一種含有重組膠原蛋白多肽的植物油體護膚乳液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有重組膠原蛋白多肽的植物油體護膚乳液，更具體的說本發(fā)明涉及的乳液新配方，包括水相成分，乳化劑為羧乙基纖維素，以紅花油體作為基質(zhì)的油相成分，功效成分為含Col的擬南芥油體，偶合劑PEG600，防腐劑尼泊金甲酯和丙酯，香精為藏紅花香精，本發(fā)明通過乳化技術(shù)，將含有Col的擬南芥油體和紅花油體基質(zhì)均勻的分布在乳液中，由于植物油體比表面積相對較大，乳液更容易被皮膚所吸收，可以在皮膚表面形成一層透氣保護膜另外，植物油體可以作為天然的乳化劑，使Col分配在油體中，使其更容易被皮膚吸收，有效地延緩或抑制皮膚的衰老和恢復或修復皮膚創(chuàng)傷。
【專利說明】一種含有重組膠原蛋白多肽的植物油體護膚乳液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化妝品制造【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種重組膠原蛋白多肽的植物油體 的護膚乳液。

【背景技術(shù)】
[0002] 膠原是生物體內(nèi)一種纖維蛋白，主要存在于皮膚、骨、軟骨及肌腱等組織中，占人 體或其他動物體總蛋白含量的25%?33%。膠原蛋白因其優(yōu)良的生物學特性而廣泛地應 用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。因此，如何進行高純度、高產(chǎn)率的具有生物活性的膠原的提取一直 是廣大研究者關(guān)注的課題。膠原蛋白的類型多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有26種，分布于皮膚、肌腱等組織 中，其中，皮膚中約85%的膠原蛋白屬于IV型，IV型膠原是含量最多研究最透徹的膠原， 占生物體膠原總量的90%左右。IV型膠原一般為白色、透明、無分支的原纖維，是由兩條相 同的a I(IV)鏈和一條a 2 (IV)鏈組成的異質(zhì)膠原（Heterotypic Collagen)。a I(IV)和 a 2 (IV)肽鏈的螺旋區(qū)含有338個（Gly-X-Y)重復序列，X常為脯氨酸，Y常為輕脯氨酸或 羥賴氨酸。因此，甘氨酸約占1/3,脯氨酸和羥脯氨酸占1/5以上，還有大量的羥賴氨酸和丙 氨酸。α鏈中吡咯環(huán)的存在使N-C鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，構(gòu)成左手螺旋，螺距為0. 87ηη，每轉(zhuǎn)一 圈約有3. 3個氨基酸殘基。三條α鏈依靠側(cè)鏈殘基相連，最小氨基酸甘氨酸殘基位于三股 螺旋內(nèi)側(cè)，螺距為96nm，每圈有36個氨基酸殘基，形成了原膠原（tropo collagen)分子特 有的三股螺旋結(jié)構(gòu)。
[0003] 膠原蛋白在很多方面都具有生物學功能，包括：（1)膠原蛋白能保護皮膚，提高皮 膚的彈性，膠原蛋白在調(diào)節(jié)表皮更新再生中發(fā)揮重要的作用，膠原蛋白可促進細胞粘附和 細胞增殖；(2)膠原蛋白具有止血性能；（3)膠原蛋白具有很低的免疫原性；(4)膠原蛋白 作為細胞生長的依附和支架物，能誘導上皮細胞等增殖、分化和移行；（5)膠原蛋白是細胞 外基質(zhì)的骨架，其特有的三螺旋結(jié)構(gòu)，使其不論作為形成新組織的骨架被吸收，還是被宿主 同化，都表現(xiàn)出良好的生物相容性。
[0004] 膠原蛋白結(jié)構(gòu)和功能特點的多樣性和復雜性，決定了其在許多領(lǐng)域的重要地位以 及良好的應用前景。
[0005] (一）在食品方面的應用
[0006] 膠原蛋白本身就可以作為一種食品，食用膠原蛋白一般來源于動物的真皮、肌腱 和骨膠原，其外觀通常為白色，口感柔和，味道清淡，易消化。但多數(shù)情況下膠原蛋白在食品 中會被用作功能物質(zhì)或營養(yǎng)成分。
[0007] (二）在化妝品方面的應用
[0008] 膠原蛋白具有保濕作用、修復皮膚、美白和潤澤頭發(fā)等作用，使膠原蛋白的這些美 容作用，已經(jīng)廣泛應用于化妝品中。
[0009] (三）在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用
