水稻育性調(diào)控構(gòu)建體及其轉(zhuǎn)化事件和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及含有制種技術(shù)事件和位于轉(zhuǎn)基因序列側(cè)翼的植物基因組DNA的轉(zhuǎn)基因水稻植物。更具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建水稻雄性不育系、保持系的方法以及轉(zhuǎn)化事件，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種轉(zhuǎn)化事件，一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D，一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D，一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的引物，一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的試劑盒，具體地，利用該試劑盒鑒定插入的T-DNA和植物基因組DNA的結(jié)合區(qū)域并進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化事件的種子及其它組織的方法，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。
【專利說明】水稻育性調(diào)控構(gòu)建體及其轉(zhuǎn)化事件和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及含有制種技術(shù)事件和位于轉(zhuǎn)基因序列側(cè)翼的植物基因組DNA的轉(zhuǎn)基因水稻植物。更具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建水稻雄性不育系、保持系的方法以及轉(zhuǎn)化事件，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種轉(zhuǎn)化事件，一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D，一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D，一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的引物，一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的試劑盒，具體地，利用該試劑盒鑒定插入的T-DNA和植物基因組DNA的結(jié)合區(qū)域并進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化事件的種子及其它組織的方法，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻雜交育種中常用的是“三系”和“兩系”雜交?！叭怠彪s交需要有特定的恢復(fù)系和保持系，育種程序和生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜，選育新不育系及新組合的周期長、效率低，種質(zhì)資源的利用率低于5%。另外，三系雜交稻雜種優(yōu)勢較弱，不育細(xì)胞質(zhì)較單一，存在某種毀滅性病蟲害暴發(fā)的潛在危險(xiǎn)?！皟上怠彪s交水稻由于不受恢復(fù)系、保持系之間關(guān)系的制約，親本的遺傳多樣性得到明顯改善，選育出高產(chǎn)雜交稻組合的速度明顯加快，促進(jìn)了超級(jí)雜交稻的研究和生產(chǎn)。但目前“兩系”雜交中采用的不育系多為“光溫敏”不育系，其育性受環(huán)境中的溫度和光照影響。這些環(huán)境因素的不穩(wěn)定會(huì)直接影響雜交種子的純度和數(shù)量，加大制種風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使企業(yè)和農(nóng)民造成重大經(jīng)濟(jì)損失，限制“兩系”雜交稻的大面積推廣。而且利用目前技術(shù)所能選用的兩系雜交稻不育系十分有限，例如粳稻品種中幾乎沒有很好的兩系雜交組合，限制了品種資源的充分利用。因而，培育不受環(huán)境影響且可自主繁殖的穩(wěn)定不育系已成為限制“兩系”雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。
[0003]因而，目前的水稻雜交技術(shù)仍有待改進(jìn)。
[0004]外源基因在植物中的表達(dá)是受其在植物基因組中的插入位點(diǎn)影響的，這有可能是由于插入位點(diǎn)周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(如異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu))或附近的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(如增強(qiáng)子)的調(diào)節(jié)引起的(Weising et al., Foreign genes in plants:transfer, structure,express1n, and applicat1ns.(1988)Ann.Rev.Genet22:421-477)，例如，可以觀察到在外源基因轉(zhuǎn)化得到的插入位點(diǎn)不同的眾多株系之間，外源基因的表達(dá)水平存在較大的差別，也可以觀察到外源基因在不同轉(zhuǎn)化株系中存在時(shí)空的表達(dá)差異，且這種差異不是人為選用的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建的表達(dá)框造成的。同時(shí)，外源基因在植物基因組的不同位置的整合會(huì)對(duì)植物的整體表型造成影響，比如，外源基因在植物基因組中的插入會(huì)使插入位點(diǎn)處的植物內(nèi)源基因的表達(dá)收到影響。因此，在轉(zhuǎn)化事件的創(chuàng)制過程中，有必要生產(chǎn)成千上萬的獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系，通過篩選大量的轉(zhuǎn)化株系，鑒定得到符合產(chǎn)業(yè)化要求的一個(gè)最優(yōu)化事件，具備合乎要求的外源基因整合位點(diǎn)和表達(dá)水平/模式，同時(shí)對(duì)植物的其它表型不造成影響。進(jìn)一步，可以通過回交轉(zhuǎn)育的常規(guī)育種方法，將該最優(yōu)化事件的外源基因通過雜交轉(zhuǎn)育到其他遺傳背景的品種中去，而這些雜種的子代被賦予了最初轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特性，同時(shí)，還保持了原有品種的各種優(yōu)良性狀。
[0005]在植物或種子或其子代或有性雜交的子代中，特異性檢測特定轉(zhuǎn)化事件的存在或不存在是非常重要的，事件特異性檢測方法可以鑒定插入的外源DNA和受體基因組之間獨(dú)特的接合(junct1n)，這不僅涉及轉(zhuǎn)基因自身，還涉及其在宿主植物或種子的基因組中的插入整合位置。此外，用于檢測特定事件的方法對(duì)于植物食品的上市前許可和標(biāo)簽的規(guī)定、或環(huán)境監(jiān)測及監(jiān)測田地中作物的性狀等也是非常有幫助的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有能夠有效構(gòu)建新型穩(wěn)定的隱性水稻雄性不育系和充分利用水稻種質(zhì)資源用于雜交育種、提高雜交種純度的手段。
[0007]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人以純合隱性核雄性不育水稻突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至該不育水稻突變體受體植株中。所述3個(gè)目標(biāo)基因分別是水稻育性恢復(fù)基因、花粉失活基因和顏色標(biāo)記篩選基因。其中，育性恢復(fù)基因可使不育的轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有轉(zhuǎn)化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以以水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至該不育系:其中，育性恢復(fù)基因0sCYP704B2(對(duì)應(yīng)野生型的水稻MS26基因)可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)；花粉失活基因Zm-AAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；熒光色選基因DsRed(r)用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過程中面臨的瓶頸問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題。
[0008]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼花粉失活基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和花粉失活基因引入到純合隱性核雄性不育水稻突變體植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株作為保持系，從而可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交的母本。由此，可以有效地用于水稻雜交，得到的雜交種也為非轉(zhuǎn)基因。
[0009]由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。
[0010]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，因此能夠進(jìn)行自體受精，可以得到攜帶外源基因的種子和不攜帶外源基因的種子，兩者各占50%。其中，不攜帶外源基因的種子可以作為水稻雄性不育系。從而，可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0011]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。
[0012]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻植株中；以及將所述水稻植株自體受精，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)化事件。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述轉(zhuǎn)化事件是通過將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中獲得的，其中，所述構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼花粉失活基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和花粉失活基因引入到純合隱性核雄性不育水稻突變體植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株作為保持系，從而可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交的母本。由此，可以有效地用于水稻雜交。由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。
[0013]在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D的基因組中包含選自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一種DNA序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,本發(fā)明提出了一種植物,其中,所述植物包含水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D。即在該植物的基因組中包含了選自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一種DNA序列或其互補(bǔ)序列。并且本發(fā)明提出了由該植物衍生得到的種子、細(xì)胞和組織。
[0014]在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D的基因組中包含選自SEQ ID NO:15、16、19、20和54的至少一種DNA序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,本發(fā)明提出了一種植物,其中,所述植物包含水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D。即在該植物的基因組中包含了選自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一種DNA序列或其互補(bǔ)序列。并且本發(fā)明提出了由該植物衍生得到的種子、細(xì)胞和組織。
[0015]在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的引物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D的引物，其特征在于，所述引物包含選自SEQ ID NO:13、14、17、18、53或其互補(bǔ)序列的至少一種。用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D的引物，其特征在于，所述引物包含選自SEQID N0:15、16、19、20、54或其互補(bǔ)序列的至少一種。
[0016]在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括前面所述的引物。
