一種與小麥千粒重相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與小麥千粒重相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明通過對小麥自然變異群體中6-SFT基因的遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)SNP，分別對應(yīng)于序列表序列1自5’末端第1371和第2450位，這兩個(gè)SNP存在三種單體型：單體型甲（G、G）、單體型乙（G、A）、單體型丙（A、G）。通過關(guān)聯(lián)分析證明，這三種單體型的純合類型中，千粒重大小為：單體型丙純合的小麥>單體型甲純合的小麥>單體型乙純合的小麥。本發(fā)明還提供了檢測所述兩個(gè)SNP的CAPS標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)證明，通過檢測所述兩個(gè)SNP，即可找到千粒重相對較高的小麥。本發(fā)明為小麥的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了一個(gè)新方法，在培育高產(chǎn)小麥品種或研究中具有重要意義。
【專利說明】一種與小麥千粒重相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與小麥千粒重相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界上小麥生產(chǎn)和消費(fèi)的第一大國，小麥生產(chǎn)與國家糧食安全密切相關(guān)。 干旱一直是影響小麥生產(chǎn)的最主要非生物脅迫因素。果聚糖不僅是一種重要的儲(chǔ)藏性可溶 性碳水化合物，籽粒灌漿的重要碳源，也是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)果聚糖的積累可 提高其抗旱、耐寒能力。因此，研究和利用小麥果聚糖合成酶（Sucrose:fructan6-fructosy ltransferase，6-SFT)基因?qū)τ诟弋a(chǎn)、抗旱的遺傳改良具有重要意義。小麥6-SFT是果聚糖 合成過程中的關(guān)鍵酶之一，有兩種功能，一是直接以蔗糖為底物，催化蔗糖分子上的果糖基 轉(zhuǎn)移到另一個(gè)蔗糖分子果糖基的C6位上，合成6-蔗果三糖，二是以寡果聚糖為底物，生成 分支型果聚糖。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，重要基因的功能不斷被揭示，在作物遺傳改 良中高效利用這些基因已成為基因發(fā)掘的重要目標(biāo)。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)為提高目標(biāo)性 狀選擇效率，改良作物提供了一條新的有效途徑?；诨蛐蛄虚_發(fā)的功能分子標(biāo)記直接 標(biāo)記基因本身，能夠高效選擇目標(biāo)基因，因此受到相關(guān)研究者的高度關(guān)注。然而迄今為止， 尚未開發(fā)出小麥6-SFT基因的分子標(biāo)記，并分析標(biāo)記與產(chǎn)量性狀的關(guān)系。
[0003] CAPS技術(shù)又稱為PCR-RFLP，是利用己知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特異性的 PCR引物（19一27bp)，然后用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一DNA片段，接著用一種專一性的 限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。GAPS標(biāo) 記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn) 是避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制 性內(nèi)切酶均可與擴(kuò)增DNA酶切，所以檢測到多態(tài)性機(jī)會(huì)較大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與小麥千粒重相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供一種利用小麥多態(tài)性位點(diǎn)鑒定或輔助鑒定小麥基因型的方法，所述多 態(tài)性位點(diǎn)為X和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，所述X和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別對 應(yīng)于小麥基因組DNA中序列表序列1自5'末端第1371位和第2450位；
[0006] 所述x和y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)依次為下述I)、II)和m)的情況時(shí)相對應(yīng) 的基因型為A、B和C:
[0007] I)G/G和G/G;
[0008] II)G/G和A/A;
[0009] IIDA/A和G/G。
[0010] 所述"/"前為一條同源染色體上的情況，所述"/"后為另一條同源染色體上的情 況。
[0011] 所述獲得基因型A、B和C的方法包括對待測小麥的基因組DNA中任意一段包括所 述2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)X和Y在內(nèi)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行酶切鑒定的步驟。
