專利名稱：一種調(diào)控水稻株型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種分子設(shè)計方法調(diào)控水稻株型的方 法。本發(fā)明的方法是，通過特異表達基因OsTBl的啟動子調(diào)控水稻OSa-miR156e基因或其 同源基因的表達，達到調(diào)控水稻株型的目的，利用該方法在轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻種子 中的應(yīng)用，塑造水稻理想株型，提高水稻產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人口以其為主食。同時，由于 水稻具有基因組小、精細的遺傳和物理圖譜、相對容易的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及與其它禾本科作物 的共線性，而被視作基因組研究和遺傳改良的模式植物。為解決人口增長與耕地面積減少 的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。近年來，隨著水稻功能基因組 研究的深入，許多控制水稻產(chǎn)量的功能基因被分離克隆，如Gnla(Ashikari等，Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science, 2005, 309 :741_745),GW2(Song等， A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3ubiquitin ligase. Nat Genet,2007, 39 :623_630), GS3(Fan 等，GS3, a major QTL for grain lengthand weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembraneprotein. Theor Appl Genet, 2006,112 1164-1171), Ghd7 (Xue 等，Natural variation in Ghd7 is animportant regulator of heading date and yield potential in rice. Nat Genet, 2008,40 :761_767),qSW5(Shomura等，Deletion in a gene associated with grain size increased yields during ricedomestication. Nat Genet, 2008, 40 1023-1028), GIFl(Wang Control of rice grain-filling andyield by a gene with a potential signature of domestication. Nat Genet, 2008, 40 :1370-1374),GW5(Weng等，solation and initial characterization of Gff5,a major QTL associated with rice grainwidth and weight. Cell Res, 2008,18 :1199_1209), 這些控制水稻產(chǎn)量的功能基因主要是通過控制穗形態(tài)和種子大小，表現(xiàn)出重大的育種應(yīng)用 前景。然而，水稻產(chǎn)量性狀的遺傳改良取決于穗型、粒型、分蘗數(shù)、株型等一系列因素。株 型育種被認為是提高水稻產(chǎn)量的重要方法，50,60年代的矮化育種就是株型育種在提高產(chǎn) 量方面的一個很好的例子。早在1994年，國際水稻所(IRRI)提出了水稻理想株型育種， 即基于減少分蘗總數(shù)、提高成穗率、株型緊湊、塑造穗大粒多等等的一類新株型(NPT)的指 導(dǎo)思想(Khush G S. Breaking the yield frontier of rice. Geo Journal，1995，35 (3) 329-332)。我國的“水稻超高產(chǎn)育種計劃”實質(zhì)也離不開株型問題。水稻的單株分蘗數(shù)是影響水稻株型的重要因子，而在產(chǎn)量構(gòu)成的三要素即穗數(shù)、 每穗粒數(shù)和粒重中，穗數(shù)的多少在很大程度上受制于分蘗的發(fā)生量，因而分蘗是影響水稻 和小麥等主要農(nóng)作物單株產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。水稻分蘗是一個復(fù)雜的農(nóng)藝性狀。 一般認為，分蘗數(shù)目是受多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳力較低，光照、灌溉、肥料、溫度等 都環(huán)境因素會對它有很大影響。在控制水稻分蘗基因鑒定方面，Wu等應(yīng)用動態(tài)基因定位法在重組自交系群體中定位了 5個數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus, QTL) (ffu 等，Time-Related Mapping of Quantitative Trait Loci Underlying Tiller Number in Rice. Genetics, 1999,151 =297-303) 0至今已發(fā)現(xiàn)了大量的影響分蘗數(shù)目的數(shù)量性狀 位點(QTLs)，但大部分只是初步定位，只有少部分克隆到基因。