[0017]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0019]圖1為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體p7R的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，自右邊界，依次包含了 PG47啟動(dòng)子:=ZM-BTl導(dǎo)肽::ZM_AA1基因::IN2_1終止子表達(dá)框，0sCYP704B2基因表達(dá)框，和END2啟動(dòng)子::DsRed(r)基因::PINII終止子表達(dá)框。
[0020]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的可育花粉粒和敗育花粉粒(不可育)的I2-1K染色結(jié)果，其中7R-949D表示7R-949D的染色結(jié)果；7R-142?表示7R-1425D的染色結(jié)果。
[0021]圖3是轉(zhuǎn)化事件7R-949D中的T-DNA插入位點(diǎn)及整合方式示意圖。在該轉(zhuǎn)化事件的基因組中，整合了 2個(gè)T-DNA，分別為圖示的T-DNAl和T-DNA2。
[0022]圖4是轉(zhuǎn)化事件7R-949D中T-DNA插入序列與鄰近基因位置關(guān)系及驗(yàn)證引物示意圖，其中SP3為根據(jù)T-DNA序列設(shè)計(jì)的引物，A949B-L-1和A949B-R為根據(jù)插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列設(shè)計(jì)的引物，其中引物A949B-L-1和SP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的片段大小為981bp，其具體的核苷酸序列如SEQ ID N0:74所示；引物A949B-R和SP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的片段大小為540bp，其具體的核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示。
[0023]圖5是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D中的T-DNA插入位點(diǎn)及插入方式示意圖。在該轉(zhuǎn)化事件的基因組中，整合了 I個(gè)T-DNA，其右邊界為RB，左邊界為LB。
[0024]圖6是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D中T-DNA插入序列與鄰近基因位置關(guān)系及驗(yàn)證引物示意圖。其中7RB-3和SP3為根據(jù)T-DNA序列設(shè)計(jì)的引物，A1425RB-2和A1425LB-2為根據(jù)插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列設(shè)計(jì)的引物，其中引物A1425RB-2和SP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的片段大小為864bp，其具體的核苷酸序列如SEQ ID NO: 76所示；A1425LB_2和SP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的片段大小為954bp，其具體的核苷酸序列如SEQ ID N0:77所示。
[0025]圖7是轉(zhuǎn)化事件7R-949D中T-DNA上探針位置及酶切位點(diǎn)示意圖，7A顯示了目的基因上探針序列位置及Hind III酶切位點(diǎn)；7B顯示了色選基因上探針序列位置及EcoR I酶切位點(diǎn)。
[0026]圖8是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D以0sCYP704B2為探針的預(yù)期雜交片段大小及Hind III酶切位點(diǎn)示意圖。
[0027]圖9是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D以Zm-AAl和DsRed(r)為探針預(yù)期雜交片段大小及EcoR I酶切位點(diǎn)示意圖。
[0028]圖10是轉(zhuǎn)化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以目的基因?yàn)樘结樀腟outhernblot結(jié)果，其中電泳泳道1、7和13:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、8和14:陽性對(duì)照(質(zhì)粒DNA) +武運(yùn)粳7號(hào)DNA - BamHI ;3、9和15:陰性對(duì)照(武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26突變體DNA-BamHI) ;4、5和6:7R-949D - Hind II1-T2 代 3 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;10、11 和 12:7R-949D - Hind II1-T3代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株；16、17和18:7R-949D - Hind II1-T4代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株。
[0029]圖11是轉(zhuǎn)化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以色選基因?yàn)樘结樀腟outhernblot結(jié)果，其中電泳泳道1、7和13:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、8和14:陽性對(duì)照(質(zhì)粒DNA) +武運(yùn)粳7號(hào)DNA - BamHI ;3、9和15:陰性對(duì)照(武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26突變體DNA-BamHI) ;4、5和6:7R-949D - EcoR 1-T2 代 3 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;10、11 和 12:7R-949D - EcoR 1-T3 代 3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株；16、17和18:7R-949D-EcoR I_T4代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株。
[0030]圖12是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D Τ2、Τ3和Τ4代植株以0sCYP704B2基因?yàn)樘结樀腟outhern blot結(jié)果，其中電泳泳道1、7和13:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、8和14:陽性對(duì)照(質(zhì)粒DNA)+武運(yùn)粳7號(hào)DNA - BamHI ;3、9和15:陰性對(duì)照(武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26突變體DNA - BamHI )；
4、5 和 6:7R-1425D - Hind II1-T2 代 3 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;10、11 和 12:7R-1425D - HindII1-T3代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;16、17和18:7R-1425D - Hind II1-T4代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株。
[0031]圖13是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D T2、T3和Τ4代植株以Zm-AAl基因?yàn)樘结樀腟outhernblot結(jié)果，其中電泳泳道1、7和13:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、8和 14:陽性對(duì)照(質(zhì)粒DNA) +武運(yùn)粳7號(hào)DNA - BamHI ;3、9和15:陰性對(duì)照(武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26突變體DNA - BamHI) ;4、5和6:7R-1425D -EcoR I_T2 代 3 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;10、11 和 12:7R-1425D - EcoR 1-T3 代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株；16、17和18:7R-1425D-EcoR 1-T4代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株。
[0032]圖14是轉(zhuǎn)化事件7R-1425D T2、T3和T4代植株以DsRed (r)基因?yàn)樘结樀腟outhern blot結(jié)果，其中電泳泳道1、7和13:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、8和14:陽性對(duì)照(質(zhì)粒DNA)+武運(yùn)粳7號(hào)DNA - BamHI ;3、9和15:陰性對(duì)照(武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26突變體DNA - BamHI )；
4、5 和 6:7R-1425D -EcoR 1-T2 代 3 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株;10、11 和 12:7R-1425D - EcoR1-T3代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株；16、17和18:7R-1425D - EcoR 1-T4代3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株。
[0033]圖15是RT-PCR鑒定T2代轉(zhuǎn)化事件7R-949D3個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)模式圖，其中根為苗期根；莖為苗期莖；葉為苗期葉；P3期為穎花原基分化期幼穗；P6期為花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期幼穗；P8期為花粉成熟期幼穗；種子為籽粒成熟期的種子；突變體為武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26 ;野生型為武運(yùn)粳7號(hào)；空白對(duì)照為以水為擴(kuò)增模板；陽性對(duì)照為以轉(zhuǎn)化體基因組DNA為擴(kuò)增模板。
[0034]圖16是RT-PCR鑒定T2代轉(zhuǎn)化事件7R-1425D3個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)模式圖，其中根為苗期根；莖為苗期莖；葉為苗期葉；P3期為穎花原基分化期幼穗；P6期為花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期幼穗；P8期為花粉成熟期幼穗；種子為籽粒成熟期的種子；突變體為武運(yùn)粳7號(hào)ms26/ms26 ;野生型為武運(yùn)粳7號(hào)；空白對(duì)照為以水為擴(kuò)增模板；陽性對(duì)照為以轉(zhuǎn)化體基因組DNA為擴(kuò)增模板。
[0035]圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過轉(zhuǎn)基因所得到的轉(zhuǎn)化體通過自交得到不育系的示意圖，其中受體(ms/ms)指純合隱性核雄性不育轉(zhuǎn)基因受體材料；保持系含有純合隱性核雄性不育位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因雜合位點(diǎn)，因此為可育；不育系含有純合隱性核雄性不育位點(diǎn)且不含轉(zhuǎn)基因，因此為雄性不育；保持系產(chǎn)生的花粉一半含有轉(zhuǎn)基因，一半不含有轉(zhuǎn)基因；保持系結(jié)實(shí)產(chǎn)生50%的不育系種子和50%的保持系種子。
[0036]發(fā)明詳細(xì)描述
[0037]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0038]本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文。
[0039]除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。
[0040]術(shù)語“事件”指包括異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和該轉(zhuǎn)化體包括但不限于通過自交或雜交或無性繁殖產(chǎn)生的子代。通過用異源DNA，即，包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由轉(zhuǎn)基因插入到特定植物基因組中產(chǎn)生的植物群體的再生，和選擇以對(duì)特定基因組位置的插入為特征的特定的植物，來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因“事件”。因而，術(shù)語“事件”還指通過在轉(zhuǎn)化體和另一個(gè)包括異源轉(zhuǎn)基因DNA和側(cè)翼基因組DNA的品種之間進(jìn)行有性的異型雜交生產(chǎn)的子代。術(shù)語“事件”還指來自原始轉(zhuǎn)化體的、包含插入的DNA和緊密鄰近于插入的DNA的側(cè)翼基因組序列的DNA，期待著將其轉(zhuǎn)移到子代中，該子代作為包括插入的DNA的一個(gè)親本系(例如，原始轉(zhuǎn)化體和自交或無性繁殖的子代)與不含有該插入的DNA的親本系進(jìn)行有性雜交的結(jié)果 ，接受了包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的插入DNA。
[0041]術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