[0010] 低免疫抗原性、生物相容性、止血作用和可生物降解性是膠原蛋白作為生物醫(yī)學 材料的優(yōu)勢所在。近年來，英美等國采用注射性膠原來整復面部軟組織的各種損傷。我國 研制的膠原注射劑已廣泛應用于美容界，在延緩皮膚衰老、重建受損肌膚等方面取得了良 好的效果，是一種理想的醫(yī)用材料。
[0011] (四）在造紙工業(yè)中的應用
[0012] 作為原料的應用：膠原纖維分子中含有大量的羧基、氨基、羥基，而纖維素中也含 有大量羥基和少量羧基，正是由于這兩種天然高分子中含有許多的活性基團和活性部位， 可通過化學或物理的方法制成復合材料，用于制造書面革、膜塑包裝材料、壁紙、生活用紙、 遮光紙、農(nóng)副產(chǎn)品包裝材料、生物膠原包裝紙、復合生物降解材料等。
[0013] 利用植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白，近年來越來越受到人們的關(guān)注，油體蛋白是 油體中主要的膜蛋白。油體蛋白是堿性的疏水蛋白，三個部分組成油體蛋白：親脂的C端和 N端，和中間疏水區(qū)域，它是通過磷脂膜進入到油體內(nèi)部。N端和C端則鑲嵌在油體表面，暴 露在細胞質(zhì)中。油體蛋白具有表面活性劑，使其不能與油體結(jié)合。油體的這種非結(jié)合性非常 適合用作乳化劑。乳化劑能降低互不相溶的液體間的界面張力，使之成為乳濁液。油體乳 化劑是從天然油料種子中提取出來的，油體蛋白的結(jié)構(gòu)以及它的特異性，使油體在生物技 術(shù)中得到廣泛的應用，例如它可以作為乳化劑，攜帶和固定重組蛋白等等。它還可以應用于 純化、重折疊和固定重組蛋白，在油體表面，目的蛋白與油體蛋白通常通過兩種方式結(jié)合， 分別是與油體蛋白融合在油體中表達和通過配體作為親和標簽與油體蛋白連接。本發(fā)明是 根據(jù)植物油體特性，使重組膠原蛋白多肽基因連接在油體蛋白基因的N端或C端，構(gòu)建融合 基因，使目的蛋白在植物油體中特異性表達，利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎后，經(jīng) 不同提取液抽提，回收油相，既可將融合蛋白與細胞內(nèi)的其他組份分開，簡化了分離純化步 驟，降低了純化成本與生產(chǎn)成本。
[0014] 近年來，生物基因工程技術(shù)長足發(fā)展并且影響到了生命科學的方方面面，同時也 給美容化妝品行業(yè)都帶來了全新的發(fā)展機遇，化妝品已經(jīng)從傳統(tǒng)的化學美容、植物美容向 生物美容與基因美容發(fā)展。例如，傳統(tǒng)的皮膚護理僅局限于油膜覆蓋與保持水分等物理方 法，而現(xiàn)在美容護膚理念開始轉(zhuǎn)向細胞水平的護理，因此含高親和力的生物因子物質(zhì)的化 妝品應運而生。如今，國際上越來越多的醫(yī)藥及生物工程技術(shù)專家投身于該研究領(lǐng)域，許多 國家也都瞄準生物化妝品這一巨大市場，開發(fā)生物美容產(chǎn)品。將以生物工程技術(shù)制得的生 長因子、透明質(zhì)酸和核酸等應用于化妝品，這一新的研究動態(tài)也使人們認識到生物化妝品 將給化妝品品質(zhì)帶來根本性的變化。
[0015] 生物化妝品是指應用生物工程技術(shù)及其制品制得的化妝品，其主要成分生物活性 多肽大部分是細胞生長因子，它們在體內(nèi)含量極微，但生物活性極高，對多種細胞生理功能 和代謝活動發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用，直接或間接地影響多種類型細胞的生長、分裂、分化、增殖 和遷移，在美容護膚、整形外科、燒傷潰瘍以及各種皮膚病的傷口修復與愈合中有重要作 用。膠原蛋白經(jīng)過穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)修飾或特殊的的保護處理后，以一定的有效濃度添加到化妝 品中，可以有效的與皮膚細胞發(fā)生作用，促進上皮細胞營養(yǎng)代謝，保護皮膚，預防由于各種 原因?qū)е碌钠つw損傷。正常護膚品種添加活性細胞生長因子還可以有效促進皮下膠原細 胞的功能，加速皮膚膠原細胞的生長，使細胞加速分泌膠原，從而達到抗皺及延緩衰老的作 用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明目的在于提供一種含有重組膠原蛋白多肽的植物油體護膚乳液，充分發(fā)揮 重組膠原蛋白多肽的油體透皮吸收作用。
