栽培番茄scf復(fù)合體亞單位cul1蛋白序列及其核酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】的栽培番茄SCF復(fù)合體亞單位CUL1蛋白序列及其核酸序列；本發(fā)明涉及的栽培番茄SCF復(fù)合體亞單位CUL1蛋白序列如SEQ?ID?NO.3所示；本發(fā)明還涉及編碼前述CUL1蛋白序列的核酸序列。利用本發(fā)明的CUL1蛋白基因，可以篩選出與之相關(guān)或者發(fā)生相互作用的物質(zhì)、受體、抑制劑以及拮抗劑等；利用本發(fā)明可以通過基因工程手段過表達(dá)或低表達(dá)該基因，進(jìn)一步研究由S-核酸酶介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制，對(duì)獲得能夠克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的野生番茄品種以及番茄品種的改良具有重要的理論支撐。
【專利說明】栽培番茄SCF復(fù)合體亞單位CUL1蛋白序列及其核酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種栽培番茄SCF復(fù)合體亞單位CULl蛋白序列及其核酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺(Solanum Iycopersicum),屬于爺科番爺屬，是世界重要的蔬菜作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，現(xiàn)被廣泛栽培于世界各地。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織2013年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2011年全球番茄種植面積4.73X IO6公頃，總產(chǎn)量達(dá)1.59X IO8噸，生產(chǎn)總值為5.82X 101°美元，在全球糧農(nóng)產(chǎn)品中占第八位。
[0003]在番茄栽培生產(chǎn)中，由于葉霉病，灰霉病，以及各種蟲害的發(fā)生，常給番茄產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。野生種及其近緣野生種具有多種特質(zhì)，為改良育種提供了豐富的資源，但由于多數(shù)野生種番茄的果實(shí)較少，產(chǎn)量低，風(fēng)味差，且在保種上有一定的難度，無法直接應(yīng)用于生產(chǎn)，因此通過遠(yuǎn)緣雜交將野生番茄的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到栽培番茄中成為育種的主要技術(shù)。
[0004]自交不親和性是廣泛存在于開花植物的種內(nèi)生殖障礙。番茄由于同時(shí)存在自交不親和自交親和兩種生殖機(jī)制，因此成為研究自交不親和的模式植物。嚴(yán)格的自交不親和性以及相應(yīng)的與普通番茄種間雜交的單側(cè)不親和性，成為番茄遺傳研究和育種工作最大的障礙。因此對(duì)于番茄自交不親和機(jī)制的研究越來越多。目前研究發(fā)現(xiàn)茄科、薔薇科、玄參科均是由雌配子決定因子S —核酸酶和花粉決定因子SLF介導(dǎo)的一類自交不親和。SLF是F-box家族的一員，參與SCF 復(fù)合體的組成，已成為研究最深而且最多的一個(gè)亞基，在擬南芥已發(fā)現(xiàn)的SLF基因已有700多種。
[0005]泛素介導(dǎo)的蛋白水解是生物體中蛋白質(zhì)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，是生物代謝的調(diào)控中心。而SCF復(fù)合體是泛素降解系統(tǒng)中最大的一類E3泛素連接酶復(fù)合體，通過介導(dǎo)多種信號(hào)蛋白和調(diào)控蛋白的泛素化來調(diào)控細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄水平，是多種生物代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。SCF復(fù)合體屬于RING類的泛素連接酶，廣泛存在于真核生物中，是植物中最大的一類多亞基E3酶，由⑶L1、SKPU RBXUF-Box四個(gè)亞基組成。⑶LI是SCF復(fù)合體的中心，具有橋梁的作用，通過一側(cè)的長(zhǎng)柄狀結(jié)構(gòu)與SKPl結(jié)合通過SKPl接頭作用與F-Box家族蛋白連接，另一側(cè)的球狀區(qū)域與RBXl形成一個(gè)二亞基催化中心，利用RBXl的RING鋅指結(jié)構(gòu)與E2泛素結(jié)合酶相作用，最后完成底物蛋白的識(shí)別和泛素化。目前發(fā)現(xiàn)真核生物中CUL蛋白存在五個(gè)同源家族。CULl蛋白是CUL家族中最早被分離出來的一類，目前已在許多物種中的被克隆分離出來，如擬南芥、矮牽牛、梨、金魚草。⑶LI蛋白由N端415個(gè)氨基酸以及C端360個(gè)氨基酸組成，N端具有由五個(gè)螺旋組成的三個(gè)重復(fù)區(qū)域，C端由4HB (4螺旋束)組成且高度保守，從4HB開始的200個(gè)堿基被認(rèn)為是CUL蛋白家族的同源區(qū)域(包含H24螺旋、部分折疊片，WH-A區(qū)域)。
[0006]目前的研究已經(jīng)對(duì)于SCF復(fù)合體在自交不親和中的的作用和功能已經(jīng)有了部分證據(jù)。通過研究對(duì)比栽培番茄中的⑶LI基因組成，有助于加深對(duì)自交不親和和單側(cè)雜交不親和機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而為克服遠(yuǎn)緣雜交，改良番茄育種提供了理論基礎(chǔ)。經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同或者相似的技術(shù)主題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種栽培番茄SCF復(fù)合體亞單位CULl蛋白序列及其核酸序列。本發(fā)明公開了栽培番茄中SCF復(fù)合體E3泛素連接酶亞基CULl的編碼序列；利用本發(fā)明公開的基因序列，通過轉(zhuǎn)基因手段過表達(dá)或低表達(dá)該基因，可以進(jìn)一步研究對(duì)于S —核酸酶介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制，同時(shí)對(duì)于番茄遠(yuǎn)緣雜交不親和具有重要的理論支撐，進(jìn)而對(duì)于番茄品種的形狀改良具有重要的意義。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
