與水牛泌乳相關(guān)基因insig2及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用
【專利說明】與水牛泌乳相關(guān)基因 I NS IG2及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種動物分子標(biāo)記領(lǐng)域。具體涉及與水牛泌乳相 關(guān)基因 INSIG2及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 水牛是我國南方特有的種畜資源，而較低的產(chǎn)奶量和繁殖性能已成為了影響其產(chǎn) 業(yè)發(fā)展的兩大科學(xué)問題。顯然，利用先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)良奶水牛種質(zhì)資源的選 育將會有效的提高選種效率。
[0003] 產(chǎn)奶性狀是奶水牛的一個重要經(jīng)濟(jì)性狀，由多種微效基因決定，是一種典型的由 多基因控制的數(shù)量性狀。克隆奶水牛泌乳性能相關(guān)基因并探討其遺傳特性，以提高奶水牛 生產(chǎn)性能，為選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的奶水牛品種提供技術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0004] 胰島素誘導(dǎo)基因 （Insulin Induced Gene，INSIG)在哺乳動物體內(nèi)存在2種亞型， 分別為INSIG1和INSIG2,是近年來發(fā)現(xiàn)的與脂肪代謝相關(guān)的新基因之一，在脂肪細(xì)胞分化 和脂肪代謝的過程中發(fā)揮重要的作用。它們的主要功能是調(diào)控脂肪代謝，在細(xì)胞內(nèi)固醇的 參與下，影響固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP)活化，對脂肪的形成具有重要作用。到目前為 止，張衡等（2009)發(fā)現(xiàn)INSIG2基因的多態(tài)性與青少年肥胖及代謝異常相關(guān)。蔣明等（2015) 證實(shí)了豬的INSIG2基因的多態(tài)性對肉質(zhì)性狀的影響具有顯著關(guān)聯(lián)性。劉等(2012)闡明了秦 川牛INSIG2基因存在與其屠宰性狀顯著相關(guān)的4個SNP位點(diǎn)。Rincon等(2012)報道了荷斯坦 奶牛INSIG2基因 SS252452236位點(diǎn)等位基因 C與飽和脂肪的下降以及多聚不飽和脂肪酸的 上升相關(guān)。顯然，根據(jù)INSIG2基因功能，該基因可作為影響水牛產(chǎn)奶性狀的候選基因，用于 分子標(biāo)記的開發(fā)和利用，為建立分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。而且，迄今為止，尚無有 關(guān)水牛INSIG2基因作為水牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記研究報道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述存在的問題，提供與水牛泌乳相關(guān)基因 INSIG2 及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，以提高奶水牛產(chǎn)奶量生產(chǎn)性能，為選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的 奶水牛品種提供技術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了與水牛泌乳相關(guān)基因 INSIG2及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，所述的分子 標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ NO: 1所示，其中在SEQ NO: 1的第1258bp、1350bp、12529bp、 12670bp處分別有412586^1350(：、6125294、(：126701'單堿基突變，其引物對的0嫩序列如下 所示：
[0008] (i)A1258G;A1350C，獲得這兩個位點(diǎn)的引物序列為：
[0009] 正向引物SEQ NO: 2:5 '-TCCCTGGACAGTGGAAGAGT-3' ；
[0010] 反向引物SEQ N0:3:5'-GATTCATGGGCTACGGACACT-3'；
[0011] ( ? )G12529A;C12670T，獲得這兩個位點(diǎn)的引物序列為：
[0012] 正向引物SEQ NO: 4:5' -CCGCTGAACACTCTGCCTTA-3' ；
[0013] 方向引物SEQ N0:5:5'-CTCTTCCCCTCCTTTGCCTG-3'。
[0014] 所述的分子標(biāo)記為水牛產(chǎn)奶性狀的遺傳標(biāo)記，且與水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的INSIG2基 因上的分子標(biāo)記是通過PCR-DNA測序與飛行時間質(zhì)譜法檢測完成，而所述的應(yīng)用為奶水牛 的早期選育。
[0015] 本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀I(lǐng)NSIG2基因1258匕口、135(^口、1252%口、1267(^口處5即位點(diǎn)的 獲取方法，包括如下步驟：
[0016] (1)待測水?；蚪MDNA提??；
[0017] (2)目的片段擴(kuò)增及測序：隨機(jī)50頭水?；蚪MDNA進(jìn)行混池，以作為PCR反應(yīng)模 板，利用引物對SEQN0:2和SEQN0:3以及SEQN0:4和SEQN0 :5分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用DNAStar 7. OSeqman生物信息分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對，獲取候 選的INSIG2基因 SNP位點(diǎn)；
[0018] (3)基因分型：針對360頭水牛基因組DNA樣本，利用飛行時間質(zhì)譜法進(jìn)行候選SNP 位點(diǎn)的分型，根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本位點(diǎn)的基因型；
