專利名稱：人工合成抗蚜蟲基因asgna及其合成方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及人工合成的抗蚜蟲基因-ASGNA序列及編碼的氨基酸序列。
背景技術：
蚜蟲等某些刺吸式和咀嚼式同翅目的害蟲是農業(yè)上極為重要的害蟲之一，它們靠吸取植物汁液為食，不僅對農作物造成了嚴重的危害，而且還承擔了植物病毒傳播的優(yōu)良媒介。如:2000年至2003年，我國河南省爆發(fā)了嚴重的植物病毒，多種作物受到侵襲，經濟損失巨大，其中，蚜蟲在病毒的傳播中起了主導的作用。使用化學殺蟲劑雖然可以在短時間內迅速殺死害蟲，但是相繼而來也產生了一系列的問題，例如污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡、殺死蚜蟲天敵、危害人類健康，而且化學殺蟲劑也極易使蚜蟲產生抗性。植物抗蚜基因工程的研究為有效控制蚜蟲的危害開辟了新的途徑。常見的抗蚜基因主要分為兩大類，一類是特異性抗蚜基因，如來源于大豆的Rag基因、從野生型萵苣中獲得的Nr基因、來源于甜瓜中的Vat基因以及SdI基因和Mi基因等，這些抗蚜基因只針對特異的蚜蟲種 類有一定的作用。另一類是廣譜性抗蚜基因，常見的有三大類:細胞分裂素基因、蛋白酶抑制劑基因和植物凝集素基因。該類抗蚜基因對蚜蟲的作用范圍廣泛，沒有專一性，其中植物凝集基因是迄今為止在抗蚜基因工程中研究的最為深入，對蚜蟲的生長發(fā)育和繁殖能力有明顯抑制作用的基因。植物凝集素(Lectin)是Stillmark于1888年首次在蓖麻籽萃取物中發(fā)現(xiàn)的,廣泛存在于植物中，尤其在種子和營養(yǎng)器官中含量豐富。是一類具有特異性糖結合活性的天然植物蛋白，具有一個或多個可與單糖或寡糖特異的可逆結合的非催化結構域。雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis Agglutinin, GNA)是目前與害蟲治理有關且研究的比較多的一種單子葉植物甘露糖結合凝集素。由四個相同的亞基組成的四聚體，富含Leu，Asn和Glu，并含有4個氨基酸殘基。成熟的GNA是由4個分子量為12，500Da的單體組成的4聚體蛋白，含有12個甘露糖專一結合位點。每個單體具有3個相同的結合甘露糖位點，通過SDS-PAGE及蔗糖梯度離心證明了 GNA的三維結構是由3個反向平行，4個β折疊通過Ω環(huán)相連組成的一個β桶。該凝集素對同翅目刺吸式口器的害蟲有明顯的抑制作用。當植物受到害蟲的侵襲時，GNA從受害的植物細胞釋放到害蟲的消化道中，引發(fā)害蟲產生毒性，完成其防御功能。在植物未受到侵襲時該凝集素不表現(xiàn)活性。與大多數(shù)的凝集素相比，雪花蓮凝集素不會對人畜和蚜蟲的天敵產生毒害，因此，在植物基因工程中有著很好的應用前景。Down等人(1996)證實了 GNA不僅能抑制馬鈴薯蚜蟲的存活率，而且能抑制其繁殖率，在含0.1%濃度GNA的人工喂養(yǎng)條件下，馬鈴薯蚜蟲的存活率下降了 10%，繁殖率減少了 65%，存活的蟲體大小與對照相比也下降了 40%。用過表達GNA的馬鈴薯進行試驗，結果表明，當GNA的表達量占可溶性蛋白的0.3%-0.4%時，轉基因植株對蚜蟲的抑制率與人工喂養(yǎng)的實驗結果一致，沒有明顯變化。但用含0.05%GNA的飼料喂養(yǎng)甘蔗蠐螬幼蟲，結果表明，21天后幼蟲生長受到抑制，28天后幼蟲死亡率明顯上升(Allsopp等，Entomologta Expertmentaliset Applwata80:409-414, 1996)。目前轉GNA的抗蚜小麥(徐瓊芳等，麥類作物學報，2005, 25(3):7-10)，抗蚜水稻(Nagadhara 等，Theor Appl Genet, 2004，109:1399-1405)，抗蟲牙大白菜(楊廣東等，園藝學報，2003, 30(3):341-342),抗蟲牙煙草(Hider等，TransgenicReserach, 1995, (4): 18-25)等都表現(xiàn)出對蚜蟲有抑制作用。對于GNA的殺蟲機理目前已有一些初步的研究報道:Zhu等指出植物凝集素能結合到害蟲消化道上皮細胞糖蛋白受體上，對害蟲產生局部或系統(tǒng)毒害效果，從而抑制其生長，甚至將其殺死；有研究表明在褐飛虱的血淋巴中出現(xiàn)了 GNA，說明GNA可以穿透中腸細胞壁進入循環(huán)系統(tǒng)，引起中毒反應。Du等研究發(fā)現(xiàn)GNA在褐飛虱的中腸中與400kd的鐵蛋白受體相結合，破壞了寄主體內的鐵平衡。另外，王慶軍等證明了它還可在害蟲的消化道內誘發(fā)病灶，促進消化道中細菌的繁殖，對害蟲本身造成危害，抑制害蟲生長、發(fā)育及繁殖。但是，在先前的報道中，表達GNA的轉基因植株只能對蚜口密度產生50%的抑制率，并不能對所有蚜蟲產生抑制作用，所以，GNA的蚜蟲抑制率有待進一步提高。袁正強等人(2001，植物學報)對GNA基因進行了改造和轉基因煙草抗蚜蟲實驗，結果表明蚜蟲抑制率提高到了 70%。此外，來源于雪 花蓮的植物凝集素基因雖然有較好的抗蚜性，但該基因在單子葉植物中高效表達，適合于單子葉植物轉基因抗蟲研究，而天然的GNA轉入雙子葉植物中，該基因表達量低，達不到預期的抗蚜效果，因此需要對天然GNA進行修飾改造，以使其適合擬南芥、棉花等雙子葉植物的轉基因應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述現(xiàn)有技術的缺點，提供一種適合雙子葉植物-擬南芥的人工合成抗蚜蟲基因ASGNA。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題在于提供一種人工合成抗蚜蟲基因ASGNA的方法。本發(fā)明所要解決的還有一個技術問題在于為抗蚜蟲基因ASGNA提供一種用途。解決上述技術問題所采用的技術方案是:抗蚜蟲基因ASGNA包含有17個核苷酸的5’非翻譯區(qū)、21個核苷酸的3’非翻譯區(qū)和一個長度為474bp開放讀碼框，其核苷酸序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCOGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTOGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCT(XOiTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTOXiCTACTGGAACTCACACOGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT抗蚜蟲基因ASGNA的合成方法包括下述步驟:1、合成抗蚜蟲基因ASGNA(I)合成抗蚜蟲基因ASGNA雪花蓮凝集素基因LEC GNA2 (基因序列號為GenBank:M55556.1)的序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCT
TGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCOGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTOGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCOGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATOGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTOXiCTACTGGAACTCACACOGGACTTGTTGGAATTCCCGCATOGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGAOGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG將雪花蓮凝集素基因序列中的122位A改為T，290位G改為T，299位G改為A，350位A改為T，365位T改為C，434位G改為T，470位A改為T，482位G改為T，得到抗蚜蟲基因ASGNA的核苷酸序列，根據此序列設計如下12條引物，其中P1，P2，P3，P4，P5，P6為上游引物，P7, P8，P9，P10, Pll, P12為下游引物: P1:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTP2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTP3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTA
P4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTP5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAP6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATP7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGAP8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGAP9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAATP10:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGT
Pll:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCAPI2:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA上述12條引物由上海生工生物工程有限公司合成，全長的抗蚜蟲基因ASGNA按下述方法連接合成:將10 μ mol/μ L 的 P6 上游引物與 10 μ mol/μ L 的 P7 下游引物、Primer STAR HS DNAPolymerase with GC Buffer (購大連于寶生物工程有限公司，貨號:DR044A)、雙蒸水按體積比為1:1:10:8加入PCR管中，72°C延伸40min，得到長度為97bp如下的核苷酸片段:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P5引物為上游引物、P8引物為下游引物，取100ng/yL的模板、lOymol/yL的P5引物、IOymol/μ L 的 Ρ8 引物，Primer Si'ARS HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入到PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得183bp的核苷酸片段如下:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT
GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCAT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P4引物作為上游引物、P9引物作為下游引物，取IOOng/μ L的模板、10 μ mol/μ L的Ρ4引物、10 μ mol/μ L 的 P9 引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95 °C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得269bp的核苷酸片段如下:TGGGGAATTTCTCAACTAOGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGAOGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTOGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P3引物為上游引物、Pio引物為下游引物，取100ng/yL的模板、10μπιο1/μ 的P3引物、IOymol/μ L 的 PlO 引物，Primer S1AR.S' HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得354bp的核苷酸片段如下:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAOGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTAOGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTOGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTAOGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAAOGTTGTGATCTAOGGAACTGATOGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P2引物為上游引物、Pll引物為下游引物，取100ng/yL的模板、10μπιο1/μ 