檢測runx1基因第5外顯子突變位點的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測RUNX1基因第5外顯子突變位點的方法和引物，包括擴增RUNX1基因第5外顯子突變位點的正、反向引物和一對測序引物。將Touch-downPCR擴增和Sanger測序相結(jié)合，可快速檢測急性髓性白血病患者體內(nèi)RUNX1基因第5外顯子位點的突變情況。
【專利說明】檢測RUNX1基因第5外顯子突變位點的方法和引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的方法和引物。
【背景技術(shù)】
[0002]急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干/祖細(xì)胞發(fā)生累積性獲得性基因改變，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和凋亡途徑發(fā)生改變的一種惡性疾病。
[0003]RUNXl又稱為AML1，是RUNX轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族中的成員之一，是白血病染色體易位最常見的靶位點。RUNXl是十分重要的轉(zhuǎn)錄因子，可雙向(促進或抑制)調(diào)節(jié)造血相關(guān)因子，從而調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化、凋亡及自我更新。RUNXl點突變?？梢园l(fā)生在骨髓增生異常綜合征(MDS)、AML、慢性粒單核細(xì)胞白血病(CMML)中，在骨髓增殖性腫瘤(MPN)中較少見。有研究指出，RUNXl的突變率在AML中是32%，MDS中是23%，CMML中是37%。在兒童白血病細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)多種非隨機染色體易位，其中RUNXl受累最多，約占兒童白血病病例30% 以上，如 t (12; 21) (TEL-RUNX1)、t (8; 21) (RUNX1-ET0/MTG8)、t (16; 21) (RUNX 1-MTG16)等。RUNXl突變預(yù)示患者預(yù)后不良。對患者進行RUNXl突變篩查可能有助于進行臨床危險分層和制定治療決策。
[0004]文獻報道中，人們雖然未發(fā)現(xiàn)RUNXl基因存在突變熱點，但是一般都會檢測到它的第1-8外顯子的突變情況。另有文獻報道第3、4、5、8外顯子出現(xiàn)突變的概率較高，本發(fā)明中主要是針對第5外顯子突變情況的檢測。
[0005]目前可用基因突變檢測的方法有限制性片段長度多態(tài)性(SSCP)、基因測序，焦磷酸測序，熒光定量PCR等。SSCP技術(shù)相對簡單，但酶切位點易受基因變異影響，影響結(jié)果判斷，由于方法本身的技術(shù)限制，檢測靈敏度低。采用熒光定量PCR法檢測雖然靈敏度較高，用時較短，但并不適用于RUNXl基因第5外顯子突變的檢測。原因在于檢測該基因的外顯子序列較長并且主要涉及5個突變位點，且第198位氨基酸位點的突變和第202位氨基酸位點的突變，都可以發(fā)生在兩個連續(xù)的堿基，即第198位氨基酸位點的592G>A突變、593Α>t突變，第202位氨基酸位點的601C>T突變、602G>A突變。熒光定量PCR (探針法)主要適用于檢測單個堿基的突變，若要檢測多個突變位點，則需要設(shè)計設(shè)計多對引物和多條探針，并進行多管PCR反應(yīng)，同時還需使用相配套的實時熒光PCR儀，這會增加檢測成本和樣本DNA用量，而熒光定量PCR的染料法檢測基因突變存在引物特異性差的問題，檢測結(jié)果假陽性率高。焦磷酸測序技術(shù)由于檢測的有效片段僅50bp左右，如果發(fā)生突變的多個位點之間相隔超過50bp的話，那么需要設(shè)計多對測序引物，并進行多管PCR反應(yīng)，這也會成倍增加檢測成本和樣本DNA用量。此外，現(xiàn)有技術(shù)僅僅是檢測突變發(fā)生概率較高的單位點突變，而沒有檢測第5外顯子的整體突變情況。
[0006]本發(fā)明采用Touch-down PCR擴增和Sanger測序法檢測RUNXl基因第5外顯子的突變，并且設(shè)計的引物可以擴展整個第5外顯子，包括待檢測的所有突變位點。Touch-downPCR擴增可確保正、反向擴增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴增發(fā)生的水平時，特異性擴增產(chǎn)物在此時已經(jīng)有一個幾何數(shù)的起始優(yōu)勢，豐度較高，在剩余的擴增反應(yīng)中，特異性擴增產(chǎn)物與非特異擴增產(chǎn)物產(chǎn)生競爭，但是因非特異性擴增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴增產(chǎn)物。而Sanger測序法是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的引物，其特征在于，包括:擴增RUNXl基因第5外顯子突變位點的正、反向引物；其堿基序列為:
[0008]RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0009]RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0010]進一步地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為[0011 ] RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0012]RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0013]進一步地,所述正、反向引物的使用濃度比為:RUNXl-exon5-F: RUNXl_exon5-R=l:1o
[0014]進一步地，所述一對測序引物的使用濃度比為:RUNXl-exon5-S-F:RUNXl-exon5-S-R=1:1。
[0015]進一步地，所述正、反向擴增引物的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95 °C預(yù)變性IOmin ;第二階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫·度降低0.5°C ;第三階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度580C 30sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)24次；第四階段，72°C IOmin ;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0016]本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的方法，其包括如下步驟:
[0017](I)提取樣本 DNA;
[0018](2)利用一對擴增引物RUNXl-exon5-F和RUNXl_exon5-R對(I)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物；
[0019](3)利用一對測序引物 RUNXl-exon5-S_F 和 RUNXl-exon5-S_R 對(2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的基因序列；
[0020](4)將(3)中的基因序列與RUNXl基因野生型參考序列RUNXl-ref進行比較，確定突變位點是否存在，其特征在于，
[0021]RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0022]RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG
[0023]RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0024]RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0025]進一步地，步驟(2)的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95°C預(yù)變性IOmin ;第二階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec,延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.50C ;第三階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度58°C 30sec,延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)24次；第四階段，72°C IOmin ;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0026]本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的試劑盒，其特征在于,所述試劑盒包括樣本DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應(yīng)液包括一對擴增產(chǎn)物RUNXl-exon5-F和RUNXl_exon5-R，測序體系反應(yīng)液包括一對測序引物RUNXl-exon5-S_F和RUNXl-exon5-S-R，其特征在于:
[0027]RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0028]RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG
[0029]RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0030]RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0031]進一步地，所述試劑盒還包括RUNXl基因野生型參考序列RUNXl-ref。
[0032]進一步地，所述測序純化液還包括由堿性磷酸酶和核酸外切酶I組成的測序純化液。
[0033]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計了擴增RUNXl基因第5外顯子突變位點的正，反向引物，構(gòu)建了穩(wěn)定的Touch-down PCR擴增體系，對整個第5外顯子進行擴增，包含待檢測的所有突變位點，同時在擴增時，富集正、反向引物與模板正確配對的特異性擴增產(chǎn)物，提高擴增特異性。此外，通過調(diào)整正、反向擴增引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴增效率達到最佳，并采用Sanger測序法，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序反應(yīng)擴增、純化后變性、直接測序檢測RUNXl基因第5外顯子中各突變位點的突變情況，具有靈敏度高、操作簡單和成本低等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1樣本I的檢測結(jié)果圖。
[0035]圖2樣本2的檢測結(jié)果圖。
[0036]圖3樣本3的檢測結(jié)果圖。
[0037]圖4樣本4的檢測結(jié)果圖。
[0038]圖5樣本5的檢測結(jié)果圖。
[0039]圖6樣本6的檢測結(jié)果圖。
[0040]圖7樣本7的檢測結(jié)果圖。
[0041]圖8樣本8的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0043]實施例1
[0044]檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的引物，包括:擴增RUNXl基因第5外顯子突變位點的正、反向引物；其喊基序列為:[0045]RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0046]RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0047]優(yōu)選地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為
[0048]RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
[0049]RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
[0050]在檢測中，先利用上述正、反向引物對RUNXl基因第5外顯子突變位點進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物，然后利用上述一對測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序，獲得擴增產(chǎn)物的基因序列。
[0051]檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的試劑盒，包括:樣本DNA抽提試劑(例如使用天根生物的試劑盒來抽提樣本DNA);無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中
[0052]檢測體系PCR 反應(yīng)液包括:2XPCR Buffer ；2mM dNTPs ；K0D FX DNAPolymerase (IU/u I)；擴增RUNXl基因第5外顯子突變位點的正、反向引物RUNXl-exon5-F(10u m)、RUNXl_exon5-R(10 u m)。
[0053]測序體系反應(yīng)液包括:測序純化液、EDTA(125mmol)、無水乙醇、75%乙醇、HIDI (高度去離子甲酰胺)、測序引物:RUNXl-exon5-S-F(3.2 y m)、RUNXl-exon5_S-R(3.2 u m),以及Bigdye Terminator V3.1 (購買自美國Applied Biosystems公司),其中測序純化液包括蝦堿性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I (EXONI) 1.2U。
[0054]檢測體系PCR反應(yīng)液試劑配制如下:
【權(quán)利要求】
1.檢測RUNXl基因第5外顯子突變位點的引物，其特征在于，包括:擴增RUNXl基因第5外顯子突變位點的正、反向引物；其堿基序列為:
RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為:
RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
3.如權(quán)利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用濃度比為:RUNXl-exon5-F: RUNXl_exon5-R=l:1。
4.如權(quán)利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一對測序引物的使用濃度比為:RUNXl-exon5-S-F: RUNXl-exon5_S-R =1:1。
5.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向擴增引物的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95 0C預(yù)變性IOmin ;第二階段，變性溫度94 °C 30sec，退火溫度64 °C 90sec,延伸溫度72 V 30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5 °C;第三階段，變性溫度94 V 30sec，退火溫度58 V 30sec，延伸溫度72 V 30sec，循環(huán)24次；第四階段，72 V IOmin;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4 1:下保存。
6.一種檢測RUNXl基因第5外顯子突`變位點的方法，其包括如下步驟: (1)提取樣本DNA； (2)利用一對擴增引物RUNXl-exon5-F和RUNXl-exon5-R對(I)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物； (3)利用一對測序引物RUNXl-exon5-S-F和RUNXl-exon5-S-R對(2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增廣物的基因序列； (4)將(3)中的基因序列與RUNXl基因野生型參考序列RUNXl-ref進行比較，確定突變位點是否存在，其特征在于，
RUNXl-exon5-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
RUNXl-exon5-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG
RUNXl-exon5-S-F:ATTAATGATTGGTTATTCAACAG
RUNXl-exon5-S-R:AATCTGAGACATGGTCCCTG。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95V預(yù)變性IOmin ;第二階段，變性溫度94 V 30sec，退火溫度64 V 90sec，延伸溫度720C 30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5 °C ;第三階段，變性溫度94 V30sec，退火溫度58 V 30sec，延伸溫度72 V 30sec，循環(huán)24次；第四階段，72 V IOmin ；第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4 1:下保存。
【文檔編號】C12N15/11GK103710438SQ201310665776
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】李文靜, 周曉犢, 王淑一 申請人:沈陽艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司