[0012] 所述PCR擴(kuò)增的靶序列為序列表序列1自5'末端第1 一2663bp。
[0013]所述PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對為序列表序列2所示的單鏈DNA和序列表序列 3所示的單鏈DNA。
[0014] 所述酶切鑒定包括如下步驟：將PCR產(chǎn)物分別用MboII和Bsgl酶切，獲得酶切產(chǎn) 物M和酶切產(chǎn)物B;
[0015]若所述酶切產(chǎn)物M為 762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和 155bp的DNA片段，則 所述待測小麥在所述X位點(diǎn)為G/G，即G純合；
[0016] 若所述酶切產(chǎn)物M為1137&口、681&口、465&口、225&口和155&口的0嫩片段，則所述待 測小麥在所述X位點(diǎn)為A/A，即A純合；
[0017] 若所述酶切產(chǎn)物B為1955bp、510bp和198bp的DNA片段，則所述待測小麥在所述 Y位點(diǎn)為G/G，即G純合；
[0018] 若所述酶切產(chǎn)物B為1955bp和708bp的DNA片段，則將所述待測小麥候選為在所 述Y位點(diǎn)為A/A,即A純合。
[0019] 上述任一所述方法可用于鑒定或輔助鑒定小麥千粒重性狀；
[0020] 被確定為基因型為C的待測小麥，其千粒重高于被確定為基因型為A和B的待測 小麥；被確定為基因型為A的待測小麥，其千粒重高于被確定為基因型為B的待測小麥。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)擴(kuò)增如下DNA片段的PCR引物對：小麥基因組DNA上的任意一段包 括所述X和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。
[0022] 所述PCR引物對為序列表序列2所示的單鏈DNA和序列表序列3所示的單鏈DNA。
[0023] 本發(fā)明還提供一種鑒別或輔助鑒別小麥千粒重性狀的試劑或試劑盒，包括序列表 序列2所示的單鏈DNA、序列表序列3所示的單鏈DNA、和限制性內(nèi)切酶MboII和Bsgl。
[0024] 本發(fā)明通過對小麥自然變異群體中6-SFT基因的遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)SNP， 分別對應(yīng)于序列表序列1自5'末端第1371位和第2450位，這兩個(gè)SNP存在三種單體型： 單體型甲（G、G)、單體型乙（G、A)、單體型丙（A、G)。通過關(guān)聯(lián)分析證明，這三種單體型的純 合類型中，千粒重大小為：單體型丙純合的小麥〉單體型甲純合的小麥〉單體型乙純合的小 麥。本發(fā)明還提供了檢測所述兩個(gè)SNP的CAPS標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)證明，通過檢測所述兩個(gè)SNP， 即可找到千粒重相對較高的小麥。本發(fā)明為小麥的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了一個(gè)新方 法，在培育高產(chǎn)小麥品種或研究中具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為根據(jù)本發(fā)明兩個(gè)SNP開發(fā)CAPS標(biāo)記酶切產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。其中，泳道M為 分子量標(biāo)準(zhǔn)，左圖從上至下的片段大小依次為1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、 500bp、400bp、300bp、200bp、100bp;右圖從上至下的片段大小依次為 4500bp、3000bp、 2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp。左圖為用MboII對不同小麥的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切的 帶型；右圖為用BsgI對不同小麥的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切的帶型；左圖中的泳道G含有六條從 上至下大小依次為762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的條帶，泳道A含有五條從 上至下大小依次為1137bp、681bp、465bp、225bp和155bp的條帶；右圖中的泳道G含有三條 從上至下大小依次為1955bp、510bp和198bp的條帶，泳道A含有兩條從上至下大小依次為 1955bp和708bp的條帶。
[0026] 圖2為DH群體(旱選10號X魯麥14)中CAPS標(biāo)記酶切產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。其中， 泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下的片段大小依次為1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp;泳道H為旱選 10 號；泳道L為魯麥 14 ;泳道 1-150分別為DH群體中的150個(gè)株系。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 下述實(shí)施例中所用的小麥材料均來自國家作物種質(zhì)庫（http://icscaas.com.cn/ jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息見中國作物種質(zhì)信息網(wǎng)，網(wǎng)址：http://icgr.caas. net.cn〇
