專利名稱：攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的菌株、構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌工程菌株。
背景技術(shù)：
桿菌肽為淡黃色或類白色粉末，無(wú)嗅，味苦，是由10種氨基酸、12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽類抗生素，可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。桿菌肽通過(guò)組氨酸的咪唑基和噻唑環(huán)，與多種金屬離子如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+等生成絡(luò)合物，其中以鋅鹽形式存在的桿菌肽，抑菌活性得到一定程度的增強(qiáng)，且穩(wěn)定性最好。桿菌肽擁有在腸道內(nèi)幾乎不吸收，排泄迅速，體內(nèi)不殘留等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛添加于飼料中。桿菌肽的作用機(jī)理是:一、其絡(luò)合物能吸附在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，阻礙脫磷酸化作用，影響磷脂的運(yùn)轉(zhuǎn)和向胞壁支架輸送粘肽復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞壁合成受到抑制，細(xì)胞逐漸死亡；二、結(jié)合敏感菌細(xì)胞膜脂蛋白中的游離磷酸鹽，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，通透性增加，各種離子、氨基酸、嘧啶、嘌呤等外流；三、干擾敏感菌細(xì)胞內(nèi)原漿蛋白的合成。目前,桿菌肽主要生產(chǎn)菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),其通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn),微生物發(fā)酵過(guò)程中，氧氣對(duì)好氧微生物的生長(zhǎng)繁殖和進(jìn)行能量物質(zhì)代謝尤為重要，但微生物只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧，從而使氧氣供應(yīng)成為限制發(fā)酵產(chǎn)量的一大瓶頸。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是在革蘭氏陰性菌透明顫菌中發(fā)現(xiàn)的一種氧調(diào) 節(jié)蛋白，透明顫菌在限氧條件下大量誘導(dǎo)合成該蛋白，使其在限氧條件下正常生長(zhǎng)。VHb能特異性結(jié)合O2，并且高速釋放，從而促進(jìn)微生物細(xì)胞內(nèi)氧的傳遞，提高氧的利用率，這種特性使之能夠充分利用有限空間中的氧氣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能高產(chǎn)桿菌肽的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的菌株、構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述菌株為地衣芽孢桿菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],該菌株保藏在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2011345，保藏日期為2011年10月12曰。一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:質(zhì)粒pDG1730-vgb+經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到的1246bp vgb片段，該片段含有芽孢桿菌編碼乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)自身誘導(dǎo)物(Al)合成酶IuxS基因的啟動(dòng)子Pluxs和vgb ORF ；質(zhì)粒PHY300PLK經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到4870bp線性質(zhì)粒片段；1246bp vgb片段與4870bp線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接作用，得到表達(dá)載體pHY300-vgb ;將表達(dá)載體pHY300-vgb轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行保存，其后通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入原始菌株一一地衣芽孢桿菌(B.licheniformis DW2)，以四環(huán)素抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到地衣芽孢桿菌(pHY300_Vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300_vgb)]。一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:它在桿菌肽發(fā)酵中的應(yīng)用。較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:在地衣芽孢桿菌的表達(dá)載體PHY300PLK中連接上透明顫菌血紅蛋白基因，構(gòu)建了一種能在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)表達(dá)透明顫菌血紅蛋白，提高宿主菌在低氧發(fā)酵環(huán)境下的攝氧能力，改善細(xì)胞在低氧環(huán)境下的生理狀態(tài)，從而改善了含此基因的宿主菌在發(fā)酵中的供氧問題。地衣芽孢桿菌(pHY300-vgb) [Bacilluslicheniformis (pHY300-vgb)]單位菌體桿菌妝產(chǎn)量較原始菌株B.licheniformisDW2提高7 9.4805%。


