一種鏈霉菌及利用其制備兩種抗生素的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鏈霉菌及利用其制備兩種抗生素的方法，鏈霉菌Strepomyces?sp.?PRh5于2013年10月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC?M?2013487。鏈霉菌Strepomyces?sp.?PRh5能夠產(chǎn)生抗生素尼日利亞菌素(nigericin)、諾卡胺素(Nocardamine)，因此可以利用鏈霉菌Strepomyces?sp.?PRh5在制備尼日利亞菌素(nigericin)、諾卡胺素(Nocardamine)，從而為生產(chǎn)具有抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒活性的抗生素尼日利亞菌素(nigericin)及抗分支桿菌的諾卡胺素(Nocardamine)提供了一種新的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鏈霉菌及利用其制備兩種抗生素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種能夠產(chǎn)生抗生素的鏈霉菌Strepomyces sp.PRh5新種，以及利用該菌制備抗生素尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化合物尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。尼日利亞菌素(nigericin)屬于聚醚類(lèi)抗生素(Poly ethers)。大多數(shù)聚醚類(lèi)抗生素都能通過(guò)形成親脂混合物攜帶一價(jià)陽(yáng)離子穿過(guò)生物膜，并作為抗球蟲(chóng)劑和牲畜生長(zhǎng)促進(jìn)劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中Nigericin能夠改善家畜對(duì)蛋白質(zhì)的利用率，并具有較好的抗球蟲(chóng)活性。另外，nigericin還具有抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒活性，如酸熱芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等。
[0003]化合物諾卡胺素(Nocardamine)，屬于大環(huán)內(nèi)酯化合物，諾卡胺素(Nocardamine)有抗菌尤其是抗四環(huán)素耐藥菌株的活性，諾卡胺素(Nocardamine)還能誘導(dǎo)昆蟲(chóng)BM — N4細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，其抗菌作用在于它是一種非常強(qiáng)的鐵鉻合劑，許多微生物不能從諾卡胺素(Nocardamine) —鐵一鉻合物中轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。諾卡胺素(Nocardamine)除在其產(chǎn)生菌細(xì)胞中起運(yùn)載鐵的作用外，對(duì)其它微生物也有抗菌作用，例如分支桿菌。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種鏈霉菌Sirepo焊ces sp.PRh5,命名為鏈霉菌PRh5 {Strepomyces sp.PRh5)，其保藏號(hào)為:CCTCC NO:M 2013487，在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2013年10月23日，保藏單位名稱(chēng):中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0006]本發(fā)明的鏈霉菌sp.PRh5是從東鄉(xiāng)野生稻根際分離獲得。東鄉(xiāng)野生稻，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的緯度最高，分布最北的野生稻，僅分布于海拔48.6 m的江西省東鄉(xiāng)縣崗上積鎮(zhèn)庵家山地區(qū)(28° 14; N、116° 36; E)，是我國(guó)三大普通野生稻之一。常規(guī)PCR擴(kuò)增PRh5的16S rDNA并測(cè)序，其序列如SEQ ID N0.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列號(hào)JQ009377。16S rDNA基因序列分析結(jié)果顯不該菌株與Sire/?indonesiensisDSM41759T的相似度為98.31%。通過(guò)鄰接法清晰地揭示了該菌株與一組鏈霉菌菌屬物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖2)，表明該菌屬于鏈霉菌菌屬的一種。為了進(jìn)一步確定菌株P(guān)Rh5的種的分類(lèi)地位與indonesi ensi s DSM 41759T DNA- DNA 雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果為 54.6%,低于 70% (Stackebrandt, E.&Ebers, J.Taxonomic parameters revisited:tarnishedgold standards Microbiol Today.2006, 33,152-155.)這一基因種的區(qū)分界限，因此我們確定菌株P(guān)Rh5應(yīng)為鏈霉菌屬的一個(gè)新種，并將此菌命名為:鏈霉菌sp.PRh5，該菌于2013年10月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2013487。
[0007]形態(tài)學(xué)特征:在高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基上32° C插片培養(yǎng)7~14 d,取插片分別在光學(xué)顯微鏡下觀察，基內(nèi)菌絲多分支，無(wú)橫隔、無(wú)斷裂現(xiàn)象；氣生菌絲發(fā)育良好，后期孢子鏈自行斷裂，分散，掃描電鏡下觀察，PRh5孢子鏈表面褶皺，孢子鏈呈螺旋生長(zhǎng)，螺旋一般為兩圈半，孢子呈圓球形(圖3)。