[0017] 本發(fā)明提供的這種護膚乳液通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種含有重組膠原蛋 白多肽（Col)活性多肽的護膚乳液，由以下重量份的原料制成：油性原料20% (其中甘油 10 % )，乳化劑10 %，偶合劑3 %，防腐劑0. 25 %，香精2 %，營養(yǎng)添加劑8 %，維生素 C5 %其 余為去離子水。
[0018] 本發(fā)明制備一種含有重組膠原蛋白多肽（Col)護膚乳液的制備方法，包括以下步 驟進行制備：首先將植物油體提取出來，然后將水加入到油體中，混合均勻；然后逐級加入 甘油和乳化劑羧乙基纖維素，偶合劑PEG600,攪拌均勻，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳 化，在均質(zhì)機中乳化10_20min ;最后，攪拌均勻后再加入防腐劑尼泊金甲酯和尼泊金丙酯 的混合液和營養(yǎng)添加劑含有重組膠原蛋白多肽的植物油體和維生素 C以及藏紅花香精，攪 拌均勻后即成本發(fā)明品。
[0019] 本發(fā)明是利用鑲嵌于油體表面的油體蛋白與重組膠原蛋白多肽的融合表達產(chǎn)物 可直接作為活性成分用于護膚品的開發(fā)，簡化了生長因子與乳化劑（或保護劑）混合的加 工工藝，降低了生產(chǎn)成本。同時可以保護重組膠原蛋白多肽蛋白的生物活性，將重組膠原蛋 白多肽活性多肽利用油體蛋白的特性，通過植物油體包裹，定位在油體表面，通過乳化均質(zhì) 技術(shù)，可以使重組膠原蛋白多肽蛋白很均勻地分布在護膚乳液中，通過油體的透皮吸收作 用，使其容易發(fā)揮作用。本發(fā)明工藝簡單，功效顯著，成本降低，所以本發(fā)明的技術(shù)方案為優(yōu) 質(zhì)的技術(shù)方案。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1油體表達Col基因的載體示意圖（油體表達重組膠原蛋白多肽基因的載體示 意圖）
[0021] 圖2紅花油體顯微圖
[0022] 圖3含有Col蛋白的擬南芥油體的直觀圖（含有重組膠原蛋白多肽的擬南芥油體 的直觀圖）
[0023] 圖4含有Col蛋白的擬南芥油體的活性檢測（含有重組膠原蛋白多肽的擬南芥油 體的活性檢測）
[0024] 圖5含有Col植物油體的乳液直觀圖（含有重組膠原蛋白多肽護膚乳液的直觀 圖） 具體實施例
[0025] 實施例1重組膠原蛋白多肽在植物油體中表達
[0026] 根據(jù)植物密碼子的偏好性對從GENBANK中找到的重組膠原蛋白多肽Col的核苷酸 序列進行改造，將植物中含量較少的稀有氨基酸密碼子替換成植物偏好的密碼子。根據(jù)密 碼子的簡并性消除在本實驗中所用到的酶切位點，送去上海生工生物工程有限公司進行人 工合成重組重組膠原蛋白多肽基因 （SEQ ID NO. 1)。
[0027] 實施例2克隆菜豆種子特異啟動子與終止子
[0028] 克隆菜豆啟動子和終止子基因，為了從菜豆基因組序列中克隆種子特異啟動子 與終止子，利用引物，采用標準的多聚酶鏈式反應（PCR)，從菜豆基因組DNA中擴增得到 1548bp和1220bp的DNA片段，擴增的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，克隆到pUC57克隆載體 中，保存?zhèn)溆?。?jīng)測序，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所不。
[0029] 菜豆啟動子引物
[0030] Primer5F ：GAATTCATTGTACTCCCAG
[0031] Primer5R ：AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG
[0032] 菜豆終止子引物
[0033] tem5F ：AATAAGTATGAACTAAAATGC
[0034] tem5R ： TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA
[0035] 實施例3構(gòu)建植物特異表達載體pOBT