的P2引物、IOymol/μ L 的 Pll 引物，Primer S']AR.4<- HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得440bp的核苷酸片段如下:TCATTTTGGCOGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCOGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAOGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGA(XTOiACMGtXMTCTaXiCMCAMCACAGGTGGTCTCTCCOGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTOGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAAOGTTGTGATCTAOGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACOGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用Pl引物為上游引物、P12引物為下游引物，取100ng/yL的模板、lOymol/yL的Pl引物、IOymol/μ L 的 Ρ12 引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得全長為512bp的核苷酸片段，用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段， 得到抗蚜蟲基因ASGNA。
(2) pGEM* -T Easy Vector 與抗蚜蟲基因 ASGNA 的連接用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離擴增片段，并對擴增片段進行回收，取濃度為50ng/yL回收產物、10XPCR緩沖液，濃度為10ymol/yL dATP、活力單位為1U/ULTaqDNA聚合酶加入PCR管中，按7.5:1:0.5:1混合，72 °C延伸30分鐘，在5 ’端和3，端分別加脫氧腺苷酸一dA，用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA純化試劑盒回收，用T4連接酶連接片段與pGEM* -T Easy Vector，并轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，測序鑒定正確后命名為TEasy-ASGNA ;大腸桿菌DH5 α和pGEM -T Easy Vector購于Promega公司。上述人工合成的抗蚜蟲基因ASGNA在轉化擬南芥獲得抗蚜蟲轉基因植物中的應用，其使用方法如下:1、ρΒΙ121-ASGNA雙元表達載體的構建(I)帶酶切位點Xba 1、Sca I的抗蚜蟲基因ASGNA的獲得設計PCR擴增引物，引物序列為:F:ATTTCTAGACAACTACAAGTTACAAAATGGR:ATTGAGCTCAAGTTAAAAGATCACCGGT采用常規(guī)PCR方法擴增獲得5’端帶Xba I酶切位點和3’端帶Sca I酶切位點
的抗蚜蟲基因 ASGNA，與 pGEM*-T Easy Vector 連接，按 pGEM+*-T EasyVector 試劑 盒的操作步驟進行，獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，測序鑒定后命名為TEasy-Xba 1-ASGNA-Sca I 質粒。(2)表達載體ρΒΙ121與ASGNA的連接對ρΒΙ121 載體及 TEasy-Xho 1-ASGNA-Xba I 質粒分別用 Xba I 和 Sca I 進行雙酶切，反應體系在37°C水浴2小時，30ml質量濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠分離條帶并回收，PBI121 雙酶切后回收 12858bp 的片段，命名為 pBI 121-1，TEasy-Xho 1-ASGNA-Xba I 質粒雙酶切后回收518bp條帶，命名為ASGNA-1，具體回收步驟按DNA純化試劑盒說明書進行。用T4DNA連接酶連接pBI 121-1與ASGNA-1，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在含50mg/L的卡那霉素的LB篩選培養(yǎng)基上篩選陽性菌落，搖菌提取質粒，測序鑒定后命名為PBI121-ASGNA雙元表達載體。上述載體構建過程中所用pBI121植物表達載體購于北京拜爾迪生物技術有限公司，貨號:MP-091，T4DNA連接酶，10XT4DNA連接酶緩沖液、DNA膠回收試劑盒購于Promega公司，Xbal、SacIUOXM緩沖液緩沖液購于大連寶生物工程有限公司。2、轉抗蟲基因ASGNA擬南芥的獲得將表達載體pBI121-ASGNA轉入農桿菌GV3101中，在含有50mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上挑取含有目的基因的農桿菌單克隆，接種于10 20mL LB液體篩選培養(yǎng)基(含有50mg/L利福平，50mg/L慶大霉素，50mg/L卡那霉素)中，28°C 200轉/分鐘培養(yǎng)24小時。取15mL活化的菌液接種于I 2L LB液體培養(yǎng)基(含有50mg/L利福平，50mg/L慶大霉素，50mg/L卡那霉素)中，28°C 200轉/分鐘培養(yǎng)至600nm的吸光值為0.8-1.0。離心收集菌體，重懸于I 2L轉化液中，轉化液配比為:1/2XMS，5%蔗糖，1XB5有機，0.044 μ mol/L6_BA，50 μ 1/L Silwet L_77(購于中科瑞泰生物科技有限公司，貨號:Silwet),蒸懼水定容至1L,用 0.4mol/L NaOH 調 pH 至 5.8。