John Doebley等在1997 年利用轉(zhuǎn)座子標簽法分離到一個玉米主莖腋生分枝數(shù)相關(guān)基因TBI (John Doeb等，The evolution of apical dominance in maize. Nature, 1997,386 485~488 ；Martienssen R.， The origin of maize branches out. Nature，1997，386 :443.)。Schumacher K 等 1999 年 克隆到了控制番茄側(cè)枝發(fā)生基因 LS(Schumacher 等，The lateral suppressor (LS) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1999，96 :290_295)。2003年Greb T等克隆到擬南芥的側(cè)枝抑制基因LAS(Greb 等，Molecular analysisof the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillarymeristem formation. Genes Dev. ,2003,17 1175-1178.)。而水稻分蘗控制基因MOCl的克隆是近年來在植物形態(tài)建成特別是側(cè)枝形 成研究領(lǐng)域中最重要的進展之一 (Li X et al.，Control of tillering inrice. Nature, 2003,422 :618-621)。此外，株高、穗大小、成穗率、分蘗角度、莖桿強度和葉片夾角等也是衡 量水稻等農(nóng)作物株型的指標。小分子RNA是當今的一個研究熱點，迄今為止在許多植物中都發(fā)現(xiàn)了編碼miR156 的小分子RNA基因，該基因家族含有多個成員，如水稻oSa-miR156基因家族有12個成員 osa-miR156a-—osa_miR1561。同一 miRNA基因家族的成員其編碼的成熟的小分子RNA 序列基本相同，且生物學功能也基本相同。研究表明，編碼小分子RNA的基因miR156在 擬南芥、玉米、水稻生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。組成型超量表達miR156基因， 植株頂端優(yōu)勢變?nèi)?，花器官發(fā)育異常，花序(穗)變小，株高矮化，分枝增多，加速葉片生 長速度和葉片數(shù)量形成一個叢生的表型，延緩生長發(fā)育過程，推遲開花等(Schwab R et al.，Specificeffects of microRNAs on the plant transcriptome. Dev Cell,2005, 8 :517_527 ；Chuck G et al.，The heterochronic maize mutant Corngrassl results from overexpression of a tandem microRNA. NatGenet，2007，39 :544_549 ；Xie et al. ， Genomic organization, differential expression, andinteraction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol，2006，142 :280_293)。由此可見，miR156基因在調(diào)控植物的株型方面發(fā)揮了重要 作用。雖然OSa-miR156e基因超量表達可以提高水稻的分蘗數(shù)，但是分蘗數(shù)太多 不能形成理想的株型，組成型表達oSa-miR156e基因同時還會影響水稻的穗型和育 性，過量表達OSa-miR156e基因會使水稻穗型變小，育性降低甚至不育，從而造成減產(chǎn) (Xie et al. , Genomic organization, differential expression, andinteraction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol, 2006,142 =280-293) 本發(fā)明通過特異性表達基因OsTBl的啟動子驅(qū)動 OSa-miR156e的表達，可以增加水稻植株的有效分蘗數(shù)，優(yōu)化水稻株型，進而提高單株產(chǎn)量。水稻OsTBl基因是控制分蘗的一個重要基因(Takeda T et al.，The OsTBl gene negatively regulateslateral branching in rice. Plant J，2003，33 :513_520)。OsTBl基因是通過與玉米的分枝基因TBl的序列同源性比較而分離克隆的(Jchh Doebley et al. , The evolution of apical dominance in maize. Nature,1997,386 :485_488 ; Martienssen R. , The origin of maize branches out. Nature, 1997, 386 :443),它們都編 碼一個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子含有一個DNA結(jié)合模體basic helix-loop-helix type也稱為TCP domain。超量表達OsTBl導(dǎo)致水稻分蘗數(shù)急劇下降，基本不產(chǎn)生分蘗，或只有1_2個分蘗， 但是剝開葉片能看到莖節(jié)上的腋芽，說明腋芽的形成沒有受到影響，只是不能伸長形成正 常的分蘗。