[0042]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人以水稻核隱性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育突變體中，其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以以水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系:育性恢復(fù)基因0sCYP704B2可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因Zm-AAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，熒光色選基因DsRed(r)用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過程中面臨的瓶頸問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題。
[0043]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼花粉失活基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和花粉失活基因引入到水稻植株例如水稻純合隱性雄性不育植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株作為保持系，從而可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系。另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交之中的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0044]在本文中，構(gòu)建體的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體(有時(shí)也稱為表達(dá)載體、遺傳載體或載體)呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用Ti載體，例如可以采用將第一和第二表達(dá)盒設(shè)置在表達(dá)載體P7R的T-DNA之左右邊界之間。由此，可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將第一和第二表達(dá)盒轉(zhuǎn)化至受體植株，例如水稻ms26隱性核雄性不育突變體中。由此，可以獲得不含除草劑抗性標(biāo)記基因和抗生素抗性標(biāo)記基因的水稻轉(zhuǎn)化株系。如此獲得的轉(zhuǎn)化株系有如下特點(diǎn):(I)轉(zhuǎn)化位點(diǎn)在各世代始終處于雜合狀態(tài)，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因僅通過雌配子傳遞至下一代，不會(huì)通過花粉漂移到環(huán)境中；(2)轉(zhuǎn)化體自交可結(jié)實(shí)，所結(jié)可育種子(帶熒光標(biāo)記)與不育種子(不帶熒光標(biāo)記)的比例為1:1，可育株(帶有外源基因)用作保持系，可以通過自交方便地、源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，不育株(不含轉(zhuǎn)基因成分)在生產(chǎn)上用作雜交制種的親本；(3)因?yàn)椴挥瓴缓D(zhuǎn)基因，因此用其生產(chǎn)的雜交種子不含轉(zhuǎn)基因，用此雜交種生產(chǎn)的水稻商品糧食更不含轉(zhuǎn)基因，從而消除了轉(zhuǎn)基因生物安全的隱患。該新型雜交育種體系為充分利用水稻雜種優(yōu)勢提供了切實(shí)可行的技術(shù)新突破。
[0045]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的載體，優(yōu)選核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對(duì)于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，水稻雄性不育恢復(fù)基因的類型并不受特別限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。即，可以采用的水稻雄性不育恢復(fù)基因?yàn)?sCYP704B2，由此，可以將其作為水稻受體ms26純合突變體(完全雄性不育)的野生型育性恢復(fù)基因。0sCYP704B2基因編碼的蛋白屬于細(xì)胞色素P-450家族，在花藥發(fā)育的P8到PlO階段的絨粘層和小孢子中特異表達(dá)。該基因突變后會(huì)導(dǎo)致絨粘層膨脹，花粉外壁殘缺而發(fā)育終止及花藥角質(zhì)層終止發(fā)育，從而導(dǎo)致植株雄性不育，而雌性育性正常。進(jìn)一步的化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，在該基因缺失突變體的花藥中，幾乎檢測不到角質(zhì)單體，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)該基因的功能是催化產(chǎn)生含有16和18個(gè)碳鏈的羥基脂肪酸。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。與野生型的0sCYP704B2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)相比，SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列引入了三個(gè)單核苷酸突變，但不改變其編碼的氨基酸序列，這三個(gè)單核苷酸突變?cè)?sCYP704B2基因編碼區(qū)上的位置及具體突變分別為:238位核苷酸A突變?yōu)镃 ；240位的核苷酸G突變?yōu)镃 ；243位的核苷酸G突變?yōu)镃。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列能夠便于在各種分子鑒定中區(qū)別外源基因與內(nèi)源基因，并且能夠更有效地使水稻mS26/mS26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。水稻受體ms26純合突變體是經(jīng)過輻射誘導(dǎo)所得，突變是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)導(dǎo)致(缺失區(qū)段物理位置:ensembl plants oryza japonica groupvers1n64.6 (MSU6) chromosome3:3, 701, 319-3，704, 421)。大片段缺失突變使回復(fù)突變的概率極低，因此不育性狀穩(wěn)定，從而保障了不育系的穩(wěn)定性，降低雜交制種風(fēng)險(xiǎn)。
[0048]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括:第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述第一核酸分子可操作地相連，所述第一啟動(dòng)子為雄配子特異性啟動(dòng)子；以及第一終止子，所述第一終止子與所述第一核酸分子可操作地相連。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一啟動(dòng)子和第一終止子的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于0sCYP704B2基因，可以采用0sCYP704B2的內(nèi)源啟動(dòng)子、ORF區(qū)及終止區(qū)的序列，均為野生水稻基因組序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一終止子具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該啟動(dòng)子和終止子的組合，能夠進(jìn)一步顯著地提高表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率，進(jìn)而能夠提高利用構(gòu)建體構(gòu)建不育系的效率，并且能夠更有效地使水稻ms26/ms26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，花粉失活基因的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述花粉失活基因編碼具有如SEQ ID NO:21所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。由此，可以編碼Zm-AAl所編碼的α-淀粉酶。α _淀粉酶屬于糖基水解酶。該基因是從授粉10天后的玉米胚和胚乳的cDNA文庫中分離得到，其功能是催化水解多糖分子(例如淀粉)的(1-4)-a -D-葡萄糖苷。玉米內(nèi)源的Zm-AAl基因主要在萌發(fā)的種子的盾片組織中表達(dá)，玉米花粉中檢測不到該基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述花粉失活基因具有如SEQ IDNO:9所不的核昔酸序列。由此，可以進(jìn)一步提聞表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述第二核酸分子可操作地相連，所述第二啟動(dòng)子為花粉特異性啟動(dòng)子；以及第二終止子，所述第二終止子與所述第二核酸分子可操作地相連。由此，可以更有效的提高相應(yīng)基因的表達(dá)效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在第二表達(dá)盒中還可以進(jìn)一步包括編碼導(dǎo)肽的序列，由此，第二表達(dá)盒可以有效地編碼具有導(dǎo)肽的花粉失活蛋白，由此，可以使得目的基因(花粉失活基因)能夠被靶向定位到特定的細(xì)胞器中。例如，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，編碼導(dǎo)肽的序列具有如SEQ ID Ν0:36所示的核苷酸序列(來自于玉米的brittle-Ι基因的編碼導(dǎo)肽(TP)的序列)。由此，可以有效地將所表達(dá)的蛋白靶向淀粉體，分解花粉中的淀粉，從而使花粉失去活力，喪失授精能力，造成轉(zhuǎn)基因花粉失活。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該基因在玉米花粉特異性啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)下，與來自于玉米的brittle-Ι基因的編碼導(dǎo)肽(TP)的序列及終止子IN2-1組成表達(dá)框，可在發(fā)育后期的成熟花粉中特異性表達(dá)淀粉酶，并靶向淀粉體，分解花粉中的淀粉，從而使花粉失去活力，喪失授精能力，造成轉(zhuǎn)基因花粉失活。該設(shè)計(jì)使得所有含有此基因的轉(zhuǎn)基因花粉失活，不能授精還能嚴(yán)格防止基因漂移等生物安全問題，失活的花粉不能與周圍其它植株或雜草授粉，因而轉(zhuǎn)基因不能通過花粉漂移到環(huán)境中。
[0050]另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括:第三表達(dá)盒，所述第三表達(dá)盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子編碼篩選基因，所述篩選基因?yàn)榘l(fā)光基因。由此，便于通過篩選基因的表達(dá)來確定植物及其部分是否含有構(gòu)建體所引入的基因。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因的至少一種作為篩選基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以采用紅色熒光蛋白作為篩選基因。紅色突光蛋白基因(DsRed),來源于礁珊瑚(Discosoma sp.),是表達(dá)框內(nèi)唯一非糧食作物來源的基因序列。紅色熒光蛋白最大吸收波長為558nm，最大發(fā)射波長為583nm。將DsRed編碼的氨基酸序列通過與過敏原及毒蛋白序列比對(duì)顯示，相似性極低，無毒性及致敏性。DsRed常用作遺傳轉(zhuǎn)化的篩選基因，從未發(fā)生過轉(zhuǎn)基因生物安全事題。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述篩選基因具有如SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。由此，可以更加有效地表達(dá)紅色熒光蛋白，增強(qiáng)DsRed基因在水稻中的表達(dá)。SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列與野生型DsRed基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示)相比，具有兩個(gè)單核苷酸突變，命名為DsRed(r)。這兩個(gè)單核苷酸突變分別為:由第21位堿基C轉(zhuǎn)換為G、由第315位堿基G轉(zhuǎn)換為C。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以更加有效地表達(dá)紅色熒光蛋白，增強(qiáng)紅色熒光蛋白基因在水稻中的表達(dá)。
[0052]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第三啟動(dòng)子，所述第三啟動(dòng)子與所述第三核酸分子可操作地相連，所述第三啟動(dòng)子為愈傷組織或種子特異性的啟動(dòng)子；第三終止子，所述第三終止子與所述第三核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三終止子具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，DsRed(r)的開放讀碼框連接于來自玉米且為愈傷組織和種子(胚和胚乳)特異性啟動(dòng)子END2和來自馬鈴薯的終止子Pin II之間，重組成DsRed(r)基因表達(dá)盒(END2::DsRed(r):: PINlD0含有該表達(dá)框的水稻種子在熒光激發(fā)下呈現(xiàn)非常容易辨認(rèn)的紅色，因此該表達(dá)框在本發(fā)明中用于辨認(rèn)和分選保持系和不育系種子。