[0008]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)鏈霉菌Sirepo焊ces sp.PRh5能夠產(chǎn)生抗生素尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)。因此本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了一種制備抗生素尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的方法,所述的尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備分離得到的。
[0009]本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)以下方法從鏈霉菌Sirepo焊sp.PRh5的發(fā)酵
培養(yǎng)物中制備分離得到抗生素尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine),具體方法如下:
a)制備鏈霉菌sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物，將該發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離開(kāi)，發(fā)酵液經(jīng)石油醚、氯仿梯度萃取，石油醚層經(jīng)減壓濃縮后得到浸膏A ;氯仿層減壓濃縮后得到浸膏B ；
b)將浸膏A經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比70: 30~60: 40進(jìn)行梯度洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯體積比50: 50梯度洗脫下來(lái)的餾分，得尼日利亞菌素(nigericin)。
[0010]c)將浸膏B經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0~0:100進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比90:1梯度洗脫下了的餾分A1，餾分A1經(jīng)LH-20凝膠柱層析，用體積比為1:1的氯仿一甲醇作為流動(dòng)相洗脫，得化合物諾卡胺素(Nocardamine)。
`[0011]所述的a)步驟的制備鏈霉菌sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物是通過(guò)以下方法制備:將活化的鏈霉菌Strepomyces sp.PRh5接入種子培養(yǎng)基中，281^, 150rpm,培養(yǎng)96h制得種子液，將種子液以7.5%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，150 rpm，振蕩培養(yǎng)240h，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含有:玉米粉15g，玉米淀粉 5g，黃豆餅粉 5g，酵母膏 0.5g，KH2P04 0.5g，ΚΝ03 0.5g,，NaCl 0.5g，CaC03 3g，補(bǔ)水至 1L，PH8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為每升培養(yǎng)基中含有:玉米粉44g，玉米淀粉17g，黃豆餅粉5g，酵母膏 0.5g, K2HP04 0.25g, KN03 0.35g,，NaCl 0.5g, CaC03 6g，補(bǔ)水至 1L, pH8.0。
[0012]由于本發(fā)明的鏈霉菌Sirepo焊ces sp.PRh5能夠產(chǎn)生抗生素，因此本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供5^-印0?_7--5.sp.PRh5在制備尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的鏈霉菌焊ces sp.PRh5是鏈霉菌屬i^trepomyces')的一個(gè)新種，該菌能夠產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的抗生素尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine),因此為尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的制備提供了一條新的方法。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)效果是:鏈霉菌sp.PRh5能夠產(chǎn)生抗生素尼日利亞菌素(nigericin)、諾卡胺素(Nocardamine),因此可以利用鏈霉菌sp.PRh5在制備尼日利亞菌素(nigericin)、諾卡胺素(Nocardamine),從而為生產(chǎn)具有抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒活性的抗生素尼日利亞菌素(nigericin)及抗分支桿菌的諾卡胺素(Nocardamine)提供了一種新的方法。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是本發(fā)明的化合物(a)尼日利亞菌素(nigericin)和化合物(b)諾卡胺素(Nocardamine)的結(jié)構(gòu)式；
圖2是本發(fā)明sp.PRh5基于16s rDNA序列的鄰接法重建的與之親緣關(guān)系最近的種之間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
圖3是本發(fā)明焊sp.PRh5的孢子形態(tài)掃描電鏡圖。
[0016]【具體實(shí)施方式】
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制實(shí)施例1:
一、鏈霉菌sp.PRh5的分離和鑒定
鏈霉菌Str印omyces sp.PRh5鑒定中涉及的基因組DNA的提取，16S rDNA的PCR擴(kuò)增，序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立方法以及生理學(xué)、化學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定等，均參考文獻(xiàn)[Jie Li, Guo-Zhen Zhao, Sheng Qin, ffen-Yong Zhu, L1-Hua Xu and ffen-Jun L1.Streptomyces sedi sp.nov., isolated from surface-sterilized roots of Sedumsp..1ntJ Syst Evol Microbiol, 2009, 59, 1492-1496]。
