一株降解afb1的枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株降解AFB1的泰山枯草芽孢桿菌；于2013年9月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC?No?8186,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，將其發(fā)酵液與發(fā)霉飼料于37℃下共同作用72h，發(fā)酵液產(chǎn)生的活性物質(zhì)能降解發(fā)霉飼料中的AFB1，且效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質(zhì)，而且具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合在飼料方面規(guī)模應(yīng)用。
【專利說明】—株降解AFB1的枯草芽孢桿菌
(-)發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及從一株降解AFBl的枯草芽孢桿菌。
(二)發(fā)明背景
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxius, AF)是由黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillums nomius)、特異曲霉(A.nomius)、假溜曲霉(A.pseudotamarii)等幾種真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和畜禽的健康危害很大。1960年6月，在英國(guó)倫敦郊區(qū)的10萬只火雞突然發(fā)病死亡，追究原因是從巴西進(jìn)口的花生柏被一種來自真菌的有毒物質(zhì)污染。剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟出血，腎臟腫脹，因病因不明，被定為火雞χ病。后經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，火雞的死亡原因由飼料中分離出的黃曲霉所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)造成的，將此物質(zhì)命名為黃曲霉毒素，該結(jié)果引起了全世界的關(guān)注。后來經(jīng)過許多學(xué)者的研究證明，黃曲霉毒素不但可以引起中毒，長(zhǎng)期食用被其污染的食品還可引發(fā)癌癥，具有很強(qiáng)的毒性、致癌性、致突變性和致畸性，它可通過食物和飼料直接危害人類和動(dòng)物的健康.[0003]黃曲霉素B1 (AFBl)廣泛存在于飼料原料中如玉米、高粱、花生粉、豆柏、棉籽柏等。到目前為止，黃曲霉毒素仍是對(duì)畜牧業(yè)威脅最大的霉菌毒素之一。各種動(dòng)物對(duì)黃曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999年)報(bào)道，日糧中含0.2mg / kg黃曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低，降低程度與黃曲霉毒素濃度有關(guān)。Prasad (2002年)研究了AFBl對(duì)家禽的影響發(fā)現(xiàn)，單一劑量AFBl的平均半數(shù)致死量(LD50) (mg / kg體重)雞6.5~16.5、鴨0.34，鴨比雞更敏感，尤其是雛鴨。對(duì)于生長(zhǎng)禽日糧中的AFBl的安全值，一般認(rèn)為不應(yīng)超過20ug / kg。研究還發(fā)現(xiàn)，通過食物鏈進(jìn)入人體的黃曲霉毒素具有極強(qiáng)的致癌作用，嚴(yán)重威脅人類健康，因此，解決谷物糧食和動(dòng)物飼料的黃曲霉毒素污染是一個(gè)世界性難題。
[0004]傳統(tǒng)的黃曲霉毒素去毒方法有物理和化學(xué)方法，包括氨化法、堿法、高溫法、氧化法、吸附劑法，這些方法存在 效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失較大以及難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)；因此，黃曲霉毒素污染的控制急切需要一種高效率、特異性強(qiáng)以及對(duì)飼料和環(huán)境沒有污染的技術(shù)。黃曲霉毒素生物降解，是指黃曲霉毒素分子的毒性基團(tuán)被微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或者所分的胞內(nèi)、胞外酶分解破壞，同時(shí)產(chǎn)生無毒的降解產(chǎn)物的過程。毒素生物降解是一種化學(xué)反應(yīng)的過程，不是對(duì)毒素的物理性吸附作用。利用微生物或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行解毒具備以上優(yōu)勢(shì)，代表了生物解毒的新方向，且生物酶催化方法具有專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)備受研究者的關(guān)注。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明從泰山土壤中分離得到一株降解AFBl的泰山枯草芽孢桿菌；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)降解AFBl的效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質(zhì)，適合在食品及飼料方面規(guī)模應(yīng)用。