OsTBl基因的突變體fine culm l(fcl)植株表型發(fā)生顯著變化，分蘗數(shù)明顯增 多，是正常水稻分蘗數(shù)的3倍以上。OsTBl基因的突變體fcl和正常的野生型水稻一樣分蘗 數(shù)也受種植密度的影響。該基因是一個特異表達基因，主要在腋芽中表達，另外在莖頂端生 長點基部，莖髓的維管組織和葉片連接處的維管組織也有表達。為了深入開發(fā)miR156基因在調(diào)控水稻株型中的作用，培育理想株型的水稻品種， 本發(fā)明利用OsTBl基因的啟動子特異表達模式調(diào)控水稻OSa-miR156e基因或其同源基因 的表達模式來改良水稻的重要農(nóng)藝性狀，如分蘗數(shù)，株高，穗大小，結(jié)實率，成穗率等農(nóng)藝性 狀，達到改良水稻株型的目標。本發(fā)明采用分子設(shè)計育種的方法調(diào)控水稻株型，有望在水稻 株型育種中應(yīng)用，塑造理想株型，達到增產(chǎn)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種利用分子育種技術(shù)調(diào)控水稻株型的方法，在水稻 育種中應(yīng)用側(cè)生分生組織特異表達基因OsTBl啟動子調(diào)控水稻OSa-miR156e基因或其基因 家族的其它同源基因的表達模式達到調(diào)控水稻株型的目的。本發(fā)明的另一個目的是將上述方法在在轉(zhuǎn)基因水稻作為調(diào)控水稻株型的應(yīng)用。本發(fā)明采用分子設(shè)計育種的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育種中應(yīng)用，塑 造理想株型，達到增產(chǎn)的目的。實現(xiàn)本發(fā)明的簡要過程如下1、構(gòu)建OsTBl啟動子驅(qū)動osa_miR156e基因的載體pTBl:156e本發(fā)明所用的特異表達基因OsTBl的啟動子，主要在腋芽中表達，另外在莖頂端 生長點基部，莖髓的維管組織和葉片連接處的維管組織也有表達(Takeda等，The OsTBl gene negatively regulates lateralbranching in rice.Plant J，2003，33 :513_520)。 已知水稻osa-miR156基因家族有12個成員osa_miR156a-—osa_miR1561，本發(fā)明選其中的 一個成員osa-miR156e基因(其DNA序列見SEQ ID NO :2所示，序列長度為390bp)將其構(gòu) 建到PCAMBIA1300 vector載體上(見圖1)。再將水稻基因OsTBl的啟動子(其DNA序列見SEQ ID NO :1所示，序列長度為 2779bp)通過酶切和連接的方法構(gòu)建到遺傳轉(zhuǎn)化載體中。申請人:將構(gòu)建好的載體命名為pTBl: 155e。2、遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functionalanalysis of the rice genome. Plant J, 2003, 35 :418_427)。^！奪上 述pTBl:156e載體導(dǎo)入到水稻品種“中花11”中。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果共得到40株轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基 因)苗(見圖2)。
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3. OsTBl啟動子調(diào)控下的osa_miR156e基因的表達情況用 stem-loop RT-PCR 的方法(Chen等，Real-time quantification of microRNAs by stem-loopRT-PCR. Nucleic Acids Res，2005，33 :el79)檢測 OsTBl 啟動子調(diào)控下的 osa-miR156e基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSa-miR156e在轉(zhuǎn)基因水稻植株所有部位都有提 高，但以葉鞘，莖，分蘗芽中的表達量提高比較明顯(見圖3)。4、對水稻株型的改良和應(yīng)用從所有轉(zhuǎn)基因植株中挑選出表型最好的1個TO代單株種植下一代。在不同的種 植密度下考察轉(zhuǎn)基因水稻單株的分蘗數(shù)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。發(fā)現(xiàn)OSa-mirl56e基因組成型 表達的水稻分蘗數(shù)目太多，無效分蘗多，植株矮，穗短，著粒稀，結(jié)實率低，產(chǎn)量下降，而經(jīng)過 OsTBl啟動子特異表達OSa-miR156e基因后，相比組成型表達OSa-miR156e基因的植株分蘗 數(shù)減少，但無效分蘗明顯減少，株高變高、穗變大、結(jié)實率提高，整體株型得到改善，產(chǎn)量也 顯著提高(圖4)。本發(fā)明的優(yōu)點和效果1、首次通過特異表達基因OsTBl的啟動子調(diào)控水稻oSa-miR156e基因，或其基因 家族的其它同源基因，或其功能類似物的表達模式，來調(diào)控水稻株型。