專利名稱：基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)的測(cè)定小麥種子活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種子活力的測(cè)定方法，具體地說(shuō)，涉及一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)的測(cè)定小麥種子活力的方法。
背景技術(shù)：
種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，1980年AOSA定義了種子活力廣泛的田間條件下，決定種子迅速整齊出苗和成長(zhǎng)為幼苗的潛在能力的總稱。ISTA將大豆種子加速老化試驗(yàn)和豌豆種子浸出液電導(dǎo)率的標(biāo)準(zhǔn)化流程列為國(guó)際種子活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)今的種子活力檢測(cè)方法包括生理測(cè)定法、加速老化法、電導(dǎo)率測(cè)定法，生化測(cè)定法等。微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)是一種在不破壞被測(cè)試材料的前提下獲得測(cè)試材料膜內(nèi)外離子或分子流動(dòng)信息的一項(xiàng)新技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)可以對(duì)測(cè)試材料的不同部位以及同一部位連續(xù)時(shí)間測(cè)量，已經(jīng)在植物抗鹽研究、植物病理研究、植物耐重金屬等多種植物研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。aiabala(2000)利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)研究了小麥種子萌發(fā)期間的營(yíng)養(yǎng)吸收，發(fā)現(xiàn)了 K+在小麥種子的不同部位都處于外流狀態(tài)，證實(shí)了 K+的外是由于細(xì)胞膜上K+ 通道作用的結(jié)果，而非種皮滲出(Shabala，S. ；Newman, I. ；Wilson, S. ；Clark, R. Nutrient uptake patternsover the surface of germinating wheat seeds (小麥種子萌發(fā)表面的離子吸收?qǐng)D譜)，Australian Journal of Plant Physiology，2000，27 O)，89-97)，為小麥萌發(fā)生理生化機(jī)理研究拓展了新視野，另外在植物抗鹽性研究，抗重金屬脅迫研究領(lǐng)域該方法也發(fā)揮了重要作用。張輝等(1996)利用電導(dǎo)率測(cè)定法測(cè)定水稻種子活力(張輝，王輝憲，水稻種子浸泡液外滲離子與種子發(fā)芽率的相關(guān)性研究，吉首大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17 (2) :80-83)，杜清福等Q007)用到了標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽法、電導(dǎo)率測(cè)定法、TTC定量法、丙二醛含量測(cè)定法測(cè)定玉米種子活力(杜清福等，不同類型玉米種子活力檢測(cè)適宜方法的研究，玉米科學(xué)，2007，15 (6) 122-127)?，F(xiàn)有的種子活力測(cè)定方法，如生理測(cè)定法、加速老化法、電導(dǎo)率測(cè)定法、生化測(cè)定法都對(duì)種子構(gòu)成了嚴(yán)重的損傷，甚至是破壞了種子結(jié)構(gòu)，使其完全失去發(fā)芽能力，這些種子活力測(cè)定方法對(duì)珍貴的小麥種子、數(shù)量少的小麥種子來(lái)說(shuō)損失相當(dāng)大，而且且無(wú)法實(shí)現(xiàn)種子活力的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。因此，找到一種無(wú)損的、快速的、檢測(cè)后的材料還能繼續(xù)生長(zhǎng)的小麥種子活力檢測(cè)方法成為亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為小麥育種、小麥種子儲(chǔ)藏、作物田間生產(chǎn)提供一種無(wú)損的、快速的、 檢測(cè)后的生物材料還能繼續(xù)生長(zhǎng)的小麥種子活力檢測(cè)新方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)測(cè)定小麥種子活力的方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)對(duì)連續(xù)發(fā)芽期的小麥種子做動(dòng)態(tài)K+流檢測(cè)，根據(jù)小麥種子的凈K+流速及方向來(lái)測(cè)定種子活力。其中，所述小麥種子萌發(fā)后長(zhǎng)出胚根。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)小麥種子活力的無(wú)損、活體、快速檢測(cè)，檢測(cè)一個(gè)樣本耗時(shí)少至幾分鐘多至十幾分鐘，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，耗時(shí)短，活力強(qiáng)的小麥種子K+外流作用弱；而活力弱的小麥種子K+外流作用強(qiáng)，呈現(xiàn)流失狀態(tài)，評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單可靠。前述的方法，所述微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)中測(cè)試緩沖液中的測(cè)試離子濃度為 0. 05 0. 15mM。前述的方法，檢測(cè)使用的水稻處于1葉1心期，測(cè)量位置為距所述水稻苗根尖 100 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面10 40 μ m處。具體地，前述方法包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1 1. 5cm,再將電極的前端吸入相應(yīng)測(cè)試離子交換劑；( 將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測(cè)水稻苗，將其根部先放在測(cè)試緩沖液中平衡30min左右，再用校正后的電極對(duì)待測(cè)水稻苗進(jìn)行檢測(cè)10 16min ； (4)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理和分析。