專利名稱：持效控制蚊蟲孳生并防止其產生抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物控制蚊蟲的方法，具體地說是將不同來源的殺蚊毒素基因共同導入藍藻表達，并把這種基因工程改造的藍藻釋放到自然水體中持效抑制蚊幼蟲孳生的方法。
蚊子是瘧疾、腦炎、登革熱等流行病的傳播媒介，蚊蟲叮咬也會影響人們的工作和生活。通常對蚊蟲的控制，主要是借助于化學殺蟲劑的使用和生物防治措施。化學殺蟲劑顯效快，易于操作；但費用高，造成環(huán)境污染，并已導致蚊蟲抗性。生物防治措施包括使用細菌制劑和捕食性動物。細菌制劑中有球形芽孢桿菌和蘇云金桿菌以色列亞種兩類，由于芽孢和伴孢晶體迅速沉淀，有效成分不能對生活于上層的蚊幼蟲發(fā)揮作用，故持效時間短。捕食動物的使用往往局限于特定水體，并且操作較復雜。研究發(fā)現，將來源于“蘇云金桿菌以色列亞種”或“球形芽孢桿菌”的殺蚊毒素基因導入藍藻(或稱藍細菌)，可獲得對蚊幼蟲的毒殺力。由于藍藻在自然水體有繁殖力，并可漂浮于水體上層，從而較大程度地提高了對蚊幼蟲的持續(xù)控制時間。但是，目前已有的殺蚊藍藻只表達一個來源的殺蚊毒素基因，經歷一段時間的使用后，蚊蟲可產生抗性。
本發(fā)明的目的就在于克服現有技術存在的問題，而提供一種既持效控制蚊蟲孳生又防止其產生抗性的方法。
本發(fā)明目的是這樣實現的，即在藍藻同時表達兩個來源共三種殺蚊毒素基因。由于多種毒素的存在，蚊蟲對基因工程藍藻產生抗性的機會將大大減少。具體地說，是將“蘇云金桿菌以色列亞種”的毒素蛋白基因cryllA和cytlA以及“球形芽孢桿菌”的二元毒素基因共同導入絲狀固氮藍藻(如魚腥藻、念珠藻)表達，并把這種基因工程藍藻噴施到蚊幼蟲孳生水體。總體方案為1)將cryllA和cytlA基因串聯(lián)克隆并裝置到強啟動子PpsbA下游，與“球形芽孢桿菌”的二元毒素基因(即51kDa和42kDa蛋白基因)共同克隆入大腸桿菌-魚腥藻穿梭質粒；2)將含有殺蚊毒素基因的穿梭質粒通過接合轉移的方法導入絲狀固氮藍藻；3)將轉基因藍藻大量培養(yǎng)，噴灑到有蚊幼蟲孳生的水體中。
本發(fā)明和現有滅蚊技術相比較有以下優(yōu)點和積極效果1)無化學殺蟲劑造成的污染，對人畜安全；2)在自然水體中具有持久滅殺蚊幼蟲的效果；3)防止蚊幼蟲抗性的發(fā)生。
下面結合實施例進一步說明含有殺蚊毒素基因的穿梭質?？蓪攵鄠€魚腥藻藻株，如中國淡水藻種庫(湖北武漢，中國科學院水生生物研究所)中保藏的魚腥藻171號、318號、418號、583號、595號和709號等。多種藻株轉基因后顯示相似殺蚊幼毒效，混合使用可提高對不同水質的適應性。
使用芽孢桿菌制劑可緩解化學殺蟲劑帶來的環(huán)境污染和日益顯著的蚊蟲抗性問題，但球形芽孢桿菌制劑一般持效在兩個星期以內，蘇云金桿菌以色列亞種持效在3～4天以內，之后蚊幼蟲可重新在水體中孳生。反復噴灑導致費用增高，并且蚊蟲已開始出現對球形芽孢桿菌的抗性。在以前的研究中曾利用藍藻表達一種或兩種單一來源的殺蚊毒素基因，易于引起蚊蟲抗性。