[0006]一株泰山枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),于2013年9月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101 ;保藏號(hào)CGMCC No8186,其16srDNA如SEQ.N0.1所
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[0007]所述泰山枯草芽孢桿菌形態(tài)如下:
[0008]菌落形狀不規(guī)則，有皺褶，邊緣波紋狀，灰白色，革蘭氏染色陽性，MR-VP試驗(yàn)陽性，淀粉水解陽性。
[0009]挑取泰山枯草芽孢桿菌于50ml BPY液體培養(yǎng)基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸餾水lL，pH=7.0)培養(yǎng)8h后，以6%接種量將此菌液接種于100mlBPY液體培養(yǎng)基中，在37°C、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h制得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，將其與發(fā)霉飼料于37°C下共同作用72h，發(fā)酵液產(chǎn)生的活性物質(zhì)能降解發(fā)霉飼料中的AFB I。
[0010]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0011]本研究從泰山土壤中分離了一株枯草芽孢桿菌，將其發(fā)酵液與發(fā)霉飼料于37°C下共同作用72h，發(fā)酵液產(chǎn)生的活性物質(zhì)能降解發(fā)霉飼料中的AFB1，且效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質(zhì)，而且具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合在飼料方面規(guī)模應(yīng)用。
[0012](五)發(fā)明附圖
[0013]圖1泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液不同組分對(duì)AFBl的降解率。由圖可知，泰山枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素降解的活性物質(zhì)是一種胞外分泌物，主要存在于其發(fā)酵后的上清液中。
[0014]圖2泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵后`的上清液熱處理和蛋白酶K處理后對(duì)AFBl的降解率。由圖可知，泰山枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素的降解活性物質(zhì)是發(fā)酵上清液中的一種酶.[0015]圖3經(jīng)泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理前后霉變飼料中AFBl含量圖。
[0016]由圖可知，經(jīng)泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理后霉變飼料中AFBl含量由63.5ug/kg降為8.2ug/kg，降解率達(dá)到87.1%。說明泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液在實(shí)際生產(chǎn)中能高效率的降解霉變飼料中的AFBI。
(六)【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1.泰山枯草芽孢桿菌的分離
[0018]采集含淀粉豐富的泰山土壤，80°C的水浴處理I小時(shí)，利用稀釋涂布法在含淀粉的平板培養(yǎng)基(牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、可溶性淀粉5.0g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml pH=7.2)上培養(yǎng)1_3天后觀察。然后進(jìn)行初篩與純化，利用顯微鏡進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，確定是否為枯草芽孢桿菌。再?gòu)?fù)篩，測(cè)定其淀粉酶活性，最后確定菌株。
[0019]實(shí)驗(yàn)流程:倒平板_制備梯度稀釋液_涂布_培養(yǎng)_初篩_復(fù)篩_純化_保存
[0020]( I)制備土壤稀釋液
[0021]取泰山天外村花壇附近土樣,去除表層5cm,取5_15cm處。用無菌器具采樣100g,裝入無菌塑料袋中扎好，記錄采樣時(shí)間地點(diǎn)。將土樣與無菌水充分混合，振搖20min,80°C水浴I小時(shí)后取出。無菌吸取Iml 土壤懸液加入盛有9ml無菌水的試管中，充分混勻,制成?ο-1稀釋度的土壤溶液；以此類推，利用上述方法再分別制成10_2、10_3、10_4、10_5不同稀釋度的土壤溶液。
[0022](2)涂布
[0023]無菌吸取10_3、10_4、10_5三個(gè)梯度土壤液各0.2ml滴在所述的含淀粉的平板培養(yǎng)基中央。用無菌涂布器涂布。
[0024](3)培養(yǎng)
[0025]將淀粉培養(yǎng)基平板倒置于30度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天。