其中，步驟(1)所述的灌充液為80 140mM KCl。步驟(2)所述的校正液為0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl。步驟(3)所述的測(cè)試緩沖液為0.05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mMCaCl2、0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCU 0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES。前述方法中步驟(1)電極的前端吸入測(cè)試離子交換劑的長(zhǎng)度為K+ :100 200μπι。前述方法中校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為K+ 56 60mV。前述方法中所述K+離子流的流速為萌發(fā)32 40小時(shí)K+離子內(nèi)流速度為-4. 76 -274. 99pmol. cnT2. s-1。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)小麥種子活力的無(wú)損、活體、快速檢測(cè)，檢測(cè)一個(gè)樣本耗時(shí)少至幾分鐘多至十幾分鐘，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，耗時(shí)短，活力強(qiáng)的小麥種子K+外流作用弱；而活力弱的小麥種子K+外流作用強(qiáng)，呈現(xiàn)流失狀態(tài)，評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單可靠。本發(fā)明是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)芽期的小麥胚根部位的K+流， 比較活力強(qiáng)的和活力弱的小麥種子對(duì)K+保持能力來(lái)判斷小麥種子的活力，為小麥育種、小麥種子儲(chǔ)藏、作物田間生產(chǎn)提供了一種無(wú)損的、快速的、檢測(cè)后的生物材料還能繼續(xù)生長(zhǎng)的小麥種子活力檢測(cè)新方法。


圖1為本發(fā)明基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)測(cè)定小麥種子活力的實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖。圖2為不同活力的小麥種子萌發(fā)期間K+流動(dòng)態(tài)變化。圖3為不同活力的小麥種子凈K+流速。圖4所示為利用微電極檢測(cè)時(shí)，電極距離根尖的位置。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。其中，小麥種子選用中國(guó)春(Triticum aestivum)，購(gòu)自國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心。
實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件小麥種子選用中國(guó)春(Triticum aestivum)為試驗(yàn)材料， 液體培養(yǎng)基參照Hogland營(yíng)養(yǎng)液配方，挑選外型均一、飽滿的小麥種子，自來(lái)水清洗后用 75 %乙醇浸泡30秒，然后蒸餾水清洗3-4次，3 %次氯酸鈉浸泡10分鐘，后用蒸餾水清洗 3-4次，將小麥種子播種于底墊雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，濾紙要充分潤(rùn)濕，封蓋，置于25士 1°C 的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，每4小時(shí)測(cè)一次離子流，每次10-15min。2.實(shí)驗(yàn)儀器及耗材離子流檢測(cè)用非損傷微測(cè)系統(tǒng)(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 系統(tǒng)軟件imFlux，微電極采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3.實(shí)驗(yàn)試劑及溶液(1)液態(tài)離子交換劑包括K+ ^-^ Potassium ionophore I—cocktail A ；Sigma-Aldrich,Louis,M0 63103, USA ；(2)測(cè)試緩沖液成分K+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)電極灌充液(這個(gè)是固定的濃度，改變后會(huì)有影響)K+ IOOmM KCl(4)校正液K+ 離子0. ImM 和 ImM KCl4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。從電極末端灌入Icm左右的相應(yīng)測(cè)試離子的灌充液至電極尖端充滿，前端吸入適當(dāng)長(zhǎng)度180-200 μ m的離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應(yīng)的校正液中校正，能斯特(Nerst)方程計(jì)算理想值是27-30mV。測(cè)試前材料在相應(yīng)的測(cè)試液中平衡30-50min。然后在距離小麥種子胚根區(qū)表面 30 μ m的地方振動(dòng)檢測(cè)(圖4)，每個(gè)樣品檢測(cè)10-15min。5.數(shù)據(jù)處理離子流處理基于Fick擴(kuò)散定律，并通過(guò)在線軟件MageFluX-3D Ion Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)計(jì)算得出。由大于 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，利用EXcel2003分析作圖。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果(圖2和圖幻表明在小麥種子沒(méi)有長(zhǎng)出根之前，K+ 一直處于外流狀態(tài)，在小麥種子吸收水分4小時(shí)后，小麥種子K+開始外流，活力弱的小麥種子K+外流明顯，而活力強(qiáng)的小麥種子K+外流幅度偏低；當(dāng)小麥種子吸收水分到8小時(shí)后活力弱的小麥種子外流幅度達(dá)到最終大值，活力強(qiáng)的小麥種子也達(dá)到最大值，隨后K+外流幅度都開始變小，但是活力強(qiáng)的小麥種子K+—直外流幅度都較活力弱的小麥種子小，36小時(shí)后活力強(qiáng)的小麥種子先長(zhǎng)出根尖，開始主動(dòng)吸收K+，而活力弱的小麥離子流還處于低水平的外流狀態(tài)，活力強(qiáng)的小麥種子其K+外流作用小，而活力弱的小麥種子其K+外流作用很大，說(shuō)明了活力強(qiáng)的小麥種子細(xì)胞膜功能在萌發(fā)初期就恢復(fù)的很快，而活力弱的小麥種子細(xì)胞膜功能恢復(fù)慢，造成大量K+ 滲漏，營(yíng)養(yǎng)流失，最終表現(xiàn)了弱的小麥種子活力。