2、本發(fā)明采用分子設(shè)計育種的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育種實踐中應(yīng) 用，塑造理想株型，達到增產(chǎn)的目的。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的水稻基因的OsTBl啟動子，其DNA序列長度 為 2779bp。序列表SEQ ID NO :2是本發(fā)明克隆的osa_miR156e基因，其DNA序列長度為 390bp。圖1.是報道的pCAMBIA1300載體(質(zhì)粒)圖。圖2.轉(zhuǎn)pTBl:156e的植株株型出現(xiàn)明顯的改變，圖中a_g是不同轉(zhuǎn)基因植株株 型出現(xiàn)不同程度的改變，h為分蘗情況對比，i為穗大小對比，所有圖片左邊為對照“中花11 號”，右邊為本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植株。圖3、采用stem-loop RT-PCR的方法檢測OsTBl啟動子調(diào)控下的osa_miR156e基 因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSa-miR156e在轉(zhuǎn)基因植株的所有部位都有提高，以葉鞘，莖，分 蘗芽中的表達量提高比較明顯。圖4、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀考種結(jié)果，圖4A-G為3種不同密度條件下種植 結(jié)果。圖4A 株高(cm)；圖4B 單株分蘗數(shù)；圖4C 穗長(cm)；圖4D 單株產(chǎn)量，單位克； 圖4E 每穗穎花數(shù)；圖4F 育性；圖4G 單株有效穗數(shù)。X軸數(shù)字代表種植密度(cmXcm)。
具體實施例方式實施例1.構(gòu)建水稻基因OsTBl啟動子驅(qū)動osa_miR156e基因的載體pTBl: 156emiR156組成型表達對水稻株型有重要影響分蘗數(shù)大量增加，植株變矮，抽穗變 遲，穗變小等，結(jié)實率降低，產(chǎn)量下降。本發(fā)明通過特異表達啟動子驅(qū)動miR156在側(cè)生分生 組織等部位表達，希望提高水稻分蘗能力，而對其他性狀沒有影響，達到改良株型的目的，進而應(yīng)用于水稻育種實踐。所用的特異表達基因OsTBl的啟動子，主要在腋芽中表達，此外在莖頂端生長點 基部，莖髓的維管組織和葉片連接處的維管組織也有跡量表達。水稻osa-miR156 基因家族有 12 個成員 osa_miR156a-—osa_miR1561，選其中的 osa-miR156e 基因構(gòu)建到 pCAMBIAUOO vector 上(圖 1)。PCR擴增引物如下(為了對片段克隆，在引物中加入了相應(yīng)酶切位點，引物的下劃 線部分是酶切位點)TEV-L(SalI) 5' CTTGTCGACactggcaagactatcagaattc 3，，TER-R(SphI) :5， gccaagcttGCATGCctgcag 3，。PCR反應(yīng)體系的總體積為 50 μ l，pUmiR156e質(zhì)粒(Xie 等，Genomic organization, differentialexpress ion, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors andmicroRNA156 in rice.Plant Physiol,2006,142 280-293) 1 μ 1(約lOOng)作為PCR擴增的模板，LA Taq酶0. 5 μ 1 (購自寶生物工程(大連) 有限公司)，2XGC buffer I 25 μ l,2mM dNTP 8 μ l、10uM 引物各 2 μ 1、加 ddH20 至 50 μ 1。反應(yīng)程序為94°C變性5min，94°C 45s、55°C 45s、72°C lmin、33 cycles，72°C延伸 7min,擴 2 管。擴增片段純化回收收集PCR產(chǎn)物于1. 5ml離心管純化，加等體積24 1氯仿異 戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95%乙醇，1/10體積3M醋酸 鈉(PH5. 2)，_20°C放置30分鐘，12000rpm離心20分鐘，棄上清，加500μ1 75%乙醇放置 5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干，加75 μ 1 ddH20溶解。酶切和純化回收將純化的PCR產(chǎn)物及pC1300載體酶切，體系總體積100 μ 1， PCR產(chǎn)物或載體質(zhì)粒75μ1，限制性內(nèi)切酶Sail 30U，限制性內(nèi)切酶SphI 30U，10XH buffer 10μ 1，加ddH20到100μ 1，37°C酶切5小時。純化酶切產(chǎn)物，方法同上，最后加10μ 1 ddH20溶解。連接反應(yīng)10μ1 PCR酶切純化產(chǎn)物全部用于連接反應(yīng)，載體0.5μ l，2u T4 ligase，5Xbuffer 3 μ 1，總15 μ 1體積，連接24小時。取1 μ 1連接產(chǎn)物，電壓1800V，電 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B，加800 μ 1 LB,復(fù)蘇45分鐘，取200 μ 1涂于含卡那霉素的LA平板， 37°C，過夜。挑單克隆，擴大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，酶切驗證結(jié)果正確，酶切方法同上。