本發(fā)明同時將cryllA和cytlA基因和51kDa和42kDa殺蚊蛋白基因共同在絲狀固氮藍藻表達，其中可利用的絲狀固氮藍藻包括所有在分類學上隸屬于魚腥藻屬和念珠藻屬的藻株。其中cytlA和二元毒素基因之間具有協(xié)同作用，可抑制蚊蟲抗性發(fā)生，加上cryllA基因效果更為顯著，并擴大殺蚊譜。藍藻殺蚊劑在自然水體中可持續(xù)控制蚊蟲孳生2～3個月。
實施例1在城鎮(zhèn)居民區(qū)附近的靜止小水體中常有蚊幼蟲孳生，將本發(fā)明中表達多種殺蚊毒素基因的不同藍藻株混合噴灑到水體表面，在初始濃度達每毫升十萬個細胞時，可在48小時內殺死幾乎全部蚊幼蟲，并在兩個月內水體中保持無蚊蟲孳生，三個月后蚊幼蟲密度仍保持在很低水平。
實施例2在農村水稻種植區(qū)和城郊沼澤地有大量蚊蟲孳生，由于面積大，若反復噴灑芽孢桿菌制劑，在費用和人力條件方面均不許可。利用本發(fā)明中的殺蚊幼藍藻經一次噴灑可在較長時間內達到持續(xù)控制蚊蟲的目的。
實施例3由于長期使用某種化學殺蟲劑或球形芽孢桿菌制劑殺滅蚊蟲的地區(qū)，蚊蟲可形成抗性，從而使殺蟲制劑失去效力。此時使用本發(fā)明中的殺蚊幼藍藻可殺滅抗性蚊蟲，在較長時間內把蚊蟲控制在較低的密度，克服其抗性問題。
由于本發(fā)明具有以上優(yōu)點和積極效果，而且性能價格比高，操作方便，故有廣闊的應用前景。
權利要求
1.一種持效控制蚊蟲孳生并防止其產生抗性的方法，其特征是在藍藻同時表達兩個來源共三種殺蚊毒素基因，即將蘇云金桿菌以色列亞種的毒素蛋白基因cryllA和cytlA以及球形芽孢桿菌的二元毒素基因共同導入絲狀固氮藍藻(如魚腥藻、念珠藻)表達，并把這種基因工程藍藻噴施到蚊幼蟲孳生水體；總體方案為①將來自蘇云金桿菌以色列亞種的cryllA和cytlA基因串聯(lián)克隆并裝置到強啟動子PpsbA下游，與球形芽孢桿菌的二元毒素基因(即51kDa和42kDa蛋白基因)共同克隆入大腸桿菌-魚腥藻穿梭質粒；②將含有殺蚊蛋白基因的穿梭質粒通過接合轉移方法導入絲狀固氮藍藻；③將轉基因藍藻大量培養(yǎng)，噴灑到有蚊幼蟲孳生的水體中。
2.按照權利要求1所述的一種持效控制蚊蟲孳生并防止其產生抗性的方法，其特征在于將cryllA和cytlA基因和51kDa和42kDa殺蚊蛋白基因共同在絲狀固氮藍藻表達，其中可利用的絲狀固氮藍藻包括所有在分類學上隸屬于魚腥藻屬和念珠藻屬的藻株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物控制蚊蟲的方法。為了克服蚊蟲對于單種毒素可能產生抗性的問題，本發(fā)明是在藍藻同時表達兩個來源共三種殺蚊毒素基因，并把這種基因工程改造的藍藻釋放到自然水體中，是一種既持效控制蚊蟲孳生又防止其產生抗性的方法。由于本發(fā)明高效、安全、操作方便，故有廣闊的應用前景。
文檔編號A01N63/00GK1401244SQ0112832
公開日2003年3月12日 申請日期2001年8月8日 優(yōu)先權日2001年8月8日
發(fā)明者孔任秋, 徐旭東 申請人:中國科學院水生生物研究所