鈣離子結合位點氨基酸殘基突變改善環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產β-環(huán)糊精能力的方法
【專利摘要】具有高產β-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶)的突變體及突變方法，屬于基因工程和酶工程領域。本發(fā)明采用定點突變方法提高CGT酶的產β-環(huán)糊精能力，提供了提高Bacillus?circulans?STB01CGT酶產β-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶中鈣離子結合位點處第315位丙氨酸突變?yōu)榫彼?Arg)或天冬氨酸(Asp)，獲得突變體A315R和A315D。相比于野生CGT酶，這兩種突變體具有更高的產β-環(huán)糊精能力，更適合β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產。
【專利說明】鈣離子結合位點氨基酸殘基突變改善環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產β-環(huán)糊精能力的方法
【技術領域】
[0001]具有高產β-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及其方法，本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領域。具體的說本發(fā)明是利用定點突變技術改善環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的產物特異性。
【背景技術】
[0002]由于環(huán)糊精的環(huán)狀中空圓錐形結構具有內疏水、外親水的特性，能與多種疏水性物質形成包合物，因此，在醫(yī)藥、化工、食品、材料和分析化學等領域有著廣泛應用，其中α-、β-和Y-環(huán)糊精最為常見。
[0003]目前，環(huán)糊精通常由環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶)作用淀粉而合成。CGT酶是一種多功能型酶，能催化環(huán)化反應、偶合反應、歧化反應和水解反應，其中環(huán)化反應是其工業(yè)應用的基礎。已知野生CGT酶環(huán)化反應的產物均是α -、β -和Y -環(huán)糊精的混合物，不利于產物的分離純化，增加了環(huán)糊精的生產成本，因此，有必要改善其產物特異性。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子結合位點普遍存在于CGT酶中，且可能與CGT酶的產物特異性密切相關。
[0004]本發(fā)明主要是將來源于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) STBOl的CGT酶中鈣離子結合位點處第315位氨基酸殘基進行突變，以改善CGT酶的產物特異性。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供提高B.circulans STBOICGT酶產β -環(huán)糊精能力的突變方案。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提出具有更高環(huán)糊精生產能力的突變體A315R和A315D及其構建方法。
[0007]本發(fā)明的技術方案:
[0008]來源于B.circulans STBOl的CGT酶的突變體A315R和A315D，是將CGT酶中鈣離子結合位點處第315位Ala分別突變?yōu)锳rg和Asp。相比于野生CGT酶，突變體A315R和A31?具有更高的β-環(huán)糊精生產能力。
[0009]所述的突變體A315R和Α31?的制備方法，是根據B.circulans STBOICGT酶基因序列，分別設計相應突變位點的引物，對CGT酶基因進行突變，并且鑒別出Ala315密碼子已經變成Arg315、Asp315密碼子的突變基因，并在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600中進行表達。
[0010](I)定點突變
[0011]利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。
[0012]引入Arg315密碼子的突變引物為:
[0013]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3 ’，下劃線為突變堿基，[0014]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3，，下劃線為突變堿基；
[0015]引入Asp315密碼子的突變引物為:
[0016]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3 ’，下劃線為突變堿基。
[0017]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下劃線為突變堿基。
[0018]PCR 反應體系均為:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入雙蒸水 32.5 μ L。 [0019]PCR反應擴增條件均為:PCR擴增條件均為:98°C預變性4min ;隨后98 °C 10s，55°C 15s，72°C 8min 進行 35 個循環(huán)；最后 72°C保溫 lOmin。
[0020]將PCR產物經過DpnI消化2h后,轉入大腸桿菌(Escherichia coli)JM109感受態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后提取質粒并進行測序驗證。將突變質粒轉入表達宿主B.subtilis WB600感受態(tài)細胞中。各培養(yǎng)基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0021](2)突變體的表達與純化
[0022]挑取含突變質粒的表達宿主B.subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、1000Orpm離心20min以除去菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體A315R和A31?酶制品。各培養(yǎng)基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0023]本發(fā)明的最終效果:構建了突變體A315R和A315D，均實現(xiàn)了 β _環(huán)糊精產物特異性的提高，比野生型CGT酶更利于β -環(huán)糊精的工業(yè)化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1野生CGT酶及其突變體在ρΗ6.0、50°C下作用于5%麥芽糊精溶液生產環(huán)糊精情況。A:野生CGT酶，B:突變體A315R，C:突變體A315D ; ，α-環(huán)糊精，籲，β-環(huán)糊精，▲，Y-環(huán)糊精
【具體實施方式】
[0025]實施例1:本例具體說明突變體A315R和A315D的制備
[0026](I)定點突變
[0027]利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。
[0028]引入Arg315密碼子的突變引物為:
[0029]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3，，下劃線為突變堿基，
[0030]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3，，下劃線為突變堿基；
[0031]引入Asp315密碼子的突變引物為:
[0032]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3，，下劃線為突變堿基。
[0033]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下劃線為突變堿基。