[0017]本發(fā)明的鏈霉菌Sirepo焊ces sp.PRh5是從東鄉(xiāng)野生稻根際分離獲得的。分離培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)中的S養(yǎng)基，每升含有淀粉4.0 g，酪蛋白0.12 g，NaCl 1.6 g，MgS04?7H20 0.04 g, K2HP04 1.6 `g, KN03 1.6 g, Fe2S04.7Η20 8 mg，瓊脂 15-18 g,蒸餾水1000 mL, pH 7.0~7.2，加入抑制劑(制霉菌素50 mg/L +放線菌酮50 mg/L +青霉素50mg/L)。分離培養(yǎng)條件為:28 °C，14天。由此從東鄉(xiāng)野生稻根際部位分離獲得菌株P(guān)Rh5 (鏈霉菌 Strepomyces sp.PRh5)。
[0018]按照參考文獻(xiàn)中的方法或者常規(guī)方法提取該菌株P(guān)Rh5的基因組DNA，應(yīng)用常規(guī)PCR擴(kuò)增該菌株的16SrDNA并測(cè)序，其序列如SEQ ID N0.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列號(hào)JQ009377。對(duì)16SrDNA核苷酸序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示，該菌株與Streptomyces indonesi ensi s DSM 41759T的相似度為98%,說(shuō)明該菌株P(guān)Rh5為鏈霉菌屬(圖2 )，通過(guò)鄰接法清晰地揭示了該菌株與一組假諾卡氏菌屬物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，表明該菌屬于鏈霉菌屬的一種。
[0019]形態(tài)學(xué)特征和生理生化分析:
菌株P(guān)Rh5屬于革蘭氏陽(yáng)性，好氧放線菌，PRh5在酵母膏-麥芽膏瓊脂(ISP2)生長(zhǎng)最快最好，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，淺褐色至黃褐色，氣生菌絲豐富，白色或灰色；在高氏合成一號(hào)、燕麥片瓊脂(ISP3)、無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂(ISP4)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，查氏培養(yǎng)基上次之，甘油-天門(mén)冬酰胺瓊脂(ISP5)生長(zhǎng)最慢。在6種培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生可溶性色素。在高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基上32° C插片培養(yǎng)7~14 d,取插片分別在光學(xué)顯微鏡下觀察，基內(nèi)菌絲多分支，無(wú)橫隔、無(wú)斷裂現(xiàn)象；氣生菌絲發(fā)育良好，后期孢子鏈自行斷裂，分散，掃描電鏡下觀察，PRh5孢子鏈表面褶皺(圖3)，孢子鏈呈螺旋生長(zhǎng)，螺旋一般為兩圈半，孢子呈圓球形。根據(jù)菌落、菌體形態(tài)觀察和生理特征測(cè)定，確定PRh5屬于典型的鏈霉菌屬i^t:reptomyces)的形態(tài)特征。菌株P(guān)Rh5能水解淀粉、液化明膠，能夠使牛奶產(chǎn)生胨化現(xiàn)象但不凝固，硝酸鹽還原為陽(yáng)性，不產(chǎn)黑色素及硫化氫，能利用阿拉伯糖、果糖、鹿糖、葡萄糖、鼠李糖、棉籽糖、甘露醇、肌醇、木糖等碳源，能利用纖維素生長(zhǎng)。菌株P(guān)Rh5細(xì)胞壁氨基酸成分分析發(fā)現(xiàn)含有:LL-DAP及天門(mén)冬氨酸，甘氨酸，谷氨酸，丙氨酸；因此其細(xì)胞壁化學(xué)組分屬于I型；全細(xì)胞水解物中不含有特征糖，糖型為C。符合放線菌中鏈霉菌屬的化學(xué)分類(lèi)特性。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、化學(xué)等分析，菌株P(guān)Rh5與indonesi ensi s DSM 41759TDNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果為54.6%，低于70%這一基因種的區(qū)分界限，遠(yuǎn)低于種內(nèi)差異標(biāo)準(zhǔn)的70 % (Stackebrandt,E.&Ebers,J.Taxonomic parameters re visited:tarnished goldstandards Microbiol Today.(2006).33,152-155.)根據(jù)以上形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、化學(xué)等分析，綜合分析多項(xiàng)分類(lèi)數(shù)據(jù)，鑒定此菌株為鏈霉菌屬^Streptomyces)的一個(gè)新種，并將此菌命名為:鏈霉菌焊cm sp.PRh5，該菌于2013年10月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2013487。
[0020] 二、尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的分離和制備
1、培養(yǎng)基
A、種子培養(yǎng)基:每升含玉米粉15g，玉米淀粉5g，黃豆餅粉5g，酵母膏0.5g，ΚΗ2Ρ040.5g, KN03 0.5g, , NaCl 0.5g，CaC03 3g，補(bǔ)水至 1L，pH8.0。121°C，滅菌 25min ；
B、發(fā)酵培養(yǎng)基:每升含玉米粉44g，玉米淀粉17g，黃豆餅粉5g，酵母膏0.5g，Κ2ΗΡ040.25g, KN03 0.35g, , NaCl 0.5g，CaC03 6g，補(bǔ)水至 1L，pH8.0。。121°C，滅菌 25min。
[0021]2、發(fā)酵
2.1、種子培養(yǎng):將活化的鏈霉菌焊cm sp.PRh5接入種子培養(yǎng)基中，28°C，150rpm,培養(yǎng)96h制得種子液，