PCR驗證，體系 程序同上。挑陽性克隆抽質(zhì)粒備用。再把OsTBl啟動子插入到上面構(gòu)建好的載體中，方法如下PCR擴出OsTBl啟動子區(qū)2779bp長的DNA片段，PCR擴增引物如下(為對片段克隆，在引物中加入了相應(yīng)酶切位點，引物的下劃線 部分是酶切位點)OsTBlS(SalI) 5' CTTGTCGACgcgttgctgctgctactgct 3，，OsTBlA(SacI) :5， CTTGAGCTCccttcgacgagacgatgacg 3，。PCR反應(yīng)體系的總體積為50 μ 1，日本晴水稻BAC a0041G12質(zhì)粒1 μ 1 (約IOOng)、 LA Taq 酶 0. 5μ l(Takara 公司)、2XGC bufferl 25 μ l,2mM dNTP 8 μ l、10uM引物各 2 μ 1、 加 ddH20 至 50 μ 1。
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反應(yīng)程序為94°C變性5min，94°C 45s、60°C 70s,72°C 3min、33cycles，72°C延伸 7min，擴增2管。PCR產(chǎn)物純化回收方法同上。酶切和純化同收把純化的PCR產(chǎn)物及上面構(gòu)建好的載體酶切，反應(yīng)體系總體 積100 μ 1，PCR產(chǎn)物或載體質(zhì)粒75 μ 1，限制性內(nèi)切酶Sail 30U,限制性內(nèi)切酶SacI 30U， IOXT buffer 15 μ 1, BSA 10 μ 1，加 ddH20 到 100 μ 1，37°C 酶切 5 小時。純化酶切產(chǎn)物，方 法同上，最后加IOyl ddH20溶解。連接反應(yīng)10μ1 PCR產(chǎn)物全部用于連接反應(yīng)，載體0. 5μ1，2υ Τ4 ligase, 5Xbuffer 3 μ 1，總15 μ 1體積，連接24小時。取1 μ 1連接產(chǎn)物，電壓1800V，電轉(zhuǎn)到大 腸桿菌DH10B，加800 μ 1 LB，復(fù)蘇45分鐘，取200 μ 1涂于含卡那霉素的LA平板，37°C，過 夜。挑單克隆，擴大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，酶切驗證，酶切方法同上。PCR驗證，體系程序同上。挑陽 性克隆，把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗證，挑選正確克隆，取750 μ 1 含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等體積的50%甘油混勻，-70°C保存。構(gòu)建好的載體命名為 pTBl:156e。由本實驗室測序驗證測序引物為TEV :5，cgaatc tcaagc aatcaa gcat 3，。測序 結(jié)果完全正確，測序序列如下GGAGGCAACCCGCTGGGGGGGCCCTCATGCGCATTTAATCATTTCTTTTAAGCAAAAGCAATTTTCTGA AAATTTTCACCATTTACGAACGATAGCCGGTACCTAAATCCACTGGCCGGTGGACCGGTCCGGTGTGCACGCCTCAGCTTCTCGACCGCGA TCCGTCGCCGTGTGGTTGGTGTACGTTGCGGTCTCTTCACGCGCTCGCGCGCGCGGCGAGGTATGTGTGTGTCCGCGGGTTTCATCGTGGG GGTGTGAGCTAGCTAGCTAGGCGAGCGTGAGTGGGTGTGGAGGATGGCGGTGTCTCCGGCCGGCGGGCGGGCGGGCCGGTGGCGCGAGGTG ACAGAAGAGAGTGAGCACACGGCCGGGCGTGACGGCACCGGCGGGCGTGCCGTCGCGGCCGCGTGCTCACTGCTCTTTCTGTCATCCGGTG CCGGCCGTTTTCTCCCCCTCCCGCGGCTAGCTAAGCTGGCCTCTCGGCCCCTCGCCGGCCGGCCGGTCGCTGACGGAATCCCCTGTACTGC TCCGCGCGCCATGAGCTGTTCC GAGTCTCTAGGCTCTTTAGATTAATTCGATCCCCTCTTCTCCGGCGCAATCGTGCATAGGCGCAGTTGC CAGGGGATCCTCTAGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAATAATGTGTGAGTAGTT CCCAGATAAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATAC TTCTATCAATAAAATTTTCTAAATTCCTAAAACCAAAAATCCAGTGACCTGCCAGGCAATGCAAGCTTTGCCATGCCTTGCAGGTTCGACT CTAGCAGGCAGCAGGCATCATTCAATATTCTGATTCCTTAAATTTAAGATACGAGCAGGCCATGACAGTCCCTTCTGGAAAGTTACAACCC CCTTGAAGTCTAAACAGGTCAACCAAGTTACCACAGAAGTTAGGCAAAAGGCCGAATTCCGGAATTCGGCCATATCCAACAATGGCATTGA