因此，通過(guò)表1可以看出不同時(shí)間點(diǎn)的離子流結(jié)果都可以作為判斷小麥種子活力強(qiáng)弱的依據(jù)，尤其是在4hjh和12h，活力弱的小麥種子K+流失較活力強(qiáng)的小麥種子大很多，因此可以通過(guò)這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為種子萌發(fā)活力強(qiáng)弱的早期判斷；在40h時(shí)間點(diǎn)上活力強(qiáng)的小麥種子已經(jīng)生根，且K+開始內(nèi)流，活力弱的小麥種子K+仍然處于外流狀態(tài)，此時(shí)間點(diǎn)也可以作為判斷依據(jù)。表1不同時(shí)間點(diǎn)活力不同的小麥種子K+凈流速
4h8h12h16h20h24h28h32h36h40h活力強(qiáng)995.583703.422203.111098.52803.11568.1478.46-4.76-27.92-274.99活力弱1471.967135.756823.804667.442771.151679.641038.18733.44625.97444.81注數(shù)據(jù)單位為pmol/cm2 · sK+作為主要的營(yíng)養(yǎng)離子，也起到滲透調(diào)節(jié)作用，有關(guān)這方面的報(bào)道不多，小麥種子在成熟過(guò)程中累積了大量的K+，這些K+作為小麥種子萌發(fā)的主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在滲透調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，本方法通過(guò)檢測(cè)活力強(qiáng)的小麥種子和活力弱的小麥種子發(fā)現(xiàn)了前者具有很強(qiáng)的K+保持能力，而后者K+大量滲漏，造成營(yíng)養(yǎng)流失，根本原因是細(xì)胞膜活力的下降，因此，通過(guò)K+流測(cè)量方法判斷小麥種子活力是一種直接而有效的方法。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)測(cè)定小麥種子活力的方法，其特征在于，利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)對(duì)連續(xù)發(fā)芽期的小麥種子做動(dòng)態(tài)K+流檢測(cè)，根據(jù)小麥種子的凈K+流速及方向來(lái)測(cè)定種子活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述小麥種子萌發(fā)后長(zhǎng)出胚根。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)中測(cè)試緩沖液中的測(cè)試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，檢測(cè)使用的水稻處于1葉1心期，測(cè)量位置為距所述水稻苗根尖100 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面10 40 μ m處。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1 1.5cm，再將電極的前端吸入相應(yīng)測(cè)試離子交換劑；(2)將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測(cè)水稻苗，將其根部先放在測(cè)試緩沖液中平衡30min，再用校正后的電極對(duì)待測(cè)水稻苗進(jìn)行檢測(cè)10 16min ；(4)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理和分析；其中，步驟⑴所述的灌充液為80 140mM KCl ；步驟(2)所述的校正液為0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；步驟(3)所述的測(cè)試緩沖液為0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mMCaCl2、0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCU 0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)電極的前端吸入測(cè)試離子交換劑的長(zhǎng)度為K+ 100 200 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為 K+ 56 60mVo
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為萌發(fā)32 40小時(shí)K+離子內(nèi)流速度為-4. 76 -274. 99pmol. cnT2· s人
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)的測(cè)定小麥種子活力的方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)對(duì)連續(xù)發(fā)芽期的小麥種子做動(dòng)態(tài)K+流檢測(cè)，根據(jù)小麥種子的凈K+流速及方向來(lái)測(cè)定種子活力。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)小麥種子活力的無(wú)損、活體、快速檢測(cè)，檢測(cè)一個(gè)樣本耗時(shí)少至幾分鐘多至十幾分鐘，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，耗時(shí)短，活力強(qiáng)的小麥種子K+外流作用弱；而活力弱的小麥種子K+外流作用強(qiáng)，呈現(xiàn)流失狀態(tài)，評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單可靠，為小麥育種、小麥種子儲(chǔ)藏、作物田間生產(chǎn)提供了一種無(wú)損的、快速的、檢測(cè)后的生物材料還能繼續(xù)生長(zhǎng)的小麥種子活力檢測(cè)新方法。
文檔編號(hào)A01C1/02GK102511220SQ20111036401
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者于春花, 侯佩臣, 侯瑞鋒, 姜富斌, 王曉冬, 陳泉 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心