專利名稱：與蘇麥3號赤霉病抗性主效qtl緊密連鎖的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及小麥育種和分子生物學領域，通過利用與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記進行輔助育種，以提高小麥抗赤霉病育種的效率。尤其是一種與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記及其應用。
背景技術：
小麥赤霉病是溫暖、潮濕麥區(qū)的重要病害，主要由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起。小麥赤霉病不僅造成嚴重的產(chǎn)量損失，而且病麥粒殘留的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)等真菌毒素，嚴重威脅人畜的健康，培育抗病品種是防治這一病害最經(jīng)濟和有效的手段。大量前人工作(柏貴華，上海農(nóng)業(yè)學報，1989，5(4)17～23；Sinijders CHA，Euphytica，1990，5011～18；Singh RP，Plant Disease，1995，79238～240；van Ginkel M，Plant Disease，1996，80863～867；Bai G-H，Theor.Appl.Genet.，2000，1001～8.)已表明，小麥的赤霉病抗性是由2-3對主效基因控制以及數(shù)量不詳?shù)奈⑿Щ蚬餐揎椀臄?shù)量性狀，遺傳機制較為復雜。小麥赤霉病的抗性鑒定受環(huán)境因素影響較大，鑒定十分困難，不僅需要一定的控溫、控濕措施，而且只能在小麥開花期進行，費時費力，也是導致小麥抗赤霉病育種進展緩慢的重要原因。
近幾年發(fā)展起來的分子標記輔助育種技術，有效地解決了這一問題，通過構(gòu)建重要抗源的遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(Quantitative Trait Loci，QTL)分析，可以找到與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖(或共分離)的分子標記。使用與某一特定抗源抗赤性主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以對該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在苗期進行早世代篩選，淘汰不抗病的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率。
蘇麥3號是江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蘇州地區(qū)農(nóng)科所培育的抗赤霉病小麥，已成為全世界廣泛使用的赤霉病重要抗源，近年來國內(nèi)外學者對該品種及其衍生系的小麥赤霉病抗性QTLs的遺傳作圖和定位進行了大量研究，在3B染色體的短臂發(fā)現(xiàn)可以解釋40％以上赤霉病抗性的主效QTL(Waldron，1999；Bai，1999；Anderson，2001；Buerstmayr，2002；周淼平，2003；2004)。與該QTL連鎖的分子標記Xgwm533和Xgwm493已用于分子標記輔助育種，但Xgwm533-Xgwm493的QTL區(qū)段長度一般達到8.3-24.0cM，在實際應用中直接影響了分子標記輔助育種的精度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對目前已經(jīng)公開的與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記Xgwm533-Xgwm493的QTL區(qū)段的長度一般達到8.3-24.0cM，在實際應用中直接影響了分子標記輔助育種的精度，通過對蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL進行精細定位，提供一種與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL更緊密連鎖的分子標記及其應用。
本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的一種與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特征在于，用小麥品種蘇麥3號的DNA，分別采用PCR引物對5’AAGGCGAATCAAACGGAATA3’和5’GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC3’及5’CACACATTAAAACCAGATTCAGAGGA3’和5’TCTCTCTCTCTCTCACACACAC3’進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得大小為316bp和205bp的分子標記Xgwm533和stm748tcac。
在本發(fā)明中所述的小麥品種蘇麥3號的DNA是指對蘇麥3號小麥植株的葉片，分離提取獲得的DNA；所述的6％聚丙烯酰胺凝膠是指100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺。
一種上述與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記的應用，其特征在于將分子標記Xgwm533和stm748tcac用于蘇麥3號及其衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性。
在本發(fā)明的應用中是將蘇麥3號及其衍生品種或品系為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上，獲取它們的DNA，然后用Xgwm533和stm748tcac的引物對這些DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，評判這兩個標記是否同時存在，來預測該品種或品系是否具有赤霉病抗性。
在本發(fā)明的應用中所述小麥品種或品系是指蘇麥3號及其衍生品種或品系，蘇麥3號衍生品種或品系是指以蘇麥3號為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
在本發(fā)明的應用中所述的基因型檢測是指檢測蘇麥3號及其衍生品種或品系的DNA中是否存在與小麥品種蘇麥3號的赤霉病主效QTL相連鎖的分子標記Xgwm533和stm748tcac；只有在兩個分子標記同時出現(xiàn)時，則預測該小麥的赤霉病的抗性達到“中抗”以上水平，否則為“感”。
在本發(fā)明的應用中所述的“中抗”以上水平是指小麥赤霉病達到“抗病”或“中抗”，小麥赤霉病的病小穗率小于10％為“抗病”，病小穗率達到10.1-25.0％，為“中抗”，所述的“感”是指小麥赤霉病的病小穗率在25.1％以上。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明與目前使用的與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記Xgwm533-Xgwm493一樣，都能克服常規(guī)育種中小麥赤霉病抗性鑒定易受環(huán)境影響，并且只能在開花期鑒定篩選的缺點，在苗期就可通過檢測分子標記對小麥植株的赤霉病抗性進行預測和篩選，淘汰感病植株，減少人力物力的浪費，提高育種效率；由于Xgwm533-stm748tcac的QTL區(qū)段在長度只有1.0cM(參見圖1)，與目前使用的分子標記相比，更能提高蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL分子標記輔助選擇的效率。