[0036] 將pUC57-菜豆啟動子的克隆載體用限制性內(nèi)切酶pstl和NcoI消化，回收目的片 段菜豆啟動子序列，同時用pstl和NcoI消化基本質(zhì)粒p0 (以pl301為基本骨架，將其T-DNA 區(qū)進行改造，除了保留有T-DNA區(qū)的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替換，以pEGAD 質(zhì)粒為模板，利用 35S-F 上游引物 47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtc tact 和 Bar-R 下游弓 I物 54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaa cc進行PCR，擴增得到35S-Bar基因，利用kpnl和SpeI酶切位點將其插入到pCAMBIA1301 載體T-DNA區(qū)的NOS基因前，構(gòu)建了 pl301-35S-Bar-N0S基本質(zhì)粒，簡寫為p0質(zhì)粒），將菜 豆啟動子（用來啟動油體蛋白與重組膠原蛋白多肽的融合基因）與基本質(zhì)粒PO連接，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌，獲得POB中間載體；將pUC57-終止子的克隆載體用HindIII和kpnl消化，回收 目的片段菜豆終止子，同時用這兩個酶消化P〇B中間載體，將終止子與酶切后的pOB載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得植物特異表達載體pOBT。
[0037] 實施例4擬南芥油體蛋白基因的克隆
[0038] 取擬南介種子，提取DNA基因組，用引物：
[0039] I：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG
[0040] 2 ：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG
[0041] 進行擴增擬南芥油體蛋白基因，經(jīng)測序，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 4所不； 擴增的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶（NcoI酶和EcoRI酶）消化，克隆到pUC57克隆載體中，保存?zhèn)?用。
[0042] 實施例5構(gòu)建含有擬南芥油體蛋白與重組膠原蛋白多肽融合基因的植物油體特 異表達載體POBT-Col
[0043] 以克隆得到的擬南芥油體蛋白基因和重組重組膠原蛋白多肽基因為模板，設(shè)計融 合基因引物，通過融合PCR技術(shù)，獲得oleosin-Col融合基因，經(jīng)測序，其堿基序列如序列表 SEQ ID NO. 5所示。將融合基因用限制性內(nèi)切酶NcoI與HindIII進行酶切，同時用這兩個 酶對pOBT載體進行酶切，然后將融合基因與酶切后的pOBT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生 pOBT-Col植物油體表達載體。
[0044] 擬南芥油體蛋白與重組膠原蛋白多肽融合基因引物
[0045] I ：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG
[0046] 2 ：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG
[0047] 3 ：CCAGCACACTACTCCACCCGGT
[0048] 4：CCCAAGCTTCCACCGGC
[0049] 實施例6Flora dip方法進行的遺傳轉(zhuǎn)化
[0050] 首先，侵染前一天將野生型擬南芥和亞麻芥植株澆水澆透；將農(nóng)桿菌工程菌株接 種至 50ml 含有三抗（100 μ g/ml Rif、50 μ g/ml Str 和 50 μ g/ml Kan)的 YEP 液體培養(yǎng)基 中，進行預培養(yǎng)（180rpm/min，28°C );取預培養(yǎng)的農(nóng)桿菌7ml加入到含有三抗的YEP液體 培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)，直至0D5900 = 1.0?1.2 ;把農(nóng)桿菌菌液移到離心管中，20°C， 4000rpm離心20min，收集菌體，去除三抗培養(yǎng)基。用Flora-DipBuf f er重懸菌體，使其0D590 達到0.8?0.9。轉(zhuǎn)化前剪掉種莢、開花和露白的花芽。在缽體四周插上適當高度的竹簽， 以便支撐倒過來進行侵染的缽體。將擬南芥的莖部和葉片基部浸入重懸的農(nóng)桿菌菌液中， 靜置7分鐘，然后吸棄過多的菌液。平放轉(zhuǎn)化后的缽體，用塑料薄膜等保濕過夜，第二天可 稍露一小縫，第三天正常放置。一周后可進行第二次侵染。待種子成熟后，可隔天采摘發(fā)黃 成熟的莢，收獲種子。
