一種北冬蟲(chóng)夏草的特異pcr鑒真方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種北冬蟲(chóng)夏草的特異PCR鑒真方法。其技術(shù)方案是以樣品的基因組DNA為模板，采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異PCR引物，進(jìn)行一次單管特異PCR反應(yīng)，擴(kuò)增冬北冬蟲(chóng)夏草的特征性持家基因，實(shí)際擴(kuò)增片斷為417bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷樣品的真實(shí)性。本發(fā)明可特異性識(shí)別北冬蟲(chóng)夏草，只需DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)三步即可完成對(duì)北冬蟲(chóng)夏草及其菌絲體、菌粉和膠囊等不同劑型產(chǎn)品的真實(shí)性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、易于掌握、準(zhǔn)確性高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種北冬蟲(chóng)夏草的特異PCR鑒真方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于新資源保健食品鑒真領(lǐng)域，具體涉及北冬蟲(chóng)夏草的鑒真方法。
【背景技術(shù)】
[0002]北冬蟲(chóng)夏草科學(xué)名為蛹蟲(chóng)草(Cbr辦ce/75.mi Ii tar is),是一味我國(guó)民間傳統(tǒng)的名貴中藥，其成分和功效與冬蟲(chóng)夏草相似，既能加工成藥品保健品，又是餐桌上的佳肴，因此廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。
[0003]作為冬蟲(chóng)夏草替代品，北冬蟲(chóng)夏草具有可人工栽培，產(chǎn)量高，成本低等優(yōu)點(diǎn)，已形成規(guī)?；a(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2012年北冬蟲(chóng)夏草的生產(chǎn)量接近8000噸，市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到近15億元。然而，目前尚沒(méi)有專(zhuān)門(mén)用于北冬蟲(chóng)夏草真假鑒別和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法，產(chǎn)品質(zhì)量難以保證，極大限制了北冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)業(yè)的升級(jí)和規(guī)范發(fā)展。
[0004]因此，在北冬蟲(chóng)夏草生產(chǎn)和流通過(guò)程中，亟需一種有效、快速、準(zhǔn)確的鑒真方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其品質(zhì)的控制和管理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可用于北冬蟲(chóng)夏草鑒真的可靠方法。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了北冬蟲(chóng)夏草性持家基因的特異PCR引物，通過(guò)一次單管PCR反應(yīng)，擴(kuò)增北冬蟲(chóng)夏草特征性持家基因，實(shí)際擴(kuò)增片斷為417bp。
[0007]用于北冬蟲(chóng)夏草鑒真的引物序列如下:
上游引物 CICC- Cor -Fl:5，- AGCGAAACCCGTCTATCACC -3，
下游引物 CICC- Cor -Rl:5，- CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT -3，。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1)犾取樣品基因組DNA；
2)采用上述引物在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0009]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán):95°C 30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸5min。
[0010]3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。
[0011]4)樣品的真實(shí)性判斷
在紫外燈下查看電泳條帶，在417bp處有明亮條帶的為北冬蟲(chóng)夏草，無(wú)條帶者為偽品。
[0012]本發(fā)明經(jīng)過(guò)充分的前期試驗(yàn)篩選和優(yōu)化，得到的引物特異性強(qiáng)，PCR擴(kuò)增條件簡(jiǎn)單，采用一次單管特異PCR反應(yīng)后，通過(guò)電泳檢測(cè)便可鑒別產(chǎn)品真?zhèn)危僮骱?jiǎn)單，成本低，準(zhǔn)確度高，具有很好的應(yīng)用前景。
[0013]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為北冬蟲(chóng)夏草7?/貨7基因特異性引物設(shè)計(jì)示意圖，其中有下劃線(xiàn)的部分為擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，有下劃線(xiàn)的斜體部分為所設(shè)計(jì)的引物特異性結(jié)合位點(diǎn)。
[0015]圖2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，1-DL2000 Marker, 2_北冬蟲(chóng)夏草，3-冬蟲(chóng)夏草菌粉，4-蝙蝠蛾擬青霉，5-亞香棒蟲(chóng)草，6-陰性對(duì)照，7- DL2000Marker0
[0016]具體實(shí)施案例
下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，實(shí)施案例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不會(huì)給本發(fā)明造成任何限制。
[0017]實(shí)施例一:PCR引物的設(shè)計(jì)及其對(duì)樣品的檢測(cè) I北冬蟲(chóng)夏草/?/貨7基因特異PCR引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank上公開(kāi)登錄的北冬蟲(chóng)夏草似貨7基因序列信息進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(見(jiàn)附圖1)。
[0018]參考序列的GenBank登錄號(hào)為JN992491。
[0019]在13-32處設(shè)計(jì)上游引物，命名為CICC-Cor-Fl。序列為:5’ - AGCGAAACCCGTCTATCACC -3’。
[0020]在410-429處設(shè)計(jì)下游引物，命名為CICC-Cor-Rl。序列為:5’ - CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT -3’。
[0021]2樣品的檢測(cè) 2.1樣品的收集
購(gòu)買(mǎi)市售北冬蟲(chóng)夏草、冬蟲(chóng)夏草菌粉、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、亞香棒蟲(chóng)草。
[0022]2.2樣品基因組DNA提取
采用改良CTAB法提取基因組DNA，并使用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。
[0023]2.3基因組DNA的多重PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的 dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
[0024]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán):95°C 30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸5min。
[0025]2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳， 在417bp處出現(xiàn)明亮條帶的為北冬蟲(chóng)夏草，無(wú)條帶為其他樣品(詳見(jiàn)附圖2)。
【權(quán)利要求】
1.一種北冬蟲(chóng)夏草的鑒真方法，其特征在于:經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單的特異PCR反應(yīng)檢測(cè)北冬蟲(chóng)夏草特征性持家基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的北冬蟲(chóng)夏草鑒真方法，其特征在于:用于檢測(cè)北冬蟲(chóng)夏草持家基因的特異PCR引物為: 上游引物 CICC- Cor -Fl:5，- AGCGAAACCCGTCTATCACC -3， 下游引物 CICC- Cor -Rl:5，- CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT -3，。
3.按照權(quán)利要求2所述的北冬蟲(chóng)夏草鑒真方法，其特征在于:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5μ?，2 條引物(10 μ mol/L)各 ?μ?，10 μ mol/L 的dNTP 2μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.5μ?, DNA 模板 1.Ομ?, ddH20 17μ?。
4.按照權(quán)利要求3所述的北冬蟲(chóng)夏草鑒真方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán):95°C 30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸5min。
5.按照權(quán)利要求4所述的北冬蟲(chóng)夏草鑒真方法，其特征在于:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。
6.按照權(quán)利要求5所述的北冬蟲(chóng)夏草鑒真方法，其特征在于:在417bp處有電泳條帶的樣品為北冬蟲(chóng)夏草。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602754SQ201310665903
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】程池, 扎西才吉, 李輝, 姚粟, 劉洋, 白飛榮 申請(qǐng)人:中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 玉樹(shù)藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司