[0053]由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的構(gòu)建體，以非轉(zhuǎn)基因隱性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作為轉(zhuǎn)化的受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到整合含有以下緊密連鎖的三個(gè)外源基因DsRed(r)，Ms26，Zm_AAl的水稻保持系，Ms26即0sCYP704B2育性基因。外源基因的插入與內(nèi)源雄性不育位點(diǎn)(mS26/mS26)是非連鎖的，因此得到的轉(zhuǎn)基因水稻保持系含有獨(dú)立的純合的ms26隱性不育位點(diǎn)及雜合的外源基因(包括0sCYP704B2基因)整合位點(diǎn)。
[0054]由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻細(xì)胞、組織或器官來自水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，本發(fā)明的水稻細(xì)胞、組織或器官，可以有效地用于構(gòu)建雄性不育株。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該水稻細(xì)胞、組織或器官，不再贅述。
[0055]由此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖17，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源基因處于雜合狀態(tài)，因此第二水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。進(jìn)而培育所得到的第二水稻植株，通過第二水稻植株即轉(zhuǎn)化體的自交受精，可以得到不攜帶外源基因的種子，從而構(gòu)建水稻雄性不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過熒光檢測進(jìn)行分揀的步驟，即通過檢測水稻種子是否攜帶發(fā)光基因，例如是否發(fā)出熒光來進(jìn)行分揀，區(qū)分其是否攜帶外源基因。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0056]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0057]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻植株中；以及將所述水稻植株自體受精，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻植株為水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。
[0058]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)化事件。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述轉(zhuǎn)化事件是通過將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)化事件為選自7R-949D和7R-1425D的至少一種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法引入所述構(gòu)建體。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將緊密連鎖的0sCYP704B2、ZM-AAl及DsRed (r)基因轉(zhuǎn)化到水稻中，獲得了遺傳穩(wěn)定的7R-949D和7R-142?轉(zhuǎn)基因水稻株系。采用TAIL-PCR技術(shù)，對(duì)Tl代植株T-DNA插入位置的旁側(cè)序列進(jìn)行了擴(kuò)增，獲得旁側(cè)序列；將獲得的旁側(cè)序列進(jìn)行測序分析，并與數(shù)據(jù)庫(MSU Rice GenomeAnnotat1n Project Release7,發(fā)布時(shí)間 2011 年 10 月 31 日，ftp://ftp.plantb1logy.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotat1n_dbs/pseudomolecules/vers1n_7.0/)中水稻基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)7R-949D和7R-1425D的T-DNA插入位點(diǎn)分別定位在第3號(hào)染色體短臂近著絲粒處(物理位置為Chr3:14，746，015-14，746，027)和第I號(hào)染色體長臂遠(yuǎn)端(物理位置為Chrl:42，215，016-42，215，095)，兩者均未插入水稻內(nèi)源基因內(nèi)部；而后，對(duì)接合區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證外源T-DNA插入位置并初步推測T-DNA整合方式，即以旁側(cè)序列及T-DNA側(cè)序之間為靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期相符，進(jìn)一步證實(shí)了 T-DNA插入位點(diǎn)的正確性，并且顯示7R-949D為反向串聯(lián)的雙拷貝整合，而7R-1425D內(nèi)T-DNA為單拷貝插入。
[0060]由此，在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D的基因組中包含選自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一種DNA序列。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,本發(fā)明提出了一種植物,其中,所述植物包含水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D。即在該植物的基因組中包含了選自SEQ ID NO:13、14、17、18和53的至少一種DNA序列或其互補(bǔ)序列。并且本發(fā)明提出了由該植物衍生得到的種子、細(xì)胞和組織。在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D的基因組中包含選自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一種DNA序列。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,本發(fā)明提出了一種植物,其中,所述植物包含水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D。即在該植物的基因組中包含了選自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一種DNA序列或其互補(bǔ)序列。并且本發(fā)明提出了由該植物衍生得到的種子、細(xì)胞和組織。
[0061]另外，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因檢測方法及其組合物，用于檢測來自水稻事件7R-949D的植株或種子，或來自該轉(zhuǎn)基因植株的部分或種子的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA連接區(qū)的檢測。轉(zhuǎn)化事件7R-949D，其完整外源插入序列為如SEQ ID NO:53所示，其T-DNA區(qū)與插入位點(diǎn)的5’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列(又稱嵌合DNA分子)如SEQ ID NO:17所示，其中第1-10位的核苷酸序列為水稻內(nèi)源基因組DNA，第11-20位的核苷酸序列為外源插入的T-DNA序列；與3’端側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:18所示，其中第1_10位的核苷酸序列為外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列為水稻內(nèi)源基因組DNA。在本發(fā)明中，上述連接序列還可以在SEQ ID NO: 17和18的基礎(chǔ)上，包括更長的基因組DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具體的，所述外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的5’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:13所示 ，其中SEQID NO: 13的第884-903位核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的3’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:14所示，其中SEQ ID NO: 14的第497-516位核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示。所有這些序列以及包含這些序列的植物和種子構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。由此，本發(fā)明提供了一種新的DNA序列，該序列來自轉(zhuǎn)化事件7R-949D的DNA轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域的SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 14或其互補(bǔ)DNA分子。在其基因組中包含SEQID NO:13, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 14或其互補(bǔ)DNA分子的水稻植株和種子均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0062]本發(fā)明還提供了一組PCR引物用于轉(zhuǎn)化事件7R-949D的DNA檢測，其中，該一組PCR引物包含第一 PCR引物和第二 PCR引物，其中第一 PCR引物包含SEQ ID N0:13的T-DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，第二 PCR引物來自SEQ ID NO:13的5’側(cè)翼水稻基因組DNA區(qū)域的任何部分的的類似長度的連續(xù)多核苷酸，這些核酸分子作為引物分子在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的?；蚴堑谝?PCR引物包含SEQ ID N0:14的T-DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，第二 PCR引物來自SEQ ID NO:14的3’側(cè)翼水稻基因組DNA區(qū)域的任何部分的的類似長度的連續(xù)多核苷酸，該一組PCR引物在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的。或是第一 PCR引物和第二 PCR引物均來自SEQ ID N0:53,包含序列SEQ ID NO:53的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，該一組PCR引物在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的。通過使用上述引物進(jìn)行PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以用于檢測出水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D。所述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中包含部分或全部的SEQ ID N0:13、14、
17、18或53所示的DNA序列。
[0063]本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因檢測方法及其組合物，用于檢測來自水稻事件7R-1425D的植株或種子，或來自該轉(zhuǎn)基因植株的部分或種子的產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)基因/基因組連接區(qū)的檢測。轉(zhuǎn)化事件7R-1425D，其完整外源插入序列如SEQ IDNO:54所示，其外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的5’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:19所示，其中第1_10位的核苷酸序列為水稻內(nèi)源基因組DNA，第11-20位的核苷酸序列為外源插入的T-DNA序列；外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的3’端側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:20所示，其中第1-10位的核苷酸序列為外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列為水稻內(nèi)源基因組DNA。在本發(fā)明中，上述連接序列還可以在SEQ ID NO: 19和20的基礎(chǔ)上，包括更長的基因組DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具體的，所述外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的5’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列可以如SEQ IDNO:15所示，其中SEQ ID NO: 15的第817-836位核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示；所述外源插入T-DNA序列與插入位點(diǎn)的3’側(cè)翼序列構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO:16所示，其中SEQ ID NO: 16的第398-417位核苷酸序列如SEQ IDN0:20所示。所有這些序列以及包含這些序列的植物和種子構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。