[0051] 實施例7篩選表達量高的轉(zhuǎn)基因株系
[0052] 轉(zhuǎn)基因株系在溫室或大田經(jīng)生長與發(fā)育，然后開花結(jié)籽，形成轉(zhuǎn)基因 Tl代種子， 當Tl代種子收獲后，每株轉(zhuǎn)基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油體蛋白與重組膠原 蛋白多肽的融合蛋白，經(jīng)酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測重組重組膠原蛋白多肽的表達量，篩選出高表 達的轉(zhuǎn)基因株系，高表達的株系表達量達到3586. 85pg/ml。
[0053] 實施例8含有重組膠原蛋白多肽的油體制備
[0054] 從含有重組膠原蛋白多肽蛋白的轉(zhuǎn)基因油料作物種子中提取含有重組膠原蛋白 多肽蛋白的油體，保存?zhèn)溆茫唧w方法如下：（1)取〇. Img轉(zhuǎn)基因種子，放入研缽中，加入 Iml PBS，用研棒充分研磨。直至溶液變渾池，看不見種粒。放入離心機10000rpm，4°C，離 心IOmin; (2)離心后溶液分為三層，即表層為白色油狀層，中間層液體，和底層沉淀。將上 層油體部分和液體部分混合均勻，全部吸出，注意不要吸出底層沉淀，將吸出的液體轉(zhuǎn)移至 另一離心管中，加？85，離心10000印111，4°(：,10111丨11，重復1、2步驟，3?4次。（3)將重復1、2 步驟離心后吸出的液體加500 μ 1的PBS混勻，在離心機中4°C，lOOOOrpm，離心lOmin。（4) 此時離心后分為兩層，為上層油脂部分和下層液體部分，將下層液體吸出，棄掉。再重復3、 4步驟，3?4次。
[0055] 實施例9油體中重組膠原蛋白多肽的含量測定
[0056] 轉(zhuǎn)基因株系在溫室或大田經(jīng)生長與發(fā)育，然后開花結(jié)籽，形成轉(zhuǎn)基因 Tl代種子， 當Tl代種子收獲后，每株轉(zhuǎn)基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油體蛋白與重組膠原 蛋白多肽的融合蛋白，采用ELISA法，按照ELISA試劑盒（長春百金生物科技有限公司）說 明書操作，檢測油體中重組膠原蛋白多肽的表達量，經(jīng)計算，擬南芥油體中重組膠原蛋白多 肽的表達量為3586. 85pg/ml。
[0057] 實施例10油體中重組膠原蛋白多肽的活性檢測
[0058] 1、收集對數(shù)期細胞NIH3T3細胞使用細胞計數(shù)板計數(shù)，96孔平底板中每孔加入 IOOul細胞液，細胞數(shù)為6000個左右。
[0059] 2.、37°C，5% C02培養(yǎng)24h，置顯微鏡下觀察細胞單層鋪滿孔底。此時，輕倒出96 孔板中的完全培養(yǎng)基，每孔加入IOOul的饑餓培養(yǎng)基。
[0060] 3.、5% C02,37°C培養(yǎng)24小時，設(shè)7個梯度加藥，每孔lOOul，設(shè)2個復孔。同時使 用純品蛋白bFGF作為陽性對照，野生型擬南芥種子油體作為陰性對照。
[0061] 4、5% C02,37°C培養(yǎng)48小時，每孔加25ul濃度為0. 5%的MTT溶液，
[0062] 5、5% C02,37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液。
[0063] 6、每孔加入120ulDMS0,低速振蕩lOmin，紫色結(jié)晶充分溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀 在570nm波長下測定。結(jié)果見圖4。
[0064] 實施例11紅花油體的提取
[0065] (1)取200?IOOOmg野生型紅花種子，放入研缽中，加入Iml Buffer A，用研棒充 分研磨。直至溶液變渾池，看不見種粒。放入離心機12000rpm，4°C，離心30min;
[0066] (2)離心后溶液分為三層，即表層為白色油狀層，中間層液體，和底層沉淀。將上層 油體部分和液體部分混合均勻，全部吸出，注意不要吸出底層沉淀，將吸出的液體轉(zhuǎn)移至另 一離心管中，加 BufferB,離心18000rpm，4°C，IOmin,重復1、2步驟，3?4次。
