專利名稱：新型抗生素納米生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器的制備，特別涉及一種新型抗生素納米生物傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有常用技術(shù)有放射性免疫測定(RIA)、酶擴(kuò)大免疫測定技術(shù)(EMIT)、熒光極化免疫測定(FPIA)和液相層析質(zhì)譜等。然而，這些方法多需要昂貴的儀器，操作復(fù)雜，時間長，有的還有放射性危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型抗生素納米生物傳感器的制備方法。提供的一種基于多孔硅材料的阻抗生物傳感器，將多孔硅、適配子和阻抗檢測技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建出一個免標(biāo)記、高效、靈敏、快速、價低的新型檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種新型抗生素納米生物傳感器的制備方法，其特征在于使用的實驗材料和儀器p<100>單晶硅片，其電阻率0. 15 0. 2Ω .cm;牛血清白蛋白(BSA)；0. 2mol/L pH = 7. 0 的 PBS 緩沖液；四環(huán)素；雙氧水；氨水；3-氨丙基三乙氧基硅烷；制備實驗方法多孔硅的制備與氧化膜的形成選擇p<100>單晶硅片通過陽極電化學(xué)脈沖腐蝕制備多孔硅，控制脈沖頻率為 20HZ，脈沖幅度為8mv，占空比為0.5，腐蝕時間lh，該腐蝕過程在自制的聚四氟乙烯容器中進(jìn)行，選擇鉬柱電極為陰極，硅片為陽極。腐蝕液體積比為V(48%HF) V(無水乙醇)V(H2O) =1:1:2;剛制備好的多孔硅片用去離子水沖洗，用0.5% (V/V)的雙氧水做電解液進(jìn)行陽極氧化，處理20min，使多孔硅表面形成一層很薄的氧化膜，然后將多孔硅片浸入 V(NH3) V(H2O2) V(H2O) =1:1: 10組成的混合溶液中，70°C，保溫20min，進(jìn)行親水化處理，以改變多孔硅表面的氧化層的疏水性，同時使多孔硅表面更加均勻；處理完畢后用蒸餾水沖洗干凈，在真空干燥箱中200°C干燥處理lh。適配子的固定化用APTES修飾多孔硅表面。將APTES與去離子水按1 10的比例混合，用lmol/
3L的HCl溶液調(diào)整此混合液的pH為7. 0?；旌弦涸?3°C恒溫水浴，把制備好的多空硅片浸入上述溶液中，反應(yīng)池；然后用去離子水沖洗干凈，在真空干燥箱中干燥處理。取10 μ L2. 5 %的戊二醛溶液鋪展于上述APTES修飾過的多孔硅片上，室溫環(huán)境2h，使其充分反應(yīng)；然后用去離子水沖洗，室溫晾干。將5ng/y L的四環(huán)素適配子溶液 10 μ L鋪展于上述修飾過的多孔硅片上，室溫過夜，使其充分反應(yīng)，然后用去離子水沖洗； 用2.0mg/mL BSA溶液封閉多孔硅的空白位點(diǎn)；之后用大量pH 7. 0的PBS溶液沖洗，儲存于真空干燥器中；交流阻抗法測；電化學(xué)檢測采用三電極體系由多孔硅傳感器作為工作電極，鉬柱電極作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極。在電化學(xué)交流阻抗法測量中，頻率掃描的范圍選擇0.01 IOOkHz，在開路電位下從高頻IOOkHz開始掃描，掃描速度5mV/s，在ZAHNER Im6/6ex電化學(xué)工作站上進(jìn)行測量。待測物的檢測待測物溶液即鹽酸四環(huán)素溶液由PBS緩沖液配制而成；由于多孔硅材料的重復(fù)性，將待測物逐級滴加到檢測體系中，使待測物的濃度逐漸提高；在電化學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定Ih之后，每隔15min向體系中滴加1次待測物，使其質(zhì)量濃度逐級達(dá)到2. 079 207. 9nM,分別檢測各個質(zhì)量濃度對應(yīng)的交流阻抗譜。本發(fā)明特點(diǎn)和效果是本新型抗生素納米生物傳感器的制備方法，是制備一種基于多孔硅材料用于快速檢測四環(huán)素的新型電化學(xué)納米生物傳感器，通過電化學(xué)脈沖腐蝕法制得多孔硅基片，將適配子固定其上。適配子能夠特異性識別四環(huán)素分子，并引起阻抗值的變化。利用電化學(xué)交流阻抗法比較了固定適配子前后硅片表面阻抗值的變化，以及在體系中加入不同濃度四環(huán)素后阻抗譜的變化。選擇一個合適的等效電路對測得的阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。獲得了四環(huán)素濃度與阻抗值的變化規(guī)律。傳感器的線性檢測范圍為2. 079-62. 37nM，檢測限為2. 079nM。本基于多孔硅材料的阻抗生物傳感器，將多孔硅、適配子和阻抗檢測技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建出一個免標(biāo)記、高效、靈敏、快速、價低的新型檢測方法。