8GGCGAATTCGTAAATCCATGGTCCATAAGCCGTGATCCTCGGTGTGGAAGAAGTCTGTATGATACCGmiRNA基因是一種不編碼蛋白質(zhì)的基因，不需要通過蛋白質(zhì)行使功能，它通過自身 轉(zhuǎn)錄的RNA剪切出成熟的小RNA分子行使功能。實施例2.遺傳轉(zhuǎn)化和OsTBl啟動子調(diào)控下的osa-miR156e基因的表達采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines forfunctional analysis of the rice genome. Plant J, 2003,35 :418_427)將 pTBl: 156e載體導(dǎo)入水稻品種“中花11”上。1)愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞15 分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度25-27°C。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫 度 25-27 0C ο3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫度 25-27 °C。4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫 度 28 0C ；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20 "C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。篩選標記為潮霉素。(抑制 農(nóng)桿菌用頭孢霉素，第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)。7)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(20001x)下培養(yǎng)，溫度26V，5-7 周。8)生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化時產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的兒天保 持水分濕潤。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果共得到轉(zhuǎn)化苗40株。轉(zhuǎn)pTBl:156e的水稻植株株型出現(xiàn)明顯的改變，如分蘗數(shù)，株高，穗大小等都出現(xiàn) 變化。株型的改變程度有強有弱，展現(xiàn)出與OSa-miR156e基因表達量的劑量強度的相關(guān)性 (見圖2)。OsTBl啟動子調(diào)控下的osa-miR156e基因的表達情況用stem-loop RT-PCR的方法檢測OsTBl啟動子調(diào)控下的osa_miR156e基因的表 達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)oSa-miR156e在所有部位都有提高，但在葉鞘，莖，分蘗芽中的表達量提 高比較明顯(圖3)。實施例3.轉(zhuǎn)pTBl 156e的水稻植株對株型的改良和應(yīng)用在所有轉(zhuǎn)pTBl 156e的轉(zhuǎn)基因植株中挑選出表型最好的1個TO代單株種植下一 代。在不同的種植密度下考察單株的分蘗數(shù)、產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀(圖4)。種植設(shè)計種植材料選取1個單拷貝株系，對照種為ZHll及組成型超表達oSa-miR156e植 株種植密度3種(1)稀植8 寸 X8 寸(26. 7cmX26. 7cm)(2)正常密度5 寸 XX8 寸(I6· 7cmX26. 7cm)(3)密植5 寸 X5 寸(16. 7cmX16. 7cm)每個小區(qū)種植3-5行，每行10株。2個試驗重復(fù)?？挤N取小區(qū)中間一行的第3 到第7株，連續(xù)取5株?？疾煨誀畹姆椒ㄖ旮邌沃曜罡咚敕f尖到地面的高度單株有效穗數(shù)單株每穗實粒數(shù)超過5粒的穗數(shù)每穗實粒數(shù)株實粒數(shù)除以單株有效穗數(shù)穗長從穗頸節(jié)到穗穎尖的單株平均穗長結(jié)實率株總實粒數(shù)除以單株總穎花數(shù)乘以100%每穗穎花數(shù)株總穎花數(shù)除以單株有效穗數(shù)穗著粒密度穎花數(shù)除以平均穗長千粒重單株實粒重除以單株實粒數(shù)再乘以1000單株產(chǎn)量單株全部實粒重實施結(jié)果如下相比組成型超表達OSa-mirl56e，在pTBl特異性啟動子驅(qū)動下對水稻株型有明 顯的改良。OSa-mirl56e組成型表達植株的分蘗數(shù)目太多，無效分蘗多，植株矮，穗短， 著粒稀，結(jié)實率低，產(chǎn)量下降。而經(jīng)過OsTBl啟動子特異表達后，雖然單株分蘗數(shù)下降從109. 10個降至32. 80個，但比野生型(未轉(zhuǎn)基因)單株的分蘗數(shù)明顯增多。相比組成型 表達osa-mirl56e的植株，轉(zhuǎn)化pTBl 156e植株無效分蘗少，株高變高從62. 65cm提高到 94. 28cm ；穗變大，每穗粒數(shù)從9. 40粒增加到73. 04粒；結(jié)實率的提高從59. 46%提高到 85. 69% ；整體株型得到改善，單株產(chǎn)量從11. 02克提高到51. 41克(見圖4)。