由此，本發(fā)明提供了一種新的DNA序列，該序列來自轉(zhuǎn)化事件7R-1425D的DNA轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域的SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 54或其互補(bǔ)DNA分子。在其基因組中包含SEQ ID N0:15或SEQ ID NO: 16或其互補(bǔ)DNA分子的水稻植株和種子均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0064]本發(fā)明還提供了一組PCR引物用于轉(zhuǎn)化事件7R-142?的DNA檢測，該組PCR引物包括第三PCR引物和第四PCR引物。其中第三PCR引物包含SEQ IDNO: 15的T-DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，第四PCR引物來自SEQ ID NO:15的5’側(cè)翼水稻基因組DNA區(qū)域的任何部分的的類似長度的連續(xù)多核苷酸，這些核酸分子作為引物分子在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的?；蚴堑谌齈CR引物包含SEQ ID NO:16的T-DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，第四PCR引物來自SEQ ID NO:16的3’側(cè)翼水稻基因組DNA區(qū)域的任何部分的的類似長度的連續(xù)多核苷酸，該組PCR引物作為引物分子在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的?；蚴堑谌齈CR引物和第四PCR引物均來自SEQ IDN0:54，包含序列SEQ ID NO:54的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸，該組PCR引物在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是有效的。通過使用上述引物進(jìn)行PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件7R-1425D。所述擴(kuò)增產(chǎn)物中包含部分或全部的SEQ ID N0:15、16、19、20或54所示的DNA序列。
[0065]在本文中所使用的術(shù)語“引物”是分離的多核酸，其通過核酸雜交與互補(bǔ)的目標(biāo)多核酸鏈退火形成引物和目標(biāo)多核酸鏈的雜交體，然后通過聚合酶，例如DNA聚合酶沿目標(biāo)多核酸鏈延伸。本發(fā)明的引物對(duì)涉及它們用于擴(kuò)增目標(biāo)多核酸分子的擴(kuò)增的用途，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。
[0066]本發(fā)明的引物可以在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)DNA序列雜交。可使用任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法可以用于鑒定樣品中來自7R-949D事件或7R-1425D的DNA的存在。核酸分子或其片段能夠在某些情況下與其他核酸分子特異性雜交。如此處使用的，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)并且有足夠長度以在高嚴(yán)格條件下維持這種結(jié)構(gòu)，則稱為兩個(gè)核酸分子能相互特異性地雜交。如果核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如此處使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，稱為分子顯示出“完全的互補(bǔ)性”。如果分子的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低嚴(yán)格”條件下保持相互的退火，稱兩個(gè)分子是“最低度互補(bǔ)的”。類似地，如果分子的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高嚴(yán)格”條件下保持相互的退火，稱所述分子是“互補(bǔ)的”。Sambrook et al., 1989, and by Haymes etal.(1985)描述了常規(guī)的嚴(yán)格條件。因而從完全互補(bǔ)性的偏離是可允許的，只要這種偏離不完全地排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子作為引物或探針，僅需在序列中充分的互補(bǔ)，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0067]如此處使用的，基本上同源的序列是在高度嚴(yán)格條件下與其相比較的核酸序列的互補(bǔ)物特異性雜交的核酸序列。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)約45°C，之后是在50°C用2.0XSSC洗滌，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格的約2.0 X SSC、50 V到高度嚴(yán)格的約0.2 X SSC、500C。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低度嚴(yán)格條件的室溫下約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度和鹽度可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸將在中度嚴(yán)格條件下，例如在約2.0XSSC和約65°C下特異性地雜交需要擴(kuò)增的核酸分子。
[0068]關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增(例如，通過PCR)，“嚴(yán)格條件”是允許引物對(duì)僅與目標(biāo)核酸序列雜交的條件，具有相應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)物)的引物將與所述目標(biāo)核酸序列結(jié)合，優(yōu)選的在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增子。
[0069]術(shù)語“特異于(目標(biāo)序列)”是指引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含目標(biāo)序列的樣品中的目標(biāo)序列雜交。
[0070]如在此使用的，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”是指作為核酸模板的部分的目標(biāo)核酸序列的核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物。 例如，為了確定產(chǎn)自有性雜交的植物是否含有轉(zhuǎn)基因事件7R-949D，或采集自田間的樣品是否包含7R-949D，或植物提取物是否包含7R-949D。從植物組織樣品或提取物中提取的DNA可以使用包括引物對(duì)的核酸PCR擴(kuò)增方法，所述引物對(duì)包括來源于鄰近插入的異源轉(zhuǎn)基因DNA的插入位點(diǎn)的基因組區(qū)域的引物，和來源于插入的異源轉(zhuǎn)基因DNA的第二引物，來產(chǎn)生對(duì)于事件DNA的存在是診斷性的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子具有一定長度并具有序列，所述序列對(duì)所述事件也是診斷性的。擴(kuò)增子的長度可根據(jù)引物對(duì)加上一個(gè)核苷酸堿基對(duì)、或加上約五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，或加上約兩百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，或加上約三百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)或更多的組合長度而變化。
[0071]做為選擇，引物對(duì)可以來源于插入的T-DNA兩側(cè)的側(cè)翼基因組序列，以獲得包括整個(gè)T-DNA插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。來自植物基因組序列的引物對(duì)的成員可以選自距插入的轉(zhuǎn)基因T-DNA分子一定距離內(nèi)，該距離可以從一個(gè)核苷酸堿基對(duì)到約兩萬個(gè)核苷酸堿基對(duì)間變化。術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用要特別排除可在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚物。
[0072]可以通過本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法的任一種，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。各種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的，這些方法以及本領(lǐng)域的其他DNA擴(kuò)增方法可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中?？梢蕴峁┒喾N技術(shù)來檢測這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子。一個(gè)這種方法是 Genetic Bit Ananlysis (Nikiforov, et al.，1994),其中設(shè)ii DNA 寡核苷酸，其覆蓋鄰近的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA轉(zhuǎn)基因序列。將寡聚核苷酸固定在微孔平板的孔中。在對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR之后(使用T-DNA插入序列中的一個(gè)引物，和鄰近側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引物)，單鏈PCR產(chǎn)物可與固定的寡聚核苷酸雜交并充當(dāng)模板，用于利用DNA聚合酶和特異于期待的下一個(gè)堿基的標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。讀出過程可以是基于熒光的或基于ELISA的信號(hào)。信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸導(dǎo)致的插入物/側(cè)翼基因組序列的存在。
[0073]另一種方法是Winge (2000)描述的Pyrosequencing技術(shù)。在這個(gè)方法中設(shè)計(jì)一寡核苷酸，其覆蓋鄰近的基因組DNA和插入物DNA接點(diǎn)。使寡核苷酸與來自目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一個(gè)引物在插入的序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)雜交，在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷酸5’磷酸和螢光素的情況下孵育。分別地添加DNTPs，測量產(chǎn)生光信號(hào)的摻入。光信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基或多堿基延伸導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。
[0074]Chen等(1999)描述的熒光偏振是可以用于檢測本發(fā)明的擴(kuò)增子的一種方法。使用這種方法設(shè)計(jì)一寡核苷酸，其覆蓋基因組側(cè)翼和插入的DNA接點(diǎn)。使寡核苷酸與來自目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一個(gè)引物在插入的DNA序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組DNA序列中)雜交，在存在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的情況下孵育。單堿基延伸導(dǎo)致ddNTP的摻入。利用熒光計(jì)測量偏振的變化可以測量摻入。偏振的變化指示了由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼基因組序列的存在。
[0075]Taqman? (PE Applied B1systems, Foster City, CA)被描述為一種對(duì)DNA序列的存在進(jìn)行檢測和定量的方法，可以根據(jù)廠家提供的說明完全理解。簡要地，設(shè)計(jì)一寡核苷酸探針，其覆蓋基因組側(cè)翼和插入的DNA接點(diǎn)。在存在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的情況下，F(xiàn)RET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入的DNA序列中以及一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)進(jìn)行循環(huán)。FRET探針的雜交引起FRET探針上熒光部分從淬滅部分裂解和釋放。熒光信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增和雜交產(chǎn)生的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入物序列的存在。