[0034]PCR 反應體系均為:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入雙蒸水 32.5 μ L。
[0035]PCR反應擴增條件均為:PCR擴增條件均為:98°C預變性4min ;隨后98°C 10s，55°C 15s，72°C 8min 進行 35 個循環(huán)；最后 72°C保溫 lOmin。
[0036]將PCR產物經過DpnI消化2h后，轉入大腸桿菌(Escherichia coli)JM109感受態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后提取質粒并進行測序驗證。將突變質粒轉入表達宿主B.subtilis WB600感受態(tài)細胞中。各培養(yǎng)基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0037](2)突變體的表達與純化
[0038]挑取轉入表達宿主B.subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、1000Orpm離心20min以除去菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體A315R和A31?酶制品。各培養(yǎng)基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0039]上清液在70%硫酸銨溶液中沉淀過夜。沉淀物經適量Start buffer (20mmol/LTris-HCl,pH8.0)溶解,HiTrap ANX FF(high sub, 5mL)柱用 Start buffer 平衡后上樣，洗脫液為含有l(wèi)mol/L NaCl的Start buffer，分布收集，得到純化突變體A315R和A315D。
[0040]實施例2:本例具體說明酶活力分析
[0041](I)酶活力的測定
[0042]甲基橙法測定α-環(huán)化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液中，在4(TC下反應10min后，加入1.0mLl.0N的鹽酸停止反應，再加入1.0mL用50mM磷酸緩沖液配制的0.1mM甲基橙溶液，在16°C下保溫20min，在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol α -環(huán)糊精所需的酶量。
[0043]酚酞法測定環(huán)化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在40°C下反應IOmin 后，加入 3.5mL30mM NaOH 和 0.5mL 由 5mM Na2CO3 溶液配制的 0.02% (w/v)酚酞溶液停止反應，在室溫下保溫20min，在550nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol β -環(huán)糊精所需的酶量。
[0044]溴甲酚氯法測定Y -環(huán)化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在40°C下反應IOmin后，加入50 μ L1.0N的鹽酸停止反應，再加入2mL0.2M檸檬酸緩沖液(ρΗ4.2)和100 μ L5mM溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫20min，在630nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol Y -環(huán)糊精所需的酶量。
[0045](2)酶活力比較
[0046]實驗結果列于表1，結果發(fā)現(xiàn)，野生CGT酶具有較高環(huán)化活力；與野生酶相t匕，突變體A315R的α-環(huán)化活力降低了 86%，β-環(huán)化活力增加12%，Y-環(huán)化活力增加107%;突變體A315D的α-環(huán)化活力降低了 71%，β-環(huán)化活力增加10%，Y-環(huán)化活力增加72 %。突變體A315R和Α31?的總環(huán)化活力基本保持不變。而且，突變體A315R和A315D的環(huán)化活力占總環(huán)化活力的比例高于野生酶。
[0047]表1[0048]
【權利要求】
1.來源于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans) STBOl的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶)的突變體A315R和A315D，其特征是:將CGT酶中鈣離子結合位點處第315位丙氨酸(Ala)分別突變?yōu)榫彼?Arg)或天冬氨酸(Asp);相比于野生CGT酶，突變體A315R和A31?具有更高的β-環(huán)糊精生產能力。
2.權利要求書I中所述突變體A315R和Α31?的制備方法，其特征是根據B.circulansSTBOICGT酶基因序列，分別設計相應突變位點的引物，對CGT酶基因進行突變，經測序驗證后將突變基因轉入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600中進行表達。
3.權利要求書2中所述突變體A315R和A315D的制備: (1)定點突變 利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。 引入Arg315密碼子的突變引物為: 正向引物:5 ’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3 ’，下劃線為突變堿基， 反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3’,下劃線為突奪堿某; 引入Asp315密碼子的突變引物為: 正向引物:5 ’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3 ’，下劃線為突變堿基。 反向引物:5 ’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下劃線為突變堿基。
PCR 反應體系均為:5XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L, dNTPs (各 2.5mM)4 μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L，模板 DNAl μ L, PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5U/ μ L) 0.5` μ L,加入雙蒸水 32.5 μ L。 PCR反應擴增條件均為:PCR擴增條件均為:98°C預變性4min ;隨后98°C 10s，55°C 15s，72°C 8min進行35個循環(huán)；最后72°C保溫lOmin。 將PCR產物經過DpnI消化2h后，轉入大腸桿菌(Escherichia coli) JM109感受態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后提取質粒并進行測序驗證。將突變質粒轉入表達宿主B.subtilis WB600感受態(tài)細胞中。各培養(yǎng)基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。 (2)突變體A315R和A315D的表達 挑取含突變質粒的表達宿主B.subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、1000Orpm離心20min以除去菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體A315R和A31?酶制品。各培養(yǎng)基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
【文檔編號】C12N15/75GK103740669SQ201310153421
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權日:2013年4月26日
【發(fā)明者】李兆豐, 顧正彪, 班宵逢, 程力, 洪雁 申請人:江南大學