[0026](4)初篩
[0027]觀察菌落形態(tài)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，去除非目的菌株；進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察；進(jìn)行淀粉酶、MR-VP生化試驗(yàn)，最終得到9株菌株。
[0028](5)復(fù)篩
[0029]分別挑取初篩出的9株菌株(分別編號(hào)為:泰山001、泰山002、泰山003、泰山004、泰山005、泰山006、泰山007、泰山008和泰山009)的單菌落于50ml BPY液體培養(yǎng)基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸餾水lL，pH=7.0)培養(yǎng)8h后，將此菌液以6%接種量接種于100mlBPY液體培養(yǎng)基中，在37°C、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)2處后，取80(^1發(fā)酵液，加入200 μ I黃曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培養(yǎng)箱中反應(yīng)72h，以上為處理組；以等量的BPY液體培養(yǎng)基加黃曲霉毒素BI為對(duì)照組。采用高效液相色譜HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素含量。
[0030]黃曲霉毒素 含量測(cè)定可分為3個(gè)步驟:萃取、凈化、檢測(cè)。首先使用甲醇:水(V:V=6:4)溶液對(duì)黃曲霉毒素AFBl進(jìn)行萃取，然后使用免疫親和柱對(duì)樣品殘留毒素進(jìn)行凈化提取(方法參照免疫親和柱使用說明書)；最后用HPLC(柱后光化學(xué)衍生)對(duì)凈化提取得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0031]HPLC檢測(cè)條件為流動(dòng)相甲醇:水=47:53 ；流速lml/min ;色譜柱C18250mmX4.6mm,0.5ym ;激發(fā)波長(zhǎng) 365nm，檢測(cè)波長(zhǎng) 440nm ;進(jìn)樣量 20ul。
[0032]AFBl降解率(%)=([(對(duì)照組AFBl含量-處理組AFBl含量)/對(duì)照組AFBl含fi] XlOOo
[0033]結(jié)果發(fā)現(xiàn)四株菌株對(duì)黃曲霉毒素BI (AFBl)具有降解能力，其中一株編號(hào)為泰山006的降解能力最強(qiáng)，達(dá)到90.12%，將其命名為泰山枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；于2013年9月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo 8186。
[0034]實(shí)施例2.泰山枯草芽孢桿菌的鑒定
[0035](I)泰山枯草芽孢桿菌在BPY瓊脂平板(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g、，瓊脂15g和蒸餾水lL，pH=7.0)上，37°C培養(yǎng)48h后，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察其形狀結(jié)構(gòu)。
[0036](2) 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增弓丨物設(shè)計(jì)
[0037]Eubac27F:AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG;
[0038]Eubac1492R:GGA TAC CTT GTT ACG ACT T
[0039](3)PCR 反應(yīng)體系:10XPCR 緩沖液(含 20mmol/L 的 Mg2+) 5 μ 1，20umol/L dNTP4 μ I, 0.10D/ml 引物各 I μ 1，5u/ μ I Taq 酶 I μ I, ddH2033 μ I,總 DNA 模板 50 μ I。
[0040]反應(yīng)條件:94°C變性 5min;94°C 變性 Imin, 48.2°C 退火 lmin, 72°C 延伸 2min, 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物于1%瓊脂凝膠中電泳，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連入PGM2T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α細(xì)胞。選擇轉(zhuǎn)化的陽性克隆提取質(zhì)粒，由上海生物工程公司完成測(cè)序,通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索證明其與枯草芽孢桿菌同源性達(dá)到99.8%，結(jié)合其形態(tài)和生理生化特征指標(biāo)，將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為泰山枯草芽孢桿菌。
