萄柚組成的組。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15的柑橘植物，所述柑橘植物進(jìn)一步包括肽，所述肽具有與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8具有至少大約99%同一性的氨基酸序 列。
18. -種柑橘植物細(xì)胞，所述柑橘植物包括 (a) 第一表達(dá)載體，所述第一表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上： 第一表達(dá)控制序列； 與所述第一表達(dá)控制序列可操作地連接的第一外源核酸；和 與所述第一外源核酸可操作地連接的第一 3'終止序列，其中所述第一外源核酸包括與 選自由 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :30 組成的 組的核酸序列具有至少98%同一性的核酸序列；以及 (b) 第二表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上： 第二表達(dá)控制序列； 與所述第二表達(dá)控制序列可操作地連接的第二外源核酸；和 與所述第二外源核酸可操作地連接的第二3'終止序列，其中所述第二外源核酸包括與 選自由 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO :31 組成 的組的核酸序列具有至少98%同一性的核酸序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的柑橘植物，其中所述植物選自由橙和葡萄柚組成的組。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18的柑橘植物，所述柑橘植物進(jìn)一步包括： 第一肽，所述第一肽具有與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :7具有至少大約99%同一性的 氨基酸序列；和 第二肽，所述第二肽具有與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :8具有至少大約99%同一性的 氨基酸序列。
21. -種在柑橘植物中表達(dá)包括編碼被表達(dá)肽的核酸序列的外源核酸的方法，所述方 法包括： 使包括所述外源核酸的表達(dá)盒或者包括所述外源核酸的表達(dá)載體與所述柑橘植物的 細(xì)胞胞質(zhì)在允許所述外源核酸表達(dá)并允許所述被表達(dá)肽形成的條件下接觸， 其中所述外源核酸包括與選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :30 和 SEQ ID NO :31組成的組的核酸序列具有至少98%同一性的核酸序列， 所述表達(dá)盒或表達(dá)載體包括，在5'至3'方向上，表達(dá)控制序列，與所述表達(dá)控制序列 可操作地連接的外源核酸，和與所述外源核酸可操作地連接的3'終止序列，并且 所述被表達(dá)肽包括與選自由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7和SEQ ID NO : 8組成的組的氨基酸序列具有至少99%同一性的氨基酸序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述接觸進(jìn)一步包括將細(xì)胞與包括所述表達(dá)載體或 所述表達(dá)盒的農(nóng)桿菌細(xì)胞共培養(yǎng)以形成共培養(yǎng)的細(xì)胞。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，所述方法進(jìn)一步包括從共培養(yǎng)的細(xì)胞再生植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104244705SQ201380017222
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月27日
【發(fā)明者】T·E·米爾可夫, J·岡薩雷斯-拉莫斯 申請(qǐng)人:德克薩斯A&M大學(xué)系統(tǒng)