圖1是通過交流阻抗法的頻率掃描測量的固定適配子的多孔硅基片吸附不同濃度的四環(huán)素的 Nyquist 圖譜，從 a 到 h 分別是 0，2. 079，10. 40，20. 79，41. 58，62. 37，104. 0， 207. 9nM圖2為阻抗擬合值與2. 079 207. 9nM的四環(huán)素濃度的變化關(guān)系圖
具體實施例方式本新型抗生素納米生物傳感器的制備方法建了一種基于多孔硅材料用于快速檢測四環(huán)素的新型電化學(xué)納米生物傳感器，通過電化學(xué)脈沖腐蝕法制得多孔硅基片，將適配子固定其上。適配子能夠特異性識別四環(huán)素分子，并引起阻抗值的變化。利用電化學(xué)交流阻抗法比較了固定適配子前后硅片表面阻抗值的變化，以及在體系中加入不同濃度四環(huán)素后阻抗譜的變化。選擇一個合適的等效電路對測得的阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。獲得了四環(huán)素濃
4度與阻抗值的變化規(guī)律。傳感器的線性檢測范圍為2. 079-62. 37nM，檢測限為2. 079nM。本新型抗生素納米生物傳感器的制備方法1材料與方法1. 1實驗材料和儀器p<100>單晶硅片(電阻率0. 15 0. 2 Ω · cm)購于天津半導(dǎo)體研究所；牛血清白蛋白(BSA)購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；0. 2mol/L pH = 7. 0的PBS緩沖液、自配；四環(huán)素、北京鼎國生物技術(shù)有限公司；雙氧水；氨水；3-氨丙基三乙氧基硅烷，大連奧利凱化工有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1. 2實驗方法1. 2. 1多孔硅的制備與氧化膜的形成本實驗選擇p<100>單晶硅片通過陽極電化學(xué)脈沖腐蝕制備多孔硅，控制脈沖頻率為20HZ，脈沖幅度為8mv，占空比為0.5，腐蝕時間lh，該腐蝕過程在自制的聚四氟乙烯容器中進(jìn)行，選擇鉬柱電極為陰極，硅片為陽極。腐蝕液為V(48%HF) V(無水乙醇)V (H2O) =1:1:2。剛制備好的多孔硅片用去離子水沖洗，用0.5% (V/V)的雙氧水做電解液進(jìn)行陽極氧化，處理20min，使多孔硅表面形成-層很薄的氧化膜，然后將多孔硅片浸入 V(NH3) V(H2O2) V(H2O) =1:1: 10組成的混合溶液中，70°C，保溫20min，進(jìn)行親水化處理，以改變多孔硅表面的氧化層的疏水性，同時使多孔硅表面更加均勻。處理完畢后用蒸餾水沖洗干凈，在真空干燥箱中200°C干燥處理lh。1.2. 2適配子的固定化用APTES修飾多孔硅表面。將APTES與去離子水按1 10的比例混合，用lmol/ L的HCl溶液調(diào)整此混合液的pH為7. 0?；旌弦涸?3°C恒溫水浴，把制備好的多空硅片浸入上述溶液中，反應(yīng)池。然后用去離子水沖洗干凈，在真空干燥箱中干燥處理。取10 μ L 2. 5%的戊二醛溶液鋪展于上述APTES修飾過的多孔硅片上，室溫環(huán)境池，使其充分反應(yīng)。然后用去離子水沖洗，室溫晾干。將5ng/μ L的四環(huán)素適配子溶液 10 μ L鋪展于上述修飾過的多孔硅片上，室溫過夜，使其充分反應(yīng)，然后用去離子水沖洗。用 2. Omg/mL BSA溶液封閉多孔硅的空白位點(diǎn)。之后用大量pH 7. O的PBS溶液沖洗，儲存于真空干燥器中。1. 2. 3交流阻抗法測定電化學(xué)檢測采用三電極體系由多孔硅傳感器作為工作電極，鉬柱電極作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極。在電化學(xué)交流阻抗法測量中，頻率掃描的范圍選擇0.01 IOOkHz，在開路電位下從高頻IOOkHz開始掃描，掃描速度5mV/s，在ZAHNER Im6/6ex電化學(xué)工作站上進(jìn)行測量。1.2. 4待測物的檢測待測物溶液即鹽酸四環(huán)素溶液由PBS緩沖液配制而成。由于多孔硅材料的重復(fù)性，將待測物逐級滴加到檢測體系中，使待測物的濃度逐漸提高。在電化學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定Ih之后，每隔15min向體系中滴加1次待測物，使其質(zhì)量濃度逐級達(dá)到2. 079 207. 9nM,分別檢測各個質(zhì)量濃度對應(yīng)的交流阻抗譜。15min的時間間隔是為了保證四環(huán)素適配子和四環(huán)素之間能充分的反應(yīng)。