[0009]第一方面，本發(fā)明涉及一種分離的栽培番茄CLN1621F E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白序列，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]第二方面，本發(fā)明還涉及一種編碼前述⑶LI蛋白序列的核酸序列。
[0011]優(yōu)選地，所述核酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]優(yōu)選地，所述核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]第三方面，本發(fā)明還涉及一種編碼前述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，所述用途是利用基因工程手段或者干擾手段，調(diào)控所述核酸序列的表達(dá)，進(jìn)而引起S-核酸酶介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制，獲得改良的番茄品種。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:利用本發(fā)明的CULl蛋白，可以篩選出與之相關(guān)或者發(fā)生相互作用的物質(zhì)、受體、抑制劑以及拮抗劑等；利用本發(fā)明可以通過基因工程手段，進(jìn)一步研究由S-核酸酶介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制，對(duì)于番茄品種的改良具有重要的意義。
[0015]同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，當(dāng)明確本發(fā)明的核酸序列后，與SEQ ID N0.1第1-5494位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-5494位的核苷酸序列雜交；這些序列顯然也屬于本發(fā)明的保護(hù)范疇；此外，具有SEQ ID N0.2所示的cDNA序列以及SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范疇。
[0016]本發(fā)明根據(jù)茄科基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段，通過序列比對(duì)和電子拼接，設(shè)計(jì)出合適的引物，利用分子克隆的方法，克隆出栽培番茄CLN162IF中E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白基因；在番茄中⑶LI基因有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子組成，但在第七個(gè)外顯子中含有一個(gè)終止密碼子，產(chǎn)生了長(zhǎng)度為252氨基酸的蛋白。
[0017]此外本發(fā)明涉及大腸桿菌DH5 a BL-21菌株，該菌已在薩姆布魯克J，拉塞爾DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[Μ]。黃培棠，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第三版.北京:科技出版社，2002，中公開。大腸桿菌DH5aBL-21菌株、pMD19-T Simple載體、膠回收試劑盒等均可通過商業(yè)渠道取得。
[0018]在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
[0019]在本發(fā)明中，術(shù)語“E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白編碼序列”指編碼具有E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白活性的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與栽培番茄E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI相同功能蛋白的SEQ ID N0.2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
[0020]在本發(fā)明中，術(shù)語“E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白”指能夠參與E3泛素連接酶SCF復(fù)合體組成的CULl蛋白。該術(shù)語還包括具有與栽培番茄E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位CULl相同功能的、SEQ ID N0.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。
[0021 ] 本發(fā)明的E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位CULl蛋白相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位CULl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0022]在本發(fā)明中，“E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白”指與SEQ ID N0.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0023]表1
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的栽培番茄CLN1621F E3泛素連接酶SCF復(fù)合體亞單位⑶LI蛋白序列，其特征在于，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.2所示。
4.如權(quán)利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.1所示。
5.一種編碼如權(quán)利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，其特征在于，所述用途是利用基因工程手段或者干擾手段，調(diào)控所述核酸序列的表達(dá)，進(jìn)而引起S-核酸酶介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制，獲得改良的番茄品種。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK103695378SQ201310686929
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】趙凌俠, 高美鳳, 彭會(huì)珍, 陳露露, 瞿海鷗 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)