圖1是蘇麥3號3B染色體主效QTL分析的LOD值分布圖。
圖中左邊為3B染色體遺傳連鎖圖，標記間的圖距已用數(shù)據(jù)標出；右邊的曲線圖為QTL的LOD值分布圖，虛線為3.0閾值。
具體實施例方式
實施例1Xgwm533和stm748tcac兩個分子標記對抗赤霉病品種蘇麥3號和感赤霉病品種安農(nóng)8455赤霉病抗性預測首先，從小麥品種蘇麥3號和安農(nóng)8455的植株分別分離提取葉片的DNA；將獲得的DNA分別采用PCR引物對5’AAGGCGAATCAAACGGAATA3’和5’GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC3’及5’CACACATTAAAACCAGATTCAGAGGA3’和5’TCTCTCTCTCTCTCACACACAC3’進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)上電泳分離后，根據(jù)能否獲得大小為316bp和205bp的分子標記Xgwm533和stm748tcac預測小麥品種的赤霉病抗性，如果同時存在這兩個標記，預測該小麥品種赤霉病抗性達到“中抗”以上，如果兩個標記都不存在，預測該小麥品種“感”赤霉病。結(jié)果見表1，預測結(jié)果與實際鑒定結(jié)果完全吻合。
表1小麥品種的赤霉病抗性預測

實施例2蘇麥3號衍生的品系赤霉病抗性預測采用蘇麥3號的衍生系中國春-蘇麥3號3B染色體代換系與安農(nóng)8455雜交后，繁衍到F6代的后代，先從它們的葉片中分離DNA，然后用Xgwm533和stm748tcac的引物對這些DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，評判這兩個標記是否同時存在，同時存在，說明該品系赤霉病抗性達到“中抗”以上水平，不能同時存在則為“感”。定義小麥赤霉病的病小穗率小于10％為“抗病”，病小穗率達到10.1-25.0％，為“中抗”，病小穗率在25.1％以上為“感病”?；谶@些判定方法和標準對每個小麥植株的赤霉病抗性進行預測，隨后利用接種赤霉病病原菌的方法測定受測樣品的赤霉病實際抗性并與預測結(jié)果進行對比，預測結(jié)果與實測結(jié)果非常吻合。結(jié)果參見附表2。
表2蘇麥3號衍生系的赤霉病抗性預測


注CA004-CA093均為中國春-蘇麥3號3B染色體代換系與安農(nóng)8455雜交后，繁衍到Fb代的后代品系上述實施例不是對本發(fā)明的具體限制，在具體實施時，可以運用本發(fā)明涉及的大小為316bp和205bp的分子標記Xgwm533和stm748tcac對蘇麥3號衍生品種或品系是否具有赤霉病抗性進行預測。所述的蘇麥3號衍生品種或品系是指以蘇麥3號為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化等成熟的傳統(tǒng)方法獲得的小麥品種或品系。
權利要求
1.一種與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特征在于，用小麥品種蘇麥3號的DNA，分別采用PCR引物對5’AAGGCGAATCAAACGGAATA3’和5’GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC3’及5’CACACATTAAAACCAGATTCAGAGGA3’和5’TCTCTCTCTCTCTCACACACAC3’進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得大小為316bp和205bp的分子標記Xgwm533和stm748tcac。
2.根據(jù)權利要求1所述的小麥赤霉病抗源蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特征在于所述的小麥品種蘇麥3號的DNA是指對蘇麥3號小麥植株的葉片，分離提取獲得的DNA；所述的6％聚丙烯酰胺凝膠是指100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺。
3.一種如權利要求1所述的分子標記的應用，其特征在于將分子標記Xgwm533和stm748tcac用于蘇麥3號及其衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性。
4.根據(jù)權利要求3所述的分子標記的應用，其特征在于是將蘇麥3號及其衍生品種或品系為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上，獲取它們的DNA，然后用Xgwm533和stm748tcac的引物對這些DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，評判這兩個標記是否同時存在，來預測該品種或品系是否具有赤霉病抗性。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的分子標記的應用，其特征在于所述小麥品種或品系是指蘇麥3號及其衍生品種或品系，蘇麥3號衍生品種或品系是指以蘇麥3號為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
6.根據(jù)權利要求3或4所述的分子標記的應用，其特征在于所述的基因型檢測是指檢測蘇麥3號及其衍生品種或品系的DNA中是否存在與小麥品種蘇麥3號的赤霉病主效QTL相連鎖的分子標記Xgwm533和stm748tcac；只有在兩個分子標記同時出現(xiàn)時，則預測該小麥的赤霉病的抗性達到“中抗”以上水平，否則為“感”。
7.根據(jù)權利要求6所述的分子標記的應用，其特征在于所述的“中抗”以上水平是指小麥赤霉病達到“抗病”或“中抗”，小麥赤霉病的病小穗率小于10％為“抗病”，病小穗率達到10.1-25.0％，為“中抗”，所述的“感”是指小麥赤霉病的病小穗率在25.1％以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記及其應用。該分子標記Xgwm533和stm748 tcac的大小分別為316bp和205bp。該分子標記可以用于蘇麥3號及其衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性。其優(yōu)點在于與目前使用的分子標記Xgwm533－Xgwm493相比，其QTL區(qū)段在長度只有1.0cm，它更能提高蘇麥3號的赤霉病抗性主效QTL分子標記輔助選擇的效率。
文檔編號A01H1/00GK1955313SQ20061009635
公開日2007年5月2日 申請日期2006年9月21日 優(yōu)先權日2006年9月21日
發(fā)明者周淼平, 余桂紅, 張旭, 任麗娟, 馬鴻翔, 陸維忠 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院