2.2、發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以7.5% (體積百分比)的接種量接入到30L (置于500mL的錐形培養(yǎng)瓶，每瓶含有150ml發(fā)酵培養(yǎng)基，)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 °C，150rpm，振蕩培養(yǎng)240h，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物30L。
[0022]3、萃取:發(fā)酵培養(yǎng)物先進(jìn)行離心分離(4800r.mirT1，8min)，得發(fā)酵液30L，發(fā)酵液經(jīng)石油醚、氯仿梯度萃取，石油醚層經(jīng)減壓濃縮后得到浸膏A (2.5g);氯仿層減壓濃縮后得到浸膏B (2.3g)；
4、化合物尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的提取分離
4.1化合物尼日利亞菌素(nigericin)的提取分離:將浸膏A經(jīng)常壓硅膠柱(200-300目)層析，用石油醚/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比70: 30~60: 40進(jìn)行梯度洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯體積比50: 50梯度洗脫下來(lái)的餾分，得化合物1 (476mg)。
[0023]4.2化合物諾卡胺素(Nocardamine)的提前分離:將浸膏B經(jīng)常壓硅膠柱(200—300目)層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0~0:100進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比90:1梯度洗脫下了的餾分A1，餾分A1經(jīng)LH-20凝膠柱層析，用體積比為1: 1的氯仿:甲醇作為流動(dòng)相洗脫，得化合物2 (63mg)。
[0024]通過(guò)結(jié)構(gòu)分析,對(duì)本發(fā)明的從鏈霉菌焊sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備得到的化合物1的鑒定結(jié)果如下:
化合物1:白色晶體(甲醇)，白色粉末，ES1-MS 747[M+Na]+和》Λ 723[Μ_Η]_。1-NMR (CDC13，400ΜΗζ) δ: 4.31 (1H, m, H_9)，4.13(1H, m, H_7)，3.90 (1H, dd, J =3.6，7.6Hz, H-24), 3.60 (3H, s, CH30—40)，1.50 (3H, s, Me-35), 1.08 (3H, s,Me-34), 1.04 (3H, d, J = 6.0 Hz, Me-31), 0.99 (3H, J = 6.8 Hz, Me-37), 0.97(3H, J = 4.0 Hz, Me-39)，0.93 (H, J = 4.0 Hz, Me-33, Me-36)，0.87 (6H, d, J =4.0 Hz, Me-32, Me_38) ;13C_NMR(CDC13，100MHz) δ: 177.0 (C_l)，44.0 (C_2)，73.1 (C_3)27.5 (C-4)，26.3 (C_5)，23.1 (C_6)，69.2 (C_7)，35.3 (C_8)，60.2 (C_9)，32.2 (C-10)，78.6 (C-ll) , 35.5(C-12)，108.0 (C-13)，39.0 (C—14)，41.8 (C-15) , 82.1 (C—16)，82.2 (C-17)，25.9 (C-18)，30.7 (C-19)，83.6 (C-20)，86.1 (C-21)，35.3 (C-22)，32.9 (C-23)，75.1 (C-24)，78.6 (C-25) ,31.8 (C-26)，37.0 (C-27)，37.2 (C-28)，96.9 (C-29)，68.8 (C-30)，16.2 (C-31)，17.4 (C-32)，15.6 (C-33)，22.9 (C-34)，27.5 (C-35)，13.1 (C-36)，12.9 (C-37)，10.9 (C-38), 13.1 (C-39), 58.0 (C-40).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[Berrada R, Dauphin G, DavidL.Epinigericin,a new polyether carboxylic antibiotic.Structural determinationby 2D NMR methods.J Org Chem[J]，1987，52 (12) 2388-91.]報(bào)道一致，確定該結(jié)構(gòu)與已知化合物尼日利亞菌素(nigericin)結(jié)構(gòu)一致。
[0025]化合物2:白色粉末，ES1-MS: ?/ζ623.33[M+Na]+ 和 mlz 599.34 [Μ - Η]'，1H-NMR(DMS0-1/6，400ΜΗζ) δ:2.27 (6H, d , J = 6Hz, H_2, 11，20)，2.59 (6H, s, H_3,12，21 ), 3.46 (6H, t, J = 6.4Hz，H_5, 14，23)，1.49 (6H, s, H_6, 15，24，) 1.20(6H, m, H-7, 16，25)，1.39 (6H, t, J = 6.4Hz, H_8, 17，26)，3.01(6H, d, J =5.6Hz , H-9, 18，27，)，9.60 (3H, s, Ν-0Η)，7.73 (3H, s, NH, ) 13C-NMR(DMS0_ d6,100MHz) δ:171.9 (C_l, 10，19)，30.4(C-2，11，20)，27.9 (C_3, 12，21)，172.5(C-4, 13，22)，47.3 (C_5, 14，23)，26.3 (C_6, 15，24)，23.6 (C_7, 16，25)，29.1 (C~8, 17, 26)，38.7 (C-9, 18, 27) (Jena-Marie Meyer, Mohamed A.Abdallah.The Siderochromes of Non-fluorescent Pseudomonads: Production of Nocardamineby Pseudomonas stutzer1.Microbiology [J] 1980, 1 (8), 125-129.)報(bào)道一致，確定該結(jié)構(gòu)與已知化合物諾卡胺素(Nocardamine)結(jié)構(gòu)一致。
[0026]
序列表SEQ ID NO:1
AATATTGCAC CAATTGGGCG AAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCTT60
CGGGTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCGAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCG120
CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCAGCGTTG TCCGGAATTA180
TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGCTTGT CGCGTCGGAT GTGAAAGCCC GGGGCTTAAC240
CCCGGGTCTG CATTCGATAC GGGCAGGCTA GAGTTCGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG300
TGTAGCGGTG AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG360
CCGATACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG420
TCCACGCCGT AAACGTTGGG AACTAGGTGT GGGCGACATT CCACGTTGTC CGTGCCGCAG480
CTAACGCATT AAGTTCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT540
GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT600
TACCAAGGCT TGACATACAC CGGAAAACCC TGGAGACAGG GTCCCCCTTG TGGTCGGTGT660
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【權(quán)利要求】
1.一種鏈霉菌，其特征在于命名為鏈霉菌PRh5 iStrepomyces sp.PRh5),其保藏號(hào)為:CCTCC NO:M 2013487，在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2013年10月23日，保藏單位名稱(chēng):中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌sp.PRh5,其16S rDNA序列為SEQ IDNO:1。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的鏈霉菌51 trepomyces sp.PRh5制備尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的方法，其特征在于，所述的尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)是從權(quán)利要求1所述的鏈霉菌Strepomyces sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備分離得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用鏈霉菌sp.PRh5制備尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的方法,其特征在于,包括以下步驟:a)制備鏈霉菌sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物，將該發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離開(kāi)，發(fā)酵液經(jīng)石油醚、氯仿梯度萃取，石油醚層經(jīng)減壓濃縮后得到浸膏A ;氯仿層減壓濃縮后得到浸膏B ；b)將浸膏A經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比70: 30~60: 40進(jìn)行梯度洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯體積比50: 50梯度洗脫下來(lái)的餾分，得尼日利亞菌素(nigericin)；c)將浸膏B經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0~0:100進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比90:1梯度洗脫下了的餾分A1，餾分A1經(jīng)LH-20凝膠柱層析，用體積比為1: 1的氯仿-甲醇作為流動(dòng)相洗脫，得化合物諾卡胺素(Nocardamine)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用鏈霉菌sp.PRh5制備尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)的方法,其特征在于,所述的a)步驟的制備鏈霉菌sp.PRh5的發(fā)酵培養(yǎng)物是通過(guò)以下方法制備:將活化的鏈霉菌Strepomyces sp.PRh5接入種子培養(yǎng)基中，28°C, 150rpm,培養(yǎng)96h制得種子液，將種子液以7.5%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，150rpm,振蕩培養(yǎng)240h，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含有:玉米粉15g，玉米淀粉5g，黃豆餅粉 5g,酵母膏 0.5g，KH2P04 0.5g，KN03 0.5g,，NaCl 0.5g，CaC03 3g，補(bǔ)水至 1L，pH8.0，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為每升培養(yǎng)基中含有:玉米粉44g，玉米淀粉17g，黃豆餅粉5g，酵母膏0.5g，K2HP04 0.25g, KN03 0.35g,，NaCl 0.5g, CaC03 6g，補(bǔ)水至 1L, pH8.0。
6.權(quán)利要求1所述的鏈霉菌Strepomycessp.PRh5在制備尼日利亞菌素(nigericin)與諾卡胺素(Nocardamine)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK103642723SQ201310626669
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】朱篤, 鄧映明, 張志斌, 顏日明, 汪涯, 楊慧林 申請(qǐng)人:江西師范大學(xué)