將野生擬南芥播種于蛭石上，用1/3MS培養(yǎng)液澆灌，置于溫室，20 22°C、相對濕度為60% 70%、光照16小時，黑暗8小時，光照強度5000 7000Lux培養(yǎng)至盛花期時，將擬南芥倒浸于含農桿菌轉化液的燒杯中，抽真空，維持0.05Mpa壓力5分鐘。取出擬南芥植株避光側放24小時后扶正，繼續(xù)培養(yǎng)待種子成熟。成熟的擬南芥種子經質量濃度為75%的乙醇，質量濃度為0.1%的氯化汞消毒后，用雙蒸水沖洗，均勻鋪在含有50mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，22°C，光照16小時，黑暗8小時，光照強度5000 7000Lux培養(yǎng)，培養(yǎng)1.5 2周后篩選陽性植株，移栽至蛭石上，用1/3MS培養(yǎng)液澆灌，置于溫室，20 22°C、相對濕度為60% 70%、光照16小時，黑暗8小時，光照強度5000 7000Lux培養(yǎng)，生長30 40天，進行分子鑒定，鑒定為陽性的植株，即為獲得的轉ASGNA擬南芥，轉基因擬南芥植株具有抑制蚜蟲生長，減少蚜蟲在擬南芥植株上分布數(shù)量的作用。采用人工合成的抗蚜蟲基因ASGNA，構建成連接有抗蚜蟲基因ASGNA的表達載體，轉到擬南芥中表達，經過在轉基因擬南芥上蚜蟲生長以及趨避實驗，結果表明，對蚜蟲的平均抑制率為44%，蚜蟲對轉ASGNA基因的擬南芥的趨避效應都要高于野生的擬南芥，說明轉ASGNA基因的擬南芥對蚜蟲有抗性。


圖1是pBI121-ASGNA植物雙元表達載體T-DNA區(qū)的結構示意圖。圖2是轉抗蚜蟲基因ASGNA擬南芥對蚜蟲存活的抑制率曲線。圖3是轉抗蚜蟲基因ASGNA擬南芥對蚜蟲的趨避計數(shù)曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1全長512bp的抗蚜蟲基因ASGNA，包含17個核苷酸的5’非翻譯區(qū)(I位核苷酸-17位核苷酸)，21個核苷酸的3’非翻譯區(qū)(492位核苷酸-512位核苷酸)和一個長度為474bp開放讀碼框(18位核苷酸-491位核苷酸)，其核苷酸序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAA TTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT
上述抗蚜蟲基因ASGNA的合成方法由下述步驟組成:1、合成抗蚜蟲基因ASGNA(I)合成抗蚜蟲基因ASGNA雪花蓮凝集素基因LEC GNA2 (基因序列號為GenBank:M55556.1)的序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG
將雪花蓮凝集素基因序列中的122位A改為T，290位G改為T，299位G改為A，350位A改為T，365位T改為C，434位G改為T，470位A改為T，482位G改為T，得到抗蚜蟲基因ASGNA的核苷酸序列，根據此序列設計如下12條引物，其中Pl，P2，P3，P4，P5，P6為上游引物，P7, P8，P9，P10, Pll, P12為下游引物:P1:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTP2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTP3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAP4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTP5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAP6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATP7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGAP8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGAP9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAATPlO:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGTPll:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCAPI2:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA上述12條引物由上海生工生物工程有限公司合成，全長的抗蚜蟲基因ASGNA按下述方法連接合成:將I μ L濃度為10 μ mol/μ L的P6上游引物與I μ L濃度為10 μ mol/μ L的P7下游引物、10 μ L Primer STAR'S'.HS DNA Polymerase with GC Buffer (大連寶生物工程有限公司，貨號:DR044A)、8yL雙蒸水加入PCR管中，72°C延伸40min，得到長度為97bp如下的核苷酸片段:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P5引物為上游引物、P8引物為下游引物，取I μ LlOOng/ μ L的模板、I μ L濃度為10 μ mol/μ L的Ρ5 引物、I μ L 濃度為 10μπιο1/μ 的 Ρ8 引物，IOyL Primer STAR HS DNA Polymerasewith GC Buffer、7y L雙蒸水加入到PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得183bp的核苷酸片段如下:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCAT
用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P4引物作為上游引物、P9引物作為下游引物，取I μ LlOOng/μ L的模板、I μ L濃度為10 μ mol/μ L 的 P4 弓 I 物、I μ L 濃度為 10 μ mol/μ L 的 P9 引物，10 μ L Primer S ] AK κ HS DNAPolymerase with GC Buffer、7 μ L雙蒸水加入PCR管中，95°C預變性3分鐘,94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得269bp的核苷酸片段如下:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P3引物為上游引物、PlO引物為下游引物,取I μ LlOOng/μ L的模板、I μ L濃度為10 μ mol/μ L的Ρ3 引物、I μ L濃度為 10 μ mol/μ L 的PlO 引物，10 μ L Primer STAR HS DNA Polymerasewith GC Buffer,7 μ L雙蒸水加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得354bp的核苷酸片段如下:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P2引物為上游引物、Pll引物為下游引物，取I μ LlOOng/μ L的模板、I μ L濃度為10 μ mol/μ L的 Ρ2 引物、I μ L 濃度為 lOymol/yL 的 Pll 引物，IOyL Primer STAR HS DNAPolymerasewith GC Buffer,7 μ L雙蒸水加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得440bp的核苷酸片段如下:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAA
ACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTT用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用Pl引物為上游引物、P12引物為下游引物,取I μ LlOOng/μ L的模板、I μ L濃度為10 μ mol/μ L的 Pl 引物、I μ L濃度為 10 μ mol/μ L 的 Ρ12 引物，I μ L Primer STAR HS DNA Polymerasewith GC Buffer,7 μ L雙蒸水加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得全長為512bp的核苷酸片段，用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，得到抗蚜蟲基因ASGNA。CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCAC·ACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG(2) pGEMR -T Easy Vector 與抗蚜蟲 ASGNA 基因的連接用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，用DNA純化試劑盒回收518bp條帶，取7.5 μ L濃度為50ng/ μ L回收產物、I μ LlO XPCR緩沖液，0.5 μ L濃度為10 μ mol/UL dATP、lyL活力單位為1U/UL TaqDNA聚合酶加入PCR管中，72°C延伸30分鐘，在5’端和3’端分別加脫氧腺苷酸一dA，用30mL質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA純化試劑盒回收，用T4連接酶連接片段與pGEM "-T Easy Vector,按pGEM*' -T Easy載體試劑盒的操作步驟進行，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，經測序鑒定正確后命名為T Easy-ASGNA ;大腸桿菌DH5 α和pGEM -T Easy載體試劑盒購置于Promega公司。2、pBI 121-ASGNA雙元表達載體的構建(I)帶酶切位點Xba 1、Sca I的抗蚜蟲基因ASGNA的獲得設計PCR擴增引物，引物序列為:F:ATTTCTAGACAACTACAAGTTACAAAATGGR:ATTGAGCTCAAGTTAAAAGATCACCGGT采用常規(guī)PCR方法擴增獲得5’端帶Xba I酶切位點和3’端帶Sca I酶切位點
的抗蚜蟲基因 ASGNA，與 pGEMS -T Easy Vector 連接，按 pGEM* -T EasyVector 試劑
盒的操作步驟進行，獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，測序鑒定后命名為TEasy-Xba 1-ASGNA-Sca I 質粒。
(2)表達載體pBI121與ASGNA的連接對pBI121 載體及 TEasy-Xho 1-ASGNA-Xba I 質粒分別用 Xba I 和 Sca I 進行雙
酶切,各自的雙酶切體系如下:
權利要求
1.一種人工合成抗蚜蟲基因ASGNA，其特征在于它包含有17個核苷酸的5’非翻譯區(qū)、21個核苷酸的3’非翻譯區(qū)和一個長度為474bp開放讀碼框，其核苷酸序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTO
2.—種權利要求1抗蚜蟲基因ASGNA的合成方法，其特征在于它包括下述步驟: (I)合成抗蚜蟲基因ASGNA 基因序列號為GenBank:M55556.1的雪花蓮凝集素基因LEC GNA2的序列如下:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG 將雪花蓮凝集素基因序列中的122位A改為T，290位G改為T，299位G改為A，350位A改為T，365位T改為C，434位G改為T，470位A改為T，482位G改為T，得到抗蚜蟲基因ASGNA的核苷酸序列，根據此序列設計如下12條引物:Pl:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTP2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTP3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAP4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTP5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAP6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATP7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGAP8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGAP9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAATPIO:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGTPll:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCAP12:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA全長的抗蚜蟲基因ASGNA按下述方法連接合成: 