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桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白多克隆抗體的制備方法

文檔序號:517415閱讀:292來源:國知局
桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白多克隆抗體的制備。通過設計引物克隆lef-9基因;原核表達構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,構(gòu)建表達LEF-9蛋白的重組菌株;對LEF-9蛋白進行誘導表達及純化,以制備的桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白為抗原,采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清,純化抗血清,得到多克隆抗體。通過本發(fā)明的方法,實現(xiàn)了原核表達桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白,可以用于后期制備其多克隆抗體,為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解,為進一步利用其構(gòu)建高效的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)奠定了基礎。
【專利說明】桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗體的制備方法,特別涉及桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002]桿狀病毒是昆蟲的特異性病原體,是已知昆蟲病毒中最大的類群,也是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多且具有非常重要實用價值的昆蟲病毒,桿狀病毒作為高效的真核基因表達載體系統(tǒng)、有效的病毒殺蟲劑和潛在的基因治療載體系統(tǒng)受到學術界的廣泛關注。
[0003]桿狀病毒基因組編碼多種基因,根據(jù)基因表達的時序性,桿狀病毒的基因分為早期基因和晚期基因兩大類。因為目前大多數(shù)證據(jù)表明,病毒基因的時序表達是通過時序之前的一組病毒基因的表達產(chǎn)物,直接或間接地反式激活其時序之后的一組病毒基因的轉(zhuǎn)錄,因而調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。因此作為轉(zhuǎn)錄病毒晚期基因的病毒RNA聚合酶就成為調(diào)節(jié)病毒早晚期基因轉(zhuǎn)錄表達的關鍵因素。
[0004]桿狀病毒RNA聚合酶由病毒誘導及編碼,當病毒基因組開始復制后,早期基因停止轉(zhuǎn)錄,病毒RNA聚合酶特異性識別含有保守序列TAAG的晚期基因啟動子并開始晚期基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明病毒RNA聚合酶僅由病毒編碼的4個保守基因lef-4、lef_8、lef-9和P47組成,這四種蛋白構(gòu)成的復合體可以在體外轉(zhuǎn)錄病毒晚期基因。雖然早在上世紀80年代科學家便發(fā)現(xiàn)了該酶的存在,但迄今為止我們對它的了解還非常有限?,F(xiàn)已知在其四個基本組成成分中P47定位在細胞核內(nèi),是晚期基因轉(zhuǎn)錄的必需基因,LEF-4起mRNA加帽及錨定啟動子的作用,LEF-8與聚合酶特異性識別晚期啟動子有關,且推測與LEF-9共同構(gòu)成了 RNA聚合酶的催化位點。
[0005]LEF-9是病毒RNA聚合酶中第二大蛋白,如果能夠解析HearNPV LEF-9亞基在病毒RNA聚合酶中的功能,將使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解,為進一步利用其構(gòu)建聞效的真核基因表達載體系統(tǒng)、制備有效的病毒殺蟲劑和開發(fā)基因治療載體系統(tǒng)奠定基礎。為了研究該蛋白,制備其多克隆抗體是一個必須的前期基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種制備桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的方法,以便對LEF-9蛋白的功能特性進行研究,使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解,為進一步利用其構(gòu)建高效的體外轉(zhuǎn)`錄系統(tǒng)奠定基礎。
[0007]本發(fā)明采用的技術方案是:桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備,步驟如下:
I)lef-9 基因的克隆:設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3,和 28a55R:5,-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因組 DNA 為模版擴增lef-9完整閱讀框,PCR反應條件為:94°C預變性5min ;94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s為一個循環(huán),進行30個循環(huán);最后68°C延伸7min,得到lef-9基因PCR產(chǎn)物;2)原核表達載體的構(gòu)建:用凝膠回收試劑盒回收基因PCR產(chǎn)物,用"i/7dIII和Bamm雙酶切,同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a,將酶切片段和載體通過T4DNA連接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9 ;
3)重組表達菌株的構(gòu)建:將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,構(gòu)建表達LEF-9蛋白的重組菌株;
4)LEF-9蛋白的誘導表達及純化:將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mLKana抗性LB培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)過夜,取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltlnm為0.6后,加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養(yǎng)5h,離心收集菌體;
5)LEF-9蛋白的純化:將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中,_70°C反復凍融3次,超聲波破碎,條件為功率200-300 W,超聲3s停5s,總計20min,至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15 min,重復3次,去除不溶性細胞碎片,獲得含有LEF-9蛋白的上清液,將該上清液通過Ni2+親和柱,再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫下來的蛋白并測A280,當有蛋白峰時開始收集樣品,直至A280又恢復至基準線,得到純化的LEF-9蛋白;
6)多克隆抗體制備:以步驟5)得到的LEF-9蛋白為免疫原,按質(zhì)量比1:1與弗氏完全佐劑混合均勻,按照常規(guī)多克隆抗體的制備方法,共免疫4次`家兔,收集血清,分離,純化后,得到桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體。
[0008]上述獲得的桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體可以用于LEF-9蛋白的檢測。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:通過本發(fā)明的方法,制備了 LEF-9蛋白的多克隆抗體,為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9的構(gòu)建圖。
[0011]圖2A是lef-9基因擴增結(jié)果的SDS-PAGE電泳圖。
[0012]其中,M:分子標準;1 'lef-9基因擴增片段。
[0013]圖2B 是 pET-28a-lef_9 鑒定的 SDS-PAGE 電泳圖。
[0014]其中,M:分子標準;1:pET-28a-lef-9酶切結(jié)果。
[0015]圖3是純化LEF-9蛋白檢測圖。圖中,M:分子標準;I:純化的LEF-9蛋白。
[0016]圖4是LEF-9蛋白的western blot檢測圖。其中,M:marker ;1:病毒LEF-9蛋白。