[0030]實(shí)施例1、與小麥千粒重相關(guān)的2個(gè)SNP及其PCR-RFLP多態(tài)性檢測
[0031] 1、擴(kuò)增含小麥2個(gè)SNP的基因組DNA片段的特異引物及序列分析
[0032] 在小麥基因組上的基因6-SFT(Genbank號為FJ228688)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP，分別對 應(yīng)于序列表序列1自5'末端的第1371位(命名為X位點(diǎn)，存在G和A的多態(tài)性)，和序列表 序列1自5'末端的第2450位(命名為Y位點(diǎn)，存在G和A的多態(tài)性);這兩個(gè)位點(diǎn)X和Y在 小麥自然變異群體中存在三種單體型：
[0033] 單體型甲：G、G;
[0034] 單體型乙：G、A;
[0035] 單體型丙：A、G;
[0036] 根據(jù)小麥不同基因組的序列差異，設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增包含這2個(gè)SNP位點(diǎn) 在內(nèi)的DNA片段：

【權(quán)利要求】
1. 一種利用小麥多態(tài)性位點(diǎn)鑒定或輔助鑒定小麥基因型的方法，所述多態(tài)性位點(diǎn)為X 和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，所述X和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別對應(yīng)于小麥基因 組DNA中序列表序列1自5'末端第1371位和第2450位； 所述X和Y兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)依次為下述I )、II )和III)的情況時(shí)相對應(yīng)的基 因型為A、B和C : I ) G/G 和 G/G ; II ) G/G 和 A/A ; III) A/A 和 G/G。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述獲得基因型A、B和C的方法包括對 待測小麥的基因組DNA中任意一段包括所述2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)X和Y在內(nèi)的DNA片 段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定的步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的靶序列為序列表序列1自 5' 末端第 1 一2663bp。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對為序 列表序列2所示的單鏈DNA和序列表序列3所示的單鏈DNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述酶切鑒定包括如下步驟：將PCR產(chǎn)物 分別用MboII和Bsgl酶切，獲得酶切產(chǎn)物M和酶切產(chǎn)物B ; 若所述酶切產(chǎn)物M為762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的DNA片段，則所述 待測小麥在所述X位點(diǎn)為G/G ; 若所述酶切產(chǎn)物M為1137&?、681&?、465&?、225&?和155&?的0嫩片段，則所述待測小 麥在所述X位點(diǎn)為A/A ; 若所述酶切產(chǎn)物B為1955bp、510bp和198bp的DNA片段，則所述待測小麥在所述Y位 點(diǎn)為G/G ; 若所述酶切產(chǎn)物B為1955bp和708bp的DNA片段，則將所述待測小麥候選為在所述Y 位點(diǎn)為A/A。
6. 權(quán)利要求1一5中任一所述方法在鑒定或輔助鑒定小麥千粒重性狀中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于： 被確定為基因型為C的待測小麥，其千粒重高于被確定為基因型為A和B的待測小麥； 被確定為基因型為A的待測小麥，其千粒重商于被確定為基因型為B的待測小麥。
8. 擴(kuò)增如下DNA片段的PCR引物對：小麥基因組DNA上的任意一段包括所述X和Y兩 個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCR引物對，其特征在于：所述PCR引物對為序列表序列2所 示的單鏈DNA和序列表序列3所示的單鏈DNA。
10. -種鑒別或輔助鑒別小麥千粒重性狀的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或 試劑盒包括序列表序列2所示的單鏈DNA、序列表序列3所示的單鏈DNA、和限制性內(nèi)切酶 MboII 和 Bsgl。
【文檔編號】C12N15/11GK104342484SQ201310311234
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】景蕊蓮, 岳愛琴, 李昂, 毛新國, 昌小平 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所