2結(jié)果與討論2. 4交流阻抗法檢測四環(huán)素通過交流阻抗法的頻率掃描測量，如圖1所示，可以看出當(dāng)在緩沖體系中加入不同濃度的目標(biāo)分子鹽酸四環(huán)素時，傳感器表面的阻抗值會明顯下降。圖2為阻抗擬合值與2. 079 207. 9nM的四環(huán)素濃度的變化關(guān)系圖。根據(jù)阻抗的擬合值與吸附四環(huán)素的濃度的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸附四環(huán)素濃度為2. 079 62. 37nM的范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，易于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測物的最低檢測限為2. 0797nM。
權(quán)利要求
1. 一種新型抗生素納米生物傳感器的制備方法，其特征在于 使用的實驗材料和儀器p<100>單晶硅片，其電阻率0. 15 0. 2Ω . cm ；牛血清白蛋白(BSA)；0. 2mol/L pH = 7. 0 的 PBS 緩沖液；四環(huán)素；雙氧水；氨水；3-氨丙基三乙氧基硅烷； 制備實驗方法 多孔硅的制備與氧化膜的形成選擇p<100>單晶硅片通過陽極電化學(xué)脈沖腐蝕制備多孔硅，控制脈沖頻率為20HZ，脈沖幅度為8mv，占空比為0. 5，腐蝕時間lh，該腐蝕過程在自制的聚四氟乙烯容器中進(jìn)行，選擇鉬柱電極為陰極，硅片為陽極；腐蝕液體積比為V(48% HF) V(無水乙醇)V(H2O) = 1:1:2;剛制備好的多孔硅片用去離子水沖洗，用0.5% (V/V)的雙氧水做電解液進(jìn)行陽極氧化，處理20min，使多孔硅表面形成一層很薄的氧化膜，然后將多孔硅片浸入 V(NH3) V(H2O2) V(H2O) =1:1: 10組成的混合溶液中，70°C，保溫20min，進(jìn)行親水化處理，以改變多孔硅表面的氧化層的疏水性，同時使多孔硅表面更加均勻；處理完畢后用蒸餾水沖洗干凈，在真空干燥箱中200°C干燥處理Ih ； 適配子的固定化用APTES修飾多孔硅表面；將APTES與去離子水按1 10的比例混合，用lmol/L的 HCl溶液調(diào)整此混合液的pH為7. 0 ；混合液在53°C恒溫水浴，把制備好的多空硅片浸入上述溶液中，反應(yīng)池；然后用去離子水沖洗干凈，在真空干燥箱中干燥處理；取10μ L2. 5%的戊二醛溶液鋪展于上述APTES修飾過的多孔硅片上，室溫環(huán)境2h，使其充分反應(yīng)；然后用去離子水沖洗，室溫晾干；將5ng/ μ L的四環(huán)素適配子溶液10 μ L鋪展于上述修飾過的多孔硅片上，室溫過夜，使其充分反應(yīng)，然后用去離子水沖洗；用2. Omg/mL BSA溶液封閉多孔硅的空白位點(diǎn)；之后用大量pH 7.0的PBS溶液沖洗，儲存于真空干燥器中；交流阻抗法測電化學(xué)檢測采用三電極體系由多孔硅傳感器作為工作電極，鉬柱電極作為對電極， Ag/AgCl作為參比電極在電化學(xué)交流阻抗法測量中，頻率掃描的范圍選擇0.01 100kHz， 在開路電位下從高頻IOOkHz開始掃描，掃描速度5mV/s，在ZAHNER Im6/6ex電化學(xué)工作站上進(jìn)行測量；待測物的檢測待測物溶液即鹽酸四環(huán)素溶液由PBS緩沖液配制而成；由于多孔硅材料的重復(fù)性，將待測物逐級滴加到檢測體系中，使待測物的濃度逐漸提高；在電化學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定Ih之后，每隔15min向體系中滴加1次待測物，使其質(zhì)量濃度逐級達(dá)到2. 079 207. 9nM，分別檢測各個質(zhì)量濃度對應(yīng)的交流阻抗譜。
全文摘要
一種新型抗生素納米生物傳感器的制備方法，制備一種基于多孔硅材料用于快速檢測四環(huán)素的新型電化學(xué)納米生物傳感器，通過電化學(xué)脈沖腐蝕法制得多孔硅基片，將適配子固定其上。適配子能夠特異性識別四環(huán)素分子，并引起阻抗值的變化。利用電化學(xué)交流阻抗法比較了固定適配子前后硅片表面阻抗值的變化，以及在體系中加入不同濃度四環(huán)素后阻抗譜的變化。選擇一個合適的等效電路對測得的阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。獲得了四環(huán)素濃度與阻抗值的變化規(guī)律。傳感器的線性檢測范圍為2.079-62.37nM，檢測限為2.079nM。
文檔編號G01N27/416GK102175742SQ201010601968
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者張娟琨 申請人:天津前方科技有限公司