[0067] (3)將重復1、2步驟離心后吸出的液體加500μ 1的BufferC混勻，在離心機中 4°C，18000rpm，離心 lOmin。
[0068] (4)此時離心后分為兩層，為上層油脂部分和下層液體部分，將下層液體吸出，棄 掉。再重復3、4步驟，3?4次。
[0069] Buffer A：0. 6M Sucrose,0. 5M NaCl,0. 05M Tris-HCl(pH = 7. 0)；
[0070] Buffer B ：0. 4M Sucrose,0. 5M NaCl,0. 05M Tris-HCl (pH = 7. 0)；
[0071] Buffer C :20mM Na2HPO4, 20mM NaCl (pH = 7. 0)。
[0072] 實施例12護膚乳液配方篩選
[0073] -種含有重組膠原蛋白多肽的護膚乳液，由以下重量份的原料制成：5% -25% 保濕劑（紅花油體），10 %甘油，10 % -25 %乳化劑（羧乙基纖維素），1.5 % -8 %偶合劑 (PEG600)，0.05% -0.5%防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液），1% -10%營養(yǎng)添加 劑（含有重組膠原蛋白多肽蛋白的擬南芥油體）和5%-20%維生素 C，適量香精，其余為 去離子水，本發(fā)明設(shè)計了正交實驗，通過穩(wěn)定性實驗和活性檢測，確定出最佳的乳液配方為 10%油性原料（紅花油體），1〇%甘油，10%乳化劑（羧乙基纖維素），3%偶合劑（PEG600)， 0. 25%防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液），0. 5%香精，8%營養(yǎng)添加劑（含有重組 膠原蛋白多肽蛋白的擬南芥油體），5%維生素 C。
[0074] 實施例13護膚乳液制備方法
[0075] 本發(fā)明制備一種含有重組膠原蛋白多肽護膚乳液的制備方法，包括以下步驟進行 制備：首先將植物油體提取出來，然后將水加入到油體中，混合均勻；然后逐級加入甘油和 乳化劑羧乙基纖維素，偶合劑PEG600,攪拌均勻，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均 質(zhì)機中乳化10_20min ;最后，攪拌均勻后再加入防腐劑尼泊金甲酯和尼泊金丙酯的混合液 和營養(yǎng)添加劑含有重組膠原蛋白多肽的植物油體和維生素 C以及藏紅花香精，攪拌均勻后 即成本發(fā)明品。
[0076] 實施例14護膚乳液穩(wěn)定性實驗
[0077] (1)在40°C電熱恒溫培養(yǎng)箱中放置30-50天，恢復室溫后觀察，并沒有分層現(xiàn)象， 穩(wěn)定性良好；
[0078] (2)24小時之內(nèi)，在0°C -50°C之間來回頻繁變化，如此反復操作15-30天，恢復室 溫后觀察，沒有分層現(xiàn)象，穩(wěn)定性良好；
[0079] (3)在_5°C冰箱和40°C的電熱恒溫培養(yǎng)箱中各放1天，如此反復操作5-7天，恢復 室溫后觀察，沒有出現(xiàn)分層現(xiàn)象，穩(wěn)定性良好；
[0080] (4)在40°C的電熱恒溫培養(yǎng)箱中放置5-7天，然后在(TC -5°C冰箱中放置5-7天， 接下來再放入40°C _50°C的電熱恒溫培養(yǎng)箱中放置30天，恢復室溫后觀察，穩(wěn)定性良好。
[0081] 通過上述實驗觀察，油性原料10%，甘油10%，乳化劑10%，偶合劑3%，防腐劑 0. 25 %，香精0. 5 %，營養(yǎng)添加劑8 %，維生素 C5 %，這一乳液配方的穩(wěn)定性較好。
[0082] 實施例15含有重組膠原蛋白多肽油體的護膚乳液功效
[0083] 首先對護膚乳液進行抗氧化功效檢測，選用鄰苯三酚法檢測對超氧陰離子自由基 的清除作用，結(jié)晶紫法檢測對輕自由基的清除作用，DPH法檢測對總自由基的清除作用。
[0084] 然后對美白功效進行檢測，采用酪氨酸酶抑制法，取4支試管分別編號為Cl、C2、 Tl、T2,按照表1的順序在各管中加入相應的試劑，CUTl在加入酪氨酸酶之前先放入37°C 水浴鍋內(nèi)l〇min，然后再加入酪氨酸酶，然后將Cl、C2、ΤΙ、T2共同放入共同放入37°C水浴 鍋內(nèi)lOmin，取出分別測定Cl、C2、ΤΙ、T2各管在475nm處的吸光度值，做三次平行。