[0076]在如Tyangi et al.(1996)中描述的,Molecular Beacons已經(jīng)被用于序列檢測中。簡要地，設(shè)計(jì)一 FRET寡核苷酸探針，其覆蓋側(cè)翼基因組和插入物DNA接點(diǎn)。該FRET探針的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)造成其含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)使熒光和淬滅部分保持鄰近。在存在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的情況下，F(xiàn)RET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入的DNA序列中以及一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)進(jìn)行循環(huán)。在成功的PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針對(duì)目標(biāo)序列的雜交引起探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的消除和熒光部分與淬滅部分的空間分隔，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)指示了由于成功的擴(kuò)增和雜交產(chǎn)生的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入物序列的存在。
[0077]其他描述的方法，例如microfluidics提供了分離和擴(kuò)增DNA樣品的方法和設(shè)備。光染料用于檢測和測定特定的DNA分子。包含用于檢測DNA分子的電子傳感器或結(jié)合特定DNA分子的納珠并因而可被檢測的納試管(nanotube)設(shè)備(W0/06024023)對(duì)于檢測本發(fā)明的DNA分子也是有用的。
[0078]由此，在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的引物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該引物包括選自SEQ ID N0:13、14、15、16及其互補(bǔ)序列的至少一種。由此，可以通過PCR反應(yīng)有效地對(duì)水稻轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行檢測，尤其是可以有效地檢測水稻轉(zhuǎn)化事件7R-949D和7R-142?的至少一種。在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測水稻轉(zhuǎn)化事件的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括前面所述的引物。
[0079]在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備雜交水稻的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法采用水稻雄性不育系，該水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。由此，可以進(jìn)一步利用本發(fā)明的水稻雄性不育系進(jìn)行水稻雜交，提高水稻雜交的效率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0080]在本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提出了水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。由此，可以進(jìn)一步利用本發(fā)明的水稻雄性不育系進(jìn)行水稻雜交，提高水稻雜交的效率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該用途，不再贅述。
[0081]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括采用水稻純合隱性雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因；將母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，利用本發(fā)明的方法，可以在MS26純合隱性雄性水稻不育系的基礎(chǔ)上，發(fā)展更多的不同遺傳背景的不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用常規(guī)回交育種方法，所有不同類型的水稻都可以創(chuàng)制成相應(yīng)的智能不育系(即可以源源不斷地生產(chǎn)相應(yīng)的不育系品種)，使雜種優(yōu)勢資源利用達(dá)到95%以上。
[0082]本發(fā)明還提出了一種含有特定外源DNA序列的轉(zhuǎn)基因水稻的組合物和方法，所述特定外源DNA序列通過水稻轉(zhuǎn)化的方法引入受體植株中，并獲得在本文中被稱為“事件7R-949D”或“7R-949D”或“949D”或“事件949D”的事件。轉(zhuǎn)化的植株或種子也可以稱為“水稻7R-949D”或“水稻949D”等。本發(fā)明還提供了用于鑒定由事件7R-949D所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。
[0083]本發(fā)明提出了含有特定外源DNA序列的轉(zhuǎn)基因水稻的組合物和方法，所述特定的外源DNA序列通過水稻轉(zhuǎn)化的方法引入受體植株中，并獲得在本文中被稱為“事件7R-949D”或“7R-1425D”或“142?”或“事件1425D”的事件。轉(zhuǎn)化的植株或種子也可以稱為“水稻7R-1425D”或“水稻1425D”等。本發(fā)明還提供了用于鑒定由事件7R-142?所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。
[0084]本發(fā)明的實(shí)施例中還提出了一種特異的側(cè)翼序列，所述“側(cè)翼序列”又稱為“旁側(cè)序列”，在本發(fā)明中，所述側(cè)翼序列可用于開發(fā)生物樣品中的事件7R-949D和7R-142?的特異性鑒定方法。在一些實(shí)施方案中，還公開了 7R-949D和7R-1425D的左邊界和右邊界的側(cè)翼區(qū)域序列，這些側(cè)翼序列可用于設(shè)計(jì)特定的引物和探針。本發(fā)明還提供了基于上述特異性引物和探針，對(duì)生物樣品中是否包含7R-949D和7R-142?進(jìn)行鑒定的方法。
[0085]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案記載，本發(fā)明還提供了檢測樣品中與事件7R-949D和7R-1425D對(duì)應(yīng)的DNA是否存在的方法。具體地，所述方法包括:Ca)將包含DNA的樣品與DNA引物接觸，所述DNA引物與從包含事件7R-949D或7R-1425D的植株中提取出的基因組DNA進(jìn)行核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可以產(chǎn)生用于鑒定事件7R-949D或7R-1425D的特定擴(kuò)增子；
(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增子；(c)檢測鑒定所述擴(kuò)增子。
[0086]含有事件7R-949D和7R-1425D中特定的外源插入序列與插入位點(diǎn)處的基因組旁側(cè)序列所構(gòu)成的連接序列的DNA分子，及與所述DNA分子同源或互補(bǔ)的序列，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0087]本發(fā)明實(shí)施方案中還提出了一種包含事件7R-949D中特定的側(cè)翼序列或連接序列，具體如SEQ ID NO: 13、14、17或18所示的DNA分子，和包含事件7R-1425D中特定的側(cè)翼序列或連接序列，具體如SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的DNA分子。本發(fā)明實(shí)施方案中包括DNA序列，所述DNA序列由一條轉(zhuǎn)基因插入序列和一條來自插入位點(diǎn)處的側(cè)翼水稻基因組DNA組成，所述DNA序列可用于設(shè)計(jì)引物，所述引物可擴(kuò)增出用于檢測植物或植物材料中是否含有事件7R-949D或7R-1425D的擴(kuò)增子產(chǎn)物。
[0088]本發(fā)明的實(shí)施方案中進(jìn)一步提出了一種含有事件7R-949D的外源插入T-DNA區(qū)(其核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示)的至少11個(gè)或更多個(gè)核苷酸的DNA序列，和含有事件7R-1425D的外源插入T-DNA區(qū)(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 54所示)的至少11個(gè)或更多個(gè)核苷酸的DNA序列，或上述DNA序列的互補(bǔ)序列，以及與7R-949D的SEQ ID NO: 13,
14、17或18所示的側(cè)翼水稻基因組DNA序列具有相似長度的DNA序列或其互補(bǔ)序列，或是與7R-1425D的SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的側(cè)翼水稻基因組DNA序列具有相似長度的DNA序列或其互補(bǔ)序列。上述DNA序列可作為DNA擴(kuò)增中的引物序列。由上述引物所產(chǎn)生的擴(kuò)增子可分別用于檢測事件7R-949D或7R-1425D。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也包括由DNA引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子，所述DNA引物與7R-949D或7R-1425D的轉(zhuǎn)基因T-DNA區(qū)或其特定的側(cè)翼序列同源或互補(bǔ)。
[0089]本發(fā)明的實(shí)施方案中還提出了一種檢測樣品中對(duì)應(yīng)于事件7R-949D或7R-1425D的DNA分子的方法，所述方法包括:(a)將從植物中提取出的DNA樣品與DNA探針接觸，所述探針包含在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與從事件7R-949D或7R-1425D中提取的DNA雜交但在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與對(duì)照植株DNA雜交的分子；(b)使樣品和探針處于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件；(c)檢測探針與DNA的雜交情況。更具體的，本發(fā)明實(shí)施方案中還提供了檢測樣品中對(duì)應(yīng)于7R-949D或7R-142?的特定DNA分子的方法，所述方法包括(a)將探針與樣品接觸，所述樣品為從水稻植株中提取出的DNA，所述DNA探針分子選自事件中特定的序列如連接序列的部分序列，所述DNA探針分子在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下可以與事件7R-949D或7R-142?的DNA雜交，并且在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不能與對(duì)照水稻植株的DNA雜交；(b)使樣品和探針處于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下； (c)檢測探針和DNA的雜交情況。
[0090]本發(fā)明實(shí)施方案進(jìn)一步提供了一種生物樣品中事件7R-949D或7R-1425D的DNA的檢測試劑盒。所述試劑盒包含可用于PCR鑒定程序的第一引物和第二引物，所述第一引物可以特異性識(shí)別事件7R-949D或7R-142?的左邊界或右邊界側(cè)翼序列，所述第二引物可以特異性識(shí)別事件7R-949D或7R-1425D中的外源插入DNA序列。本發(fā)明實(shí)施方案還提出了另一種檢測生物樣品中事件7R-949D或7R-142?的試劑盒，所述試劑盒包含一條特異性探針，所述特異性探針具有對(duì)應(yīng)于以下序列或與以下序列互補(bǔ)的序列:與事件7R-949D或7R-1425D的特異性區(qū)域具有80%-100%的相似性的序列。對(duì)應(yīng)于特異性區(qū)域的探針序列包含事件7R-949D或7R-1425D的部分5’或3’側(cè)翼部分序列。
[0091]本發(fā)明實(shí)施方案還提出了一種為了其他目的而使用本發(fā)明已述及的實(shí)施方案中的方法和試劑盒，所述其他目的包括但不限于以下:鑒定植物、植物材料或產(chǎn)品中的事件7R-949D或7R-1425D，所述產(chǎn)品包括但不限于含有或源自植物的食品或飼料產(chǎn)品(新鮮的或加工過的)；為了區(qū)分出轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料中的轉(zhuǎn)基因材料；以及為了確定包含水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物材料的質(zhì)量。所述試劑盒還可以含有為了實(shí)施檢測方法所必需的其他試劑和材料。
[0092]另一方面，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)含有事件7R-949D或7R-142?的子代植株的方法。所述子代植株可以是自交或雜交植株。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提出了一種用于事件7R-949D或7R-1425D的標(biāo)記輔助育種的方法。另一方面，本發(fā)明還提出了一種包含事件7R-949D或7R-1425D的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植株。
[0093]創(chuàng)制種子生產(chǎn)技術(shù)事件7R-949D和7R-1425D的多核苷酸序列連在同樣的DNA載體上，所述多核苷酸序列插入到水稻基因組的特定位置后獲得事件7R-949D和7R-1425D。在已述染色體位置上攜帶7R-949D事件的植物含有如SEQ ID NO: 13、14、17或18所示的基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列構(gòu)成的連接序列，在已述染色體位置上攜帶7R-142?事件的植物含有如SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列構(gòu)成的連接序列。具有事件7R-949D或7R-142?的基因組插入位點(diǎn)的特性是可以增強(qiáng)育種效率，并且使利用分子標(biāo)記在育種群體及其子代中追蹤轉(zhuǎn)基因插入序列成為可能。本發(fā)明還提供了用于水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物、植物部分、種子和谷類產(chǎn)品的鑒定、檢測和使用的多種方法和組合物。