將 10 μ mo I/μ L 的P6 上游引物與 10 μ mol/μ L 的 Ρ7 下游引物、Primer STAR HS DNAPolymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為 1: 1:10:8 加入PCR管中，72°C延伸 40min,得到長度為97bp如下的核苷酸片段:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT 用質量濃度為1%的瓊脂 糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P5引物為上游引物、P8引物為下游引物，取IOOng/μ L的模板、10 μ mol/μ L的Ρ5引物、10 μ mol/μ L的Ρ8引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為 1: 1: 1:10:7加入到PCR管中，95 °C預變性3分鐘，94 V變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得183bp的核苷酸片段如下:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCAT 用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P4引物作為上游引物、P9引物作為下游引物，取100ng/yL的模板、lOymol/yL的P4引物、IOymol/μ L 的 Ρ9 引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95 °C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50 V退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得269bp的核苷酸片段如下:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT 用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P3引物為上游引物、PlO引物為下游引物，取IOOng/ μ L的模板、10 μ mol/μ L的P3引物、10 μ mol/μ L的PlO引物，Primer STARS HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為 1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得354bp的核苷酸片段如下:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用P2引物為上游引物、PlI引物為下游引物，取IOOng/ μ L的模板、10 μ mol/ μ L的Ρ2引物、10 μ mol/ μ L的PlI引物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為 1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得440bp的核苷酸片段如下:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAGATTAAGCTT 用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，以該片段為模板，用Pl引物為上游引物、P12引物為下游引物，取IOOng/ μ L的模板、10 μ mol/μ L的Pl引物、10 μ mol/μ L的Ρ12弓丨物，Primer STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、雙蒸水按體積比為 1: 1: 1:10:7加入PCR管中，95°C預變性3分鐘，94°C變性30秒，50°C退火40秒，72°C延伸I分鐘，25次循環(huán)后，72°C再延伸5分鐘，獲得全長為512bp的核苷酸片段，用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收該片段，得到抗 蚜蟲基因ASGNA。CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATAAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCGO
3.人工合成抗蚜蟲基因ASGNA在轉化擬南芥獲得抗蚜蟲轉基因植物中的應用。
全文摘要
一種人工合成抗蚜蟲基因ASGNA，它包含有17個核苷酸的5’非翻譯區(qū)、21個核苷酸的3’非翻譯區(qū)和一個長度為474bp開放讀碼框。其合成方法將雪花蓮凝集素基因序列中的122位A改為T，290位G改為T，299位G改為A，350位A改為T，365位T改為C，434位G改為T，470位A改為T，482位G改為T，得到抗蚜蟲基因ASGNA的核苷酸序列。人工合成抗蚜蟲基因ASGNA在轉化擬南芥獲得抗蚜蟲轉基因植物中的應用。構建成的連接有抗蚜蟲基因ASGNA的表達載體，轉到擬南芥中表達，經過在轉基因擬南芥上蚜蟲生長以及趨避實驗，結果表明，對蚜蟲的平均抑制率為44%。
文檔編號C12N15/29GK103146711SQ201310087310
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權日2013年3月19日
發(fā)明者俞嘉寧, 常淑芬, 田莉莉 申請人:陜西師范大學