【具體實施方式】
[0017]實施例1 桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備 具體操作方法如下:
1.lef-9基因的克隆
設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3,(下劃線表示位點)和 28a55R: 5,-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3,(下劃線表不/ZifldIII 位點),以HearNPV基因組DNA為模版擴增lef-9完整閱讀框,PCR反應條件為:94°C預變性5min ;94°C 30s, 59°C 30s, 68°C 30s為一個循環(huán),進行30個循環(huán);最后68°C延伸7min,得lef-9基因PCR產(chǎn)物。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示獲得1578bp片段(圖2A)。
[0018]2.原核表達表達載體的構(gòu)建
用凝膠回收試劑盒回收純化lef-9基因PCR產(chǎn)物,用#i/7dIII和雙酶切,同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a,將酶切片段和載體通過T4 DNA連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-lef_9 (圖1 ),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α,卡那霉素抗性篩選陽性菌株,提取質(zhì)粒,酶切鑒定陽性克隆子(圖2Β),經(jīng)上海生工測序,基因序列結(jié)果為序列表SEQ ID N0.1所示,測序鑒定克隆子無突變。
[0019]3.重組表達菌株的構(gòu)建
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,構(gòu)建表達LEF-9蛋白的重組菌株。
[0020]4.LEF-9蛋白的誘導表達
將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(Kana 50ug/mL)中,37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基(Kana 50ug/mL)中,37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltlnm為0.6后,加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養(yǎng)5h,離心收集菌體。
[0021]5.LEF-9蛋白的純化:
將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中,_70°C反復凍融3次,超聲波破碎,條件為功率200-300 W,超聲3s`停5s,總計20min,至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15min,重復3次,去除不溶性細胞碎片,獲得含有LEF-9蛋白的上清液,將該上清液通過Ni2+親和柱,再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫下來的蛋白并測A280,當有蛋白峰時開始收集樣品,直至A280又恢復至基準線。收集的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測。得到純化的LEF-9蛋白。
[0022]6.桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備
以步驟5中得到的純化的LEF-9蛋白為免疫原,對家兔進行免疫:將400mg的LEF-9蛋白按質(zhì)量比1:1與弗氏完全佐劑混合均勻,在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射并在后大腿進行肌肉注射,每個區(qū)域大約用1/4的免疫原。兩周后采用背部多點注射法,即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射免疫原,共計400mg LEF-9蛋白;再間隔2周和4周后分別于上述部位選不同點注射進行三次免疫和四次免疫;最后一次注射2周后取血,收集血清,分離,純化后,得到桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體。
[0023]7.桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的檢測
用桿狀病毒HearNPV G4株感染sf_9細胞,72小時后收集感染細胞,用制備的桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體通過western blot檢測該樣品,結(jié)果如圖4所示,結(jié)果證明制備的桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體可以檢測到病毒的LEF-9蛋白。
【權利要求】
1.桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體的制備,其特征在于步驟如下: 1)lef-9 基因的克隆:設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3,和 28a55R:5,-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因組 DNA 為模版擴增lef-9完整閱讀框,PCR反應條件為:94°C預變性5min ;94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s為一個循環(huán),進行30個循環(huán);最后68°C延伸7min,得到lef-9基因PCR產(chǎn)物; 2)原核表達載體的構(gòu)建:用凝膠回收試劑盒回收基因PCR產(chǎn)物,用"i/7dIII和Bamm雙酶切,同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a,將酶切片段和載體通過T4DNA連接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9 ; 3)重組表達菌株的構(gòu)建:將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-lef-9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,構(gòu)建表達LEF-9蛋白的重組菌株; 4)LEF-9蛋白的誘導表達:將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mL Kana抗性LB培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)過夜,取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltol為0.6后,加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養(yǎng)5h,離心收集菌體; 5)LEF-9蛋白的純化:將步驟4)中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中,_70°C反復凍融3次,超聲波破碎,條件為功率200-300 W,超聲3s停5s,總計20min,至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15 min,重復3次,去除不溶性細胞碎片,獲得含有LEF-9蛋白的上清液,將該上清液通過Ni2+親和柱,再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫下來的蛋白并測A280,當有蛋白峰時開始收集樣品,直至A280又恢復至基準線,得到純化的LEF-9蛋白; 6)多克隆抗體制備:以步驟5)得到的LEF-9蛋白為免疫原,按質(zhì)量比1:1與弗氏完全佐劑混合均勻,按照常規(guī)多克隆抗體的制備方法,共免疫4次家兔,收集血清,分離,純化后,得到桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗體。
【文檔編號】C12N15/70GK103497249SQ201310401615
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權日:2013年9月5日
【發(fā)明者】朱春玉, 鄭方亮, 于亮 申請人:遼寧大學
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