[0094]在一些實(shí)施方案中，創(chuàng)制水稻7R-949D或7R-142?事件的多核苷酸序列還可以通過基因工程的方法進(jìn)行分子聚集(molecular stack)。在其他實(shí)施方案中,所述分子聚集體還可以進(jìn)一步包含至少一條其他的轉(zhuǎn)基因多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以賦予制種技術(shù)其他的特性或賦予轉(zhuǎn)化植株其他植物性狀。
[0095]在某些實(shí)施方案中，可以將目的多核苷酸序列進(jìn)行任意組合創(chuàng)建分子聚集體，并轉(zhuǎn)化植物以創(chuàng)制出具有所需性狀組合的植株，以實(shí)現(xiàn)植物性狀的聚集。本發(fā)明中所述的“性狀”，是指特定DNA序列或DNA序列群組表達(dá)后所呈現(xiàn)出的表型。所述生成的組合還可以包括任何一個(gè)或多個(gè)目的多核苷酸序列的多個(gè)拷貝。所述性狀聚集組合可以通過任何一種方法創(chuàng)制，包括但不限于通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行植物育種，或是通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法獲得。如果序列是通過植物遺傳轉(zhuǎn)化來聚集的，則目的多核苷酸可以在任意時(shí)間、以任意方向進(jìn)行組合。所述性狀可以通過轉(zhuǎn)化表達(dá)盒提供的目的多核苷酸序列在共轉(zhuǎn)化操作步驟中引入。例如，如果要引入兩條序列，那么兩條序列可以包含在不同的轉(zhuǎn)化表達(dá)盒(反式)中，或包含在同一個(gè)轉(zhuǎn)化表達(dá)盒(順式)中。所述序列的表達(dá)可以由同一個(gè)或是不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在某些情況，可能希望引入抑制目的多核苷酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)化表達(dá)盒。也可以通過將抑制表達(dá)盒或過表達(dá)盒進(jìn)行任意組合，以產(chǎn)生具有所需性狀組合的植株。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該意識(shí)到，多核苷酸序列還可以通過位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在所需的基因組位置進(jìn)行聚集。上述技術(shù)參見專利 W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855 和 W099/25853，以上全部在此通過引用并入。
[0096]需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)建體及其用途是本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和優(yōu)化工作才完成的?！揪唧w實(shí)施方式】述中，除非另有說明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。

【具體實(shí)施方式】
[0097]下面根據(jù)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是為了說明本發(fā)明，而不能以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。另外，除非特別說明，在下面的實(shí)施例中所涉及的方法為常規(guī)方法，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0098]實(shí)施例1:載體構(gòu)建
[0099]通過裝配下述DNA元件，構(gòu)建如圖1所示的被稱為p7R的表達(dá)載體:
[0100]I)以pCAMBIA1300載體為基礎(chǔ)，利用Xmn I和Bgl II酶切去除pCAMBIA1300質(zhì)粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子序列；
[0101]2)基因表達(dá)盒 END2 =DsRed(r) -PINII,DsRed(r)基因(SEQ ID NO:1)的開放讀碼框連接于END2啟動(dòng)子(SEQ ID NO:2)和PINII終止子(SEQ ID NO:3)之間，重組成DsRed (r)的基因表達(dá)盒(END2 =DsRed(r) =PINII)；
[0102]3)0sCYP704B2基因，目標(biāo)基因0sCYP704B2及其啟動(dòng)子和終止子的全長核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中0sCYP704B2基因的啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:7所示，其終止子序列如SEQ ID NO:8所示，0sCYP704B2基因的基因組DNA序列如SEQ ID NO:5所示，其核苷酸序列編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0103]4)基因表達(dá)盒PG47 =ZM-BTl =ZM-AAl:IN2-1,目標(biāo)基因ZM-AAl (其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)的開放讀碼框連接于啟動(dòng)子PG47 (其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示)、轉(zhuǎn)運(yùn)肽ZM-BTl (其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)的下游，終止子IN2-1 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)的上游。
[0104]具體地，載體p7R的構(gòu)建流程具體描述如下:
[0105]第一步，從玉米愈傷組織的c DNA中擴(kuò)增花粉失活基因ZM-AAl和編碼導(dǎo)肽的ZM-BTl，從玉米基因組DNA中擴(kuò)增獲得PG47啟動(dòng)子。其中，用于擴(kuò)增ZM-AAl的擴(kuò)增引物為:
[0106]F3:CGGTACCCGGGGATC |Λ0ΛΤ(:τ| CAAGGAAAAGACGTTATGCAG (SEQ ID NO:37)，方框內(nèi)為Bgl II酶切位點(diǎn)，
[0107]R3:AAGGTCGTCCGGGCGGCCTGCGGCCTGGTCCAGGCAC(SEQ ID NO:38)，其中下劃線標(biāo)示的核苷酸序列為15bp的重疊序列；
[0108]用于擴(kuò)增ZM-TP的擴(kuò)增引物為:
[0109]F4:CGCCCGGACGACCTTGGGATCG (SEQ ID NO:39)；
[0110]R4:ATGGCGGCGACAATGGCAGTGAC (SEQ ID NO:40)；
[0111]用于擴(kuò)增PG47啟動(dòng)子的引物為:
[0112]F5:CATTGTCGCCGCCATGGTGTCGTGATCGATGCTTTAT (SEQ ID NO:41),
[0113]R5:CGACTCTAGAGGATCTGCACCGGACACTGTCTGGTGGCSEQ ID NO:42)，其中下劃線標(biāo)示的核苷酸序列為15bp重疊序列)。
[0114]采用In-Fus1n的方法將擴(kuò)增所得到的ZM-AA1基因，ZM-BT1導(dǎo)肽，PG47啟動(dòng)子三個(gè)片段連入BamHI酶切開的雙元載體pCAMBIA1300上，得到中間載體A。
[0115]第二步，PCR擴(kuò)增人工合成的紅色熒光蛋白基因PINI1-DsRed (r)序列，其中人工合成的PINI1-DsRed(r)序列為如SEQ ID NO:43所示，其擴(kuò)增引物為:
[0116]Fl:ATTAACGCCGAATTGGCCGCATTCGCAAAACACACC (SEQ ID NO:44)，
[0117]Rl:CAAGAACTAGTAACCATGGCCTCCTCCGAGAACGTGA(SEQ ID NO:45)，其中斜體下劃線標(biāo)示的核苷酸序列為15bp的重疊序列。
[0118]從玉米基因組DNA中擴(kuò)增END2序列，其擴(kuò)增引物為:
[0119]F2:CTCGGAGGAGGCCATGGTTACTAGTTCTTGGGGGACG(SEQ ID NO:46)，
[0120]R2:
[0121 ] CTTTTCCTTGAGATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCAGCTTCGCTTAGTTTTTAGT (SEQIDN0:47)，其中斜體下劃線標(biāo)示的核苷酸序列為15bp的重疊序列。
[0122] 采用In-Fus1n的方法將擴(kuò)增得到的PIN I1-DsRed(r)片段與來自玉米且為愈傷組織和種子(胚和胚乳)特異性啟動(dòng)子END2片段同時(shí)連入Xmn I與Bgl II酶切的中間載體A，得到中間載體B。
[0123]第三步，人工合成IN2-1的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO:48所示。用EcoR I與BglII雙酶切人工合成的IN2-1序列，其中，人工合成的IN2-1序列如下所示:
[0124]^gatcl, gacaaagcagcattagtccgttgatcggtggaagaccactcgtcagtgttgagttgaatgt
ttgatcaataaaatacggcaatgctgtaagggttgttttttatgccattgataatacactgtactgttcagttgttgaactctatttcttagccatgccaagtgcttttcttattttgaataacattacagcaaaaagttgaaagacaaaaaaaaaaacccccgaacagagtgctttgggtcccaagctactttagactgtgttcggcgttccccctaaatttctccccctatatctcactcacttgtcacatcagcgttctctttcccctatatctccacgtcgacgcggccaaatcctgaggatctggtcttcctaaggacccgggatatcggacgggggatccactagttctagagcggccgggtaccgagctcgaattaa-
tt [ggcgcgcc gtttaaac:tegcga| tcgatAagggcaattccagcacactggcggccgttactagcga |g;iaHc[ (SEQ ID N0:48)，其中下劃線序列為IN2-1序列，其余序列為載體連接區(qū)序列，方框標(biāo)示的序列依次分別為:Bgl II, Asc I, Nru I和EcoR I酶切位點(diǎn)，其中Bgl II酶切位點(diǎn)后五個(gè)堿基在IN2-1序列上，另外有Asc I，Nru I和EcoR I三個(gè)酶切位點(diǎn)在載體連接區(qū)序列上。酶切人工合成的IN2-1序列所在的質(zhì)粒，連入同時(shí)用EcoR I與Bgl II雙酶切的中間載體B，得到中間載體C。
[0125]第四步，將0sCYP704B2基因分為兩段，分別是CYPl和CYP2，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:60和SEQ ID N0:61所示。從水稻基因組DNA中，分別擴(kuò)增CYPl和CYP2。
[0126]其中，CYPl的擴(kuò)增引物為:
[0127]F6:CGA \fCGCGh\ TTGGTCGAACACGAGGTAGGCG (SEQ ID NO: 49)，方框內(nèi)為 Nru I 酶切位點(diǎn)；
[0128]R6:TCGAAGGACCGCACCGTGACC jfCGA<j, ATG (SEQ ID NO: 50)，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)識(shí)的堿基是為了區(qū)分水稻內(nèi)源的0sCYP704B2基因序列，并且提高表達(dá)效率而特意引入的三個(gè)SNP ；
[0129]CYP2的擴(kuò)增引物為:
[0130]F7:CAT jGTCGAC) GGTCACGGTGCGGTCCTTCGA(SEQ ID NO: 51)，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)識(shí)的是為了區(qū)分水稻內(nèi)源CYP序列，并且提高表達(dá)效率而特意引入的三個(gè)SNP ；
[0131 ] R7:ATT^GCGCGCCf GTTTAAACAGGTGGAAGACAAGGTGGTGAGG (SEQ ID NO: 52)，方框內(nèi)為Asc I酶切位點(diǎn)
[0132]將所得到的兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，連T-載體測序正確后，再分別用Nru I與Sal I，以及Sal I和Asc I雙酶切，同時(shí)連入用Nru I和Asc I雙酶切的中間載體C，即得到7R載體，也稱為P7R。
[0133]實(shí)施例2:水稻轉(zhuǎn)化
[0134]利用熱激法將質(zhì)粒p7R轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻進(jìn)行共轉(zhuǎn)化(Hiei, et al.Efficient transformat1n of rice mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.(1994)Plant J6(2):271-282,通過參照將其并入本文)。具體的轉(zhuǎn)化受體材料為水稻ms26完全雄性不育純合突變體，該突變體是經(jīng)過輻射誘導(dǎo)所得，突變是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)導(dǎo)致(缺失區(qū)段物理位置:ensembl plants oryza japonica group vers1n64.6 (MSU6) chromosome3:3，701，319-3，704，421)。大片段缺失突變使回復(fù)突變的概率極低，因此不育性狀穩(wěn)定，從而保障了不育系的穩(wěn)定性，降低雜交制種風(fēng)險(xiǎn)。利用農(nóng)桿菌將質(zhì)粒P7R轉(zhuǎn)化水稻受體材料，利用載體中的DsRed (r)基因編碼的紅色熒光蛋白作為篩選標(biāo)記，通過3_4輪的愈傷熒光篩選切割后，分化得到轉(zhuǎn)基因植株，該構(gòu)建體經(jīng)過水稻轉(zhuǎn)化得到陽性轉(zhuǎn)基因材料1000株以上，進(jìn)一步通過插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)、載體骨架污染等分析后，結(jié)合田間觀察到的花粉失活效果、結(jié)實(shí)率、種子分離比例等結(jié)果，從中優(yōu)選出兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件7R-949D和7R-1425D。