[0085] 采用上述這種方法測定以下不同配方的護膚品的超氧陰離子自由基的清除率、羥 自由基清除率、總自由基清除率、酪氨酸酶抑制率。
[0086] 組成1 (本發(fā)明）：油性原料（紅花油體）10%，甘油10%，乳化劑（羧乙基纖維 素）10%，偶合劑（PEG600)3%，防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0. 25%，香精 (藏紅花香精）〇. 5 %，營養(yǎng)添加劑（含有28694. 8pg重組膠原蛋白多肽的擬南芥油體）8 %， 維生素 C5% ;
[0087] 組成2 :油性原料（紅花油體）10%，甘油10%，乳化劑（羧乙基纖維素）10%，偶 合劑（PEG600) 3%，防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏紅花香 精）0. 5%，維生素 C5% ;
[0088] 組成3:油性原料（甘油）20%，乳化劑（羧乙基纖維素）10%，偶合劑 (PEG600)3 %，防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏紅花香 精）0. 5 %，營養(yǎng)添加劑（含有23005. 12pg重組膠原蛋白多肽的擬南芥油體）8 %，維生素 C5% ；
[0089] 組成4:油性原料（甘油）20%，乳化劑（羧乙基纖維素）10%，偶合劑 (PEG600)3 %，防腐劑（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏紅花香 精）0.5%，營養(yǎng)添加劑（28694.8pgCol純品）8%，維生素 C5% ;
[0090] 比較這四種組成配方的護膚品對超氧陰離子自由基的清除率、羥自由基清除率、 總自由基清除率、酪氨酸酶抑制率，結(jié)果如下。
[0091] 表1反應液組成與體積
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種含有重組膠原蛋白多肽的植物油體，其特征在于：利用重組DNA技術(shù)將構(gòu)建了 含有Col基因的植物油體特異性表達載體pOBT-Col，轉(zhuǎn)化至油料作物中，經(jīng)篩選鑒定獲得 轉(zhuǎn)基因受體植物，經(jīng)過培養(yǎng)收獲轉(zhuǎn)基因種子，從轉(zhuǎn)基因種子中分離提取含有重組膠原蛋白 多肽的植物油體。
2. -種含有重組膠原蛋白多肽（Col)活性多肽的植物油體護膚乳液，其特征在于：它 包括下列重量百分比的各成分 保濕劑 5%-25% 甘油 10% 乳化劑 10%-25% 偶合劑 1.5%-6% 防腐劑 0.05%-0.5% 營養(yǎng)添加劑1%-1〇% 維生素C5%-20% 香精 適量 其余為去離子水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的護膚乳液，其特征在于：保濕劑為紅花油體和甘油，營養(yǎng)添加 劑為重組膠原蛋白多肽活性多肽的擬南芥油體和維生素C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的護膚乳液，其特征在于：所述的防腐劑為尼泊金甲酯和尼泊 金丙酯的混合物，偶合劑為PEG600,乳化劑為羧乙基纖維素，香精為藏紅花香精。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的護膚乳液，其特征在于：按照以下步驟進行制備：首先將植 物油體提取出來，然后將水加入到油體中，混合均勻：然后逐級加入甘油和乳化劑羧乙基 纖維素，偶合劑PEG600,攪拌均勻，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均質(zhì)機中乳化 10-20min;最后，攪拌均勻后再加入防腐劑尼泊金甲酯和尼泊金丙酯的混合液和營養(yǎng)添加 劑重組膠原蛋白多肽活性多肽的植物油體以及藏紅花香精，攪拌均勻后即成本發(fā)明品。
【文檔編號】C12N15/66GK104274343SQ201310300893
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月9日
【發(fā)明者】楊晶, 李校堃, 李海燕, 王瀝浩, 王文慧, 郭詠昕, 王艷芳 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學