由此可見， 通過側(cè)生分生組織特異表達基因OsTBl的啟動子驅(qū)動OSa-miR156e的轉(zhuǎn)基因方法，是一條 有效改良水稻株型的策略，具有提高水稻產(chǎn)量的潛力。相比野生型(未轉(zhuǎn)基因)水稻品種“中花11”，在種植密度為26. 7cmX26. 7cm的 條件下，轉(zhuǎn)pTBl:156e的植株分蘗數(shù)明顯增多，由平均每株分蘗數(shù)21. 50個提高到了 32. 80 個(圖4)，但平均單株產(chǎn)量為51. 41g，比野生型水稻品種“中花11”的57. 87g略有降低。 分析其原因，主要是在該統(tǒng)一密度的種植密度下，轉(zhuǎn)pTBl:156e的植株由于分蘗數(shù)增多，單 株獲得的水肥、光照條件不夠，導(dǎo)致其穗長變短，每穗粒數(shù)急劇下降。由于轉(zhuǎn)pTBl:156e的 植株具有明顯增加水稻有效分蘗數(shù)的效果，且植株結(jié)實率基本正常，因此在合理的稀植和 水肥條件下，轉(zhuǎn)pTBl: 156e的植株的增產(chǎn)效果將更加明顯。附錄農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑和配方(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzyIaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)； NAA (Napthalene aceticacid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid,吲哚乙酸)；2， 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二tti fi ZiSI) ；AS (Acetosringone, ΖλΜ 香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)； DMSO (Dimethyl S μ lfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6min (N6 小量成分 溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmin (MS小量成分溶液)(2)組織培養(yǎng)的溶液配方l)N6max 母液[10 倍濃縮液(IOX)]
0130]硝酸鉀(KNO3)28. 3g
0131]磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. Og
0132]硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63g
0133]硫酸鎂(MgSO4· 7H20)1. 85g
0134]氯化鈣(CaCl2· 2H20)1. 66g
0135]逐一溶解，然后在20-25°C下定容至1000ml。
0136]2)N6min 母液[100 倍濃縮液(100X)]
0137]碘化鉀(KI)0. 08g
0138]硼酸(H3BO3)0. 16g
0139]硫酸錳(MnSO4· 4H20)0. 44g
0140]硫酸鋅(ZnSO4· 7H20)0. 15g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTAC存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 2. 78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70°C，然后加入乙二銨四乙酸 鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73g
田在它們都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2小時，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)鋃tj。
4)維生素貯存液(100X)
煙酸(Nicotinic acid)0. Ig
維生素 Bl (Thiamine HCl)0. Ig
維生素 B6(Pyridoxine HCl)0. Ig
甘氨酸(Glycine)0. 2g
肌醇(Inositol)IOg
加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆肙
5) MSmax 母液(IOX)
硝酸銨(NH4NO3)16. 5g
硝酸鉀19. Og
磷酸二氫鉀1.7g
硫酸鎂3. 7g
氯化鈣4. 4g
在20-25°C下溶解并定容至1000ml。
6) MSmin 母液(100X)
碘化鉀0. 083g
硼酸0. 62g
硫酸錳(MnSO4 · 4H20)2. 23g
硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)0. 86g
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 025g
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 0025g
氯化鈷(CoCl2 · 6H20)0. 0025g
在20-25°C下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D 貯存液(lmg/ml)
2,4-D lOOmg.
Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25 °C下保存。
8)6-BA 貯存液(lmg/ml)
6-BA IOOmg.
Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25 °C下保存。
9) NAA 貯存液(lmg/ml)
NAA IOOmg.
Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 10) IAA 貯存液(lmg/ml)
IAA IOOmg.
Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存?zhèn)溆谩?br> 0181]11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)
0182]葡萄糖 125g
0183]蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?br> 0184]12) AS 貯存液
0185]AS0. 392g
0186]DMSOIOml
0187]分裝至1. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 0188]13) IN氫氧化鉀貯存液
0189]氫氧化鉀 5.6g
0190]蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存?zhèn)溆谩?br> 0191]14)KT 貯存液(lmg/ml)
0192]KT IOOmg.
0193]Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。(3)培養(yǎng)基配方
1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2，4-D貯存液2. 5ml
脯氨酸(Proline)0. 3g
CH0. 6g
蔴糖(Sucrose)30g
Phytagel3g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)100ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2，4-D貯存液2. Oml
脯氨酸0. 5g
CH0. 6g
蔗糖30g
Phytagel3g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。


3)預(yù)培養(yǎng)基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X)
12. 5ml
1.25ml 2. 5ml
2.5ml
2，4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉(Agarose)
0. 75ml 0. 15g 5g
1.75g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。 使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入
培養(yǎng)皿中(25ml/皿)
4)共培養(yǎng)基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X)
12. 5ml
1.25ml 2. 5ml
2.5ml
2，4-D貯存液 CH 蔗糖 瓊脂粉
0. 75ml 0. 2g 5g
1.75g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。 使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入
培養(yǎng)皿中(25ml/皿)
5)懸浮培養(yǎng)基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液 CH 蔗糖
5ml 0. 5ml 0. 5ml Iml 0. 2ml 0. 08g 2g
加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶中，封口滅菌。 使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μ 1 AS貯存液。 6)選擇培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25ml
N6mix 母液(100X)2. 5ml
1413/14 頁MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10) LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2. 5g酵母粉1. 25g氯化鈉2. 5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后20_25°C保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
一種調(diào)控水稻株型的方法，其特征在于，利用特異表達基因OsTB1的啟動子調(diào)控水稻osa miR156e基因的表達模式，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，實現(xiàn)控制水稻株型的目的，所述啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，所述osa miR156e基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種利用分子設(shè)計調(diào)控水稻株型的方法，本發(fā)明的特征是，通過特異性表達基因OsTB1的啟動子調(diào)控水稻osa-miR156e基因，或其基因家族的其它同源基因osa-miR156a-osa-miR156l的表達模式達到調(diào)控水稻株型的目的。本發(fā)明所述的啟動子的DNA序列如SEQ ID NO1所述。osa-miR156e基因的DNA序列如SEQ ID NO2所述。本發(fā)明采用分子設(shè)計育種的方法調(diào)控水稻株型，有望在水稻株型育種中應(yīng)用，塑造理想株型，提高水稻產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/113GK101928726SQ20101023420
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者吳昌銀, 張啟發(fā), 陳志輝 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學