[0019] (4)關(guān)聯(lián)分析:利用SAS軟件GLM程序?qū)λ€體的SNP分型結(jié)果以及產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)進(jìn) 行數(shù)據(jù)分析，獲得與水牛產(chǎn)奶量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0020] 本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀基因 INSIG2作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，具體步驟如下：
[0021] (I)對待選育水牛進(jìn)行靜脈采取提取DNA樣本；
[0022] (Π )針對針對核苷酸序列SEQ ID N0:1中 1258bp、1350bp、12529bp、12670bp處的 SNP位點(diǎn)，利用飛行時間質(zhì)譜儀檢測上述步驟(3)中所述的DNA并對樣本進(jìn)行基因分型，利用 Typer4.0軟件檢測質(zhì)譜峰并判讀各樣本位點(diǎn)基因型。
[0023] (iii)應(yīng)用 INSIG2 中的 A1258G-AA、A1350C-AA、G12529A-GG 及 C12670T-CC 的基因型 進(jìn)行判定和選育高產(chǎn)摩拉水牛；而基于A1258G-GG、A1350C-CC、G12529A-AA及C12670T-TT的 基因型進(jìn)行判定和選育高產(chǎn)雜交奶水牛。
[0024] 綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
[0025]( - )提供一種與水牛泌乳相關(guān)基因 INSIG2,并將其作為分子標(biāo)記予以應(yīng)用；
[0026] (二)提高奶水牛產(chǎn)奶量生產(chǎn)性能，為選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的奶水牛品種提供 技術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0027] 對本發(fā)明更詳細(xì)描述可參見實(shí)例部分。 【【附圖說明】】
[0028] 圖1 一SNP1258分型結(jié)果展示。
[0029] 圖2-SNP1350分型結(jié)果展示。
[0030] 圖3-SNP12529分型結(jié)果展示。
[0031] 圖4一 SNP12670分型結(jié)果展示。 【【具體實(shí)施方式】】
[0032] 實(shí)施例1:水?；蚪M總DNA的制備
[0033] 采用血液基因組DNA提取試劑盒制備水?；蚪M總DNA(天根，北京），具體操作步 驟如下：
[0034] (1)取全血500yL置于1.5mL離心管，加入等體積的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻， 12000rpm離心lmin，吸取上清，留下沉淀;加入等體積的細(xì)胞裂解液CL，重復(fù)此步驟一次;加 入4yL RNAase(100mg/mL)，振蕩 15sec，室溫靜置5min;
[0035] (2)加入20yL Proteinase K溶液，混勻，加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C 放置lOmin，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮；
[0036] (3)加入200yL無水乙醇，充分顛倒混勻;此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；
[0037] (4)將上述所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管 中），12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0038] (5)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液GD，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0039] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復(fù)此操作一次；
[0040] (7)12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干 吸附材料中殘余的漂洗液；
[0041 ] (8)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200yL洗脫 緩沖液TB，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中；
[0042] (9)存放于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0043]實(shí)施例2:水牛產(chǎn)奶性狀I(lǐng)NSIG2基因分子標(biāo)記的獲取
[0044] 1、引物設(shè)計：以SEQ NO: 1為模板，利用Primer5.0引物設(shè)計軟件，經(jīng)01 igo軟件檢 測，確定用于擴(kuò)增水牛INSIG2基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成，其 中用于擴(kuò)增所述基因的正反向引物的DNA序列如SEQ ID N0:2-5所示。
[0045] 2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0046]隨機(jī)選擇50頭水?；蚪MDNA樣本進(jìn)行混池，以作為PCR反應(yīng)的模板。
[0047] (l)PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體積為40yL，其中水牛DNA混合池模板lyL，10X LA Taq Mix 20yL，引物混合物（10mM each)2yL和ddH20 17yL〇
[0048] (2)PCR反應(yīng)程序：94°C/3min; 94°C/30sec，60°C/30sec，72°C/1 · 5min，30個循環(huán)； 72°C10min;4°C 保存
[0049] 3、PCR產(chǎn)物測序、分析及分子標(biāo)記初篩
[0050] 將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大科技有限公司測序。利用NCBI (http:// WWW.ncbi .nlm.nih. gov/)網(wǎng)站的BLAST工具對測序結(jié)果進(jìn)行分析，判定結(jié)果的真實(shí)性，并利 用DNAStar 7.0