[0135]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)化事件的花粉育性檢測
[0136]對(duì)實(shí)施例2中所得到的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件7R-949D和7R-142?進(jìn)行觀察分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所得到的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛g沒有觀察到明顯的形態(tài)上的不同。
[0137]以轉(zhuǎn)化受體品系對(duì)應(yīng)的野生型非轉(zhuǎn)基因水稻品種武運(yùn)粳7號(hào)(可育，下面簡稱為CKl)和轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻品系武運(yùn)粳7號(hào)ms26突變體(不育，下面簡稱為CK2)為對(duì)照，進(jìn)行花粉可染率檢測。
[0138]在水稻開花晚期，從大田的轉(zhuǎn)基因水稻、CKl及CK2小區(qū)各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，置于載玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用鑷子和解剖針釋放花粉后，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)可染色花粉數(shù)和花粉總數(shù)(圖2顯示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。分別計(jì)算轉(zhuǎn)基因水稻、CKl及CK2花粉可染率各材料3次重復(fù)的平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。在CKl正?？捎虲K2正常不育的前提下，通過X2測驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)基因水稻的花粉可染率與理論值(50%)有無顯著差異。
[0139]結(jié)果顯示，7R-949D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如下表1所示。本試驗(yàn)利用I2-KI染色法對(duì)隨機(jī)抽取的17個(gè)植株的花粉分離比例(3次重復(fù)的平均數(shù))進(jìn)行了調(diào)查，從表1中可以看出，可育對(duì)照(CKl)的可育率在98.6%~100%之間；不育對(duì)照(CK2)可育率為O ;通過X 2-檢驗(yàn)(自由度為1)，17個(gè)71?-9490單株中，除單株9的卡方值(7.454)微高于臨界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉與不育花粉分離比例均在P ^ 0.05水平，符合1:1的比例。
[0140]7R-1425D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如表2所示。隨機(jī)抽取的17個(gè)植株，計(jì)算3次重復(fù)的平均數(shù)。從表2中可以看出，可育對(duì)照(CKl)的可育率在95.0.1%~99.8%之間；不育對(duì)照(CK2)可育率為O ;通過X2-檢驗(yàn)(自由度為1)，17個(gè)7R-949D單株中，除單株3的卡方值(6.426)高于臨界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉與不育花粉分離比例均在P < 0.05水平，符合1:1的比例。
[0141]該結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化事件7R-949D和7R-142?中的T-DNA外源基因在各世代均處于雜合狀態(tài)，因此有一半花粉不含外源基因(可育)，一半含有外源基因(不育)，且ZM-AAl表達(dá)框可以有效地分解花粉中的淀粉，從而使含有外源基因的花粉失去活力，喪失授精能力，造成轉(zhuǎn)基因花粉失活。該設(shè)計(jì)使得上述兩個(gè)轉(zhuǎn)化事件中，含有ZM-AAl基因的轉(zhuǎn)基因花粉全部失活，不能授精還能嚴(yán)格防止基因漂移等生物安全問題，失活的花粉不能與周圍其它植株或雜草授粉，因而轉(zhuǎn)基因也不能通過花粉漂移到環(huán)境中。
[0142]表1:轉(zhuǎn)化體7R-949D T2代植株上花粉I2-KI染色分析
[0143]

【權(quán)利要求】
1.一種水稻轉(zhuǎn)化事件SPT-7R-949D，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化事件中含有一個(gè)外源插入序列，所述外源插入序列的5’端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO: 13或17所示，所述外源插入序列的3’端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO: 14或18所示。
2.權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)化事件SPT-7R-949D，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化事件的基因組中含有一個(gè)外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID N0:53所示。
3.用于鑒定生物樣品中事件SPT-7R-949D的方法，其包括: a)設(shè)計(jì)特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQID NO:53或其互補(bǔ)序列的第一探針或第一引物；和 b)設(shè)計(jì)特異性識(shí)別SEQID NO:13或14的側(cè)翼部分序列的第二探針或第二引物檢測SPT-7R-949D的特異區(qū)； 其中第一和第二探針或引物所檢測的單核苷酸片段少于100，OOObp0
4.權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括利用至少兩條引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述生物樣品中擴(kuò)增鑒定SPT-7R-949D事件的DNA片段，其中所述的第一引物特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQ ID NO:53或其互補(bǔ)序列，第二引物特異性識(shí)別SEQ ID NO:13或14的側(cè)翼部分序列。
5.一種檢測生物樣品中事件SPT-7R-949D或其子代的方法，包括: (a)從所述生物樣品提取DNA樣品； (b)提供DNA引物對(duì)，其中所述的第一引物特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQIDNO:53或其互補(bǔ)序列，第二引物特異性識(shí)別SEQ ID NO:13或14的側(cè)翼部分序列； (c)提供DNA擴(kuò)增反應(yīng)條件； (d)進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，獲得DNA擴(kuò)增子；和 (e)檢測所述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的DNA擴(kuò)增子在所述DNA擴(kuò)增反應(yīng)中的檢出表明事件SPT-7R-949D的存在。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的DNA擴(kuò)增子包括部分或全部的選自SEQIDNO: 13、14、17、18或53的序列，所述DNA擴(kuò)增子的檢出表明事件SPT-7R-949D的存在。
7.一種檢測事件SPT-7R-949D中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括:將包含DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，可以特異性檢出SPT-7R-949D轉(zhuǎn)化事件的DNA，表明SPT-7R-949D事件的存在，其特征在于，所述探針選自SEQ ID NO:53所示的部分序列。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的多核苷酸探針其核苷酸序列如SEQID NO: 55或56所示。
9.一種水稻轉(zhuǎn)化事件SPT-7R-1425D，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化事件中含有一個(gè)外源插入序列，所述外源插入序列的5’端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO: 15或19所示，所述外源插入序列的3’端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQ ID NO: 16或20所示。
10.權(quán)利要求9所述的水稻轉(zhuǎn)化事件SPT-7R-1425D，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化事件的基因組中含有一個(gè)外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示。
11.用于鑒定生物樣品中事件SPT-7R-1425D的方法，其包括:a)設(shè)計(jì)特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQID NO:54或其互補(bǔ)序列的第一探針或第一引物；和 b)設(shè)計(jì)特異性識(shí)別SEQID NO:15或16的側(cè)翼部分序列的第二探針或第二引物檢測SPT-7R-949D的特異區(qū)； 其中第一和第二探針或引物所檢測的單核苷酸片段少于100，OOObp0
12.權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括利用至少兩條引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述生物樣品中擴(kuò)增鑒定SPT-7R-142?事件的DNA片段，其中所述的第一引物特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQ ID NO:54或其互補(bǔ)序列，第二引物特異性識(shí)別SEQ ID NO:15或16的側(cè)翼部分序列。
13.一種檢測生物樣品中事件SPT-7R-1425D或其子代的方法，包括: (a)從所述生物樣品提取DNA樣品； (b)提供DNA引物對(duì)，其中所述的第一引物特異性識(shí)別外源T-DNA插入序列SEQIDNO:54或其互補(bǔ)序列，第二引物特異性識(shí)別SEQ ID NO:15或16的側(cè)翼部分序列； (c)提供DNA擴(kuò)增反應(yīng)條件； (d)進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，獲得DNA擴(kuò)增子；和 (e)檢測所述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的DNA擴(kuò)增子在所述DNA擴(kuò)增反應(yīng)中的檢出表明事件SPT-7R-1425D的存 在。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的DNA擴(kuò)增子包括部分或全部的選自SEQIDN0:15、16、19、20或54的序列，所述DNA擴(kuò)增子的檢出表明事件SPT-7R-1425D的存在。
15.一種檢測事件SPT-7R-1425D中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括:將包含DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，可以特異性檢出SPT-7R-1425D轉(zhuǎn)化事件的DNA，表明SPT-7R-142?事件的存在，其特征在于，所述探針選自SEQ ID NO:54所示的部分序列。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的多核苷酸探針其核苷酸序列如SEQIDNO:57、58 或 59 所示。
17.權(quán)利要求1或9所述的轉(zhuǎn)化事件在育種中的應(yīng)用。
18.包含事件SPT-7R-949D 和 SPT-7R-1425D 的植物。
19.由權(quán)利要求18所述的植物產(chǎn)生的種子。
20.一種水稻品種，其特征在于所述水稻品種在其第3號(hào)染色體短臂上的第.14，746，015-14, 746，027 的物理位置上，含有一個(gè) 0sCYP704B2 基因。
21.—種水稻品種，其特征在于所述水稻品種在其第I號(hào)染色體長臂的第.42，215，016-42, 215，095 的物理位置上，含有一個(gè) 0sCYP704B2 基因。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104067944SQ201310347764
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月25日
【發(fā)明者】鄧興旺, 王海洋, 周君莉 申請(qǐng)人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司, 鐵嶺先鋒種子研究有限公司