[0041]實(shí)施例3.泰山枯草芽孢桿菌降解黃曲霉毒素活性組分的確定[0042]挑取泰山枯草芽孢桿菌于50ml BPY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8h后，以6%接種量將此菌液接種于100mlBPY液體培養(yǎng)基中，在37°C、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h制得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。取5ml發(fā)酵液，4°C離心20min (8000r/min)，分離上清液與菌體，上清液于4°C備用；離心后的菌體用蒸餾水洗滌，再離心，取菌體加入5ml蒸餾水制得菌懸液備用；再取5ml發(fā)酵液，4°C離心20min(8000r/min)，分離上清液與菌體，取菌體加入5ml蒸餾水，進(jìn)行細(xì)胞超聲波破碎后冷凍離心，將離心后的上清液用0.22 μ m大小孔徑的過濾膜抽濾，制得胞內(nèi)液備用。分別取800 μ I枯草芽孢桿菌上清液、菌懸液、胞內(nèi)液，各加入200 μ I黃曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培養(yǎng)箱中反應(yīng)72h ；以等量的BPY液體培養(yǎng)基加黃曲霉毒素BI為對(duì)照組用HPLC及柱后光化學(xué)衍生的方法對(duì)AFBl的降解率進(jìn)行測(cè)定。
[0043]測(cè)定結(jié)果如圖1:上清液降解AFBl能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到81.2%，菌懸液的降解能力次之，降解率為16.10%，胞內(nèi)液的降解能力最差，降解率為2.31%，基本無降解能力。因此泰山枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素降解的活性物質(zhì)是一種胞外分泌物，主要存在于其發(fā)酵后的上清液中。
[0044]實(shí)施例4.泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活性組分性質(zhì)的研究
[0045]分別取實(shí)施例3中制備的泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液各10ml，分別進(jìn)行熱處理(100°C加熱30min)和蛋白酶K (0.01g/ml蛋白酶K與發(fā)酵上清液反應(yīng)2h，以未處理的發(fā)酵上清液作對(duì)照，用高效液相色譜HPLC及柱后光化學(xué)衍生的方法對(duì)AFBl的降解率進(jìn)行測(cè)定。
[0046]結(jié)果如圖2所示:發(fā)酵上清液經(jīng)過高溫、蛋白酶K處理后，對(duì)黃曲霉毒素BI的降解能力明顯降低，分別為20%和35% ;而對(duì)照組未處理的發(fā)酵上清液對(duì)AFBl的降解率為74% ；因此可初步判斷泰山枯草芽孢桿菌降解AFBl起作用的主要是胞外提取液中的一種生物活性酶，對(duì)AFBl的降解過程實(shí)質(zhì)上應(yīng)是降解酶的酶促反應(yīng)。
[0047]實(shí)施例5.泰山枯草芽孢桿菌的應(yīng)用
[0048]1.急性毒性試驗(yàn)
[0049]每次每只小鼠最大給藥量0.2mL/g, Id經(jīng)口灌胃給藥3次，經(jīng)觀察灌服泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的小鼠，24h后無死亡現(xiàn)象，也未出現(xiàn)任何明顯的中毒現(xiàn)象。3d后處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎，均無特殊改變?？梢娞┥娇莶菅挎邨U菌對(duì)小鼠并無明顯的急性毒副作用.[0050]2.泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)發(fā)霉飼料的作用
[0051]取泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液5mL和20g發(fā)霉飼料混勻在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，每隔半天充分混勻一次。分別檢測(cè)發(fā)霉飼料處理前和經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理3d后AFBl的含量。結(jié)果表明，經(jīng)泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理后霉變飼料中AFBl含量由63.5ug/kg降為8.2ug/kg,遠(yuǎn)低于黃曲霉毒素的國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，降解率達(dá)到87.1%。因此泰山枯草芽孢桿菌發(fā)酵液在實(shí)際 生產(chǎn)中能高效率降解霉變飼料中的AFBl。見圖3。
【權(quán)利要求】
1.一株保藏號(hào)為CGMCC N0.8186的泰山枯草芽孢桿菌，已于2013年9月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；其16srDNA如SEQ.N0.1所示。
2.如權(quán)利 要求1所述的泰山枯草芽孢桿菌降解黃曲霉素B1的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103820353SQ201310553820
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】柴同杰, 孫玲玉 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)