圖1是血紅蛋白基因重組載體構(gòu)建方法示意圖。圖2為pHY300-vgb的陽(yáng)性克隆的篩選鑒定圖。圖3是轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒VHb基因的PCR鑒定圖。圖4是CO制備裝置圖。圖 5 是 Bacillus licheniformis (pHY300-vgb) > Bacillus licheniformis(pHY300)和 Bacillus l icheniformis DW2 的 CO 差光光譜圖。圖6是3L罐發(fā)酵過(guò)程中生物量的變化曲線圖。圖7是3L罐發(fā)酵過(guò)程中桿菌肽產(chǎn)量的變化曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的菌株，其特征在于:所述菌株為地衣芽孢桿菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],該菌株保藏在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2011345，保藏日期為2011年10月12日。如圖1，一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:質(zhì)粒pDG1730-vgb+經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到的1246bp vgb片段，該片段含有芽孢桿菌編碼乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)自身誘導(dǎo)物(Al)合成酶IuxS基因的啟動(dòng)子PluxJP vgbORF ;質(zhì)粒pHY300PLK經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到4870bp線性質(zhì)粒片段；1246bp vgb片段與4870bp線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接作用，得到表達(dá)載體pHY300-vgb ;將表達(dá)載體pHY300-vgb轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行保存，其后通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入原始菌株——地衣芽孢桿菌(B.licheniformis DW2)，以四環(huán)素抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到地衣芽孢桿菌(pHY300_Vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300_vgb)]。所述原始菌株為地衣芽孢桿菌(B.1icheniformi DW2),該菌株保藏在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2011344，保藏日期為2011年10月12日。攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法的具體實(shí)施例，如下:
(I)質(zhì)粒pDG1730_vgb+的具體構(gòu)建方法①質(zhì)粒pEG49Ι-vgb+經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切得到1246bp血紅蛋白基因vgb片段；②質(zhì)粒pDG780經(jīng)HindIII酶切得到1360bp卡那霉素抗性基因(Kanlr)片斷；③兩片段插入質(zhì)粒pDG1730中對(duì)應(yīng)的多克隆位點(diǎn)上，得到質(zhì)粒pDG1730_vgb+。(2)質(zhì)粒 pDG1730_vgb+ 的雙酶切
權(quán)利要求
1.一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述菌株為地衣芽孢桿菌(pHY300_vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300_vgb)],該菌株保藏在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2011345，保藏日期為2011年10月12日。
2.—種權(quán)利要求1所述攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:質(zhì)粒pDG1730-vgb+經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到的1246bp vgb片段，該片段含有芽孢桿菌編碼乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)自身誘導(dǎo)物(Al)合成酶IuxS基因的啟動(dòng)子Pluxs和vgb ORF ;質(zhì)粒pHY300PLK經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切得到4870bp線性質(zhì)粒片段；1246bp vgb片段與4870bp線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接作用，得到表達(dá)載體pHY300-vgb ;將表達(dá)載體pHY300-vgb轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行保存，其后通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入原始菌株——地衣芽孢桿菌(B.licheniformis DW2)，以四環(huán)素抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到地衣芽抱桿菌(pHY300-vgb) [Bacillus licheniformis (pHY300-vgb)]。
3.—種權(quán)利要求1或2所述攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:它在桿菌肽發(fā)酵中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:地衣芽孢桿菌(pHY300-vgb)在桿菌肽發(fā)酵中的應(yīng)用步驟包括:A菌種活化，B種子發(fā)酵，C生產(chǎn)發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟A菌種活化的菌種活化培養(yǎng)基配方為:酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaC110g/L, pH 值為 7.0-7.4 ； 所述步驟A菌種活化的培養(yǎng)條件為從甘油管以體積`百分比1%接種于裝有5ml LB培養(yǎng)基的PA瓶中，180 300rpm，溫度37°C，培養(yǎng)10 14h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟B種子發(fā)酵的種子發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:黃豆餅粉8 15g/L、玉米淀粉2.5 7.5g/L、CaC030.5 2.5g/L、(NH4) 2S040.1 1.0g/L、花生餅粉 0.5 2.5g/L，pH值為 6.5 7.5 ； 所述步驟B種子發(fā)酵的培養(yǎng)條件為將經(jīng)步驟A菌種活化后的菌液以體積百分比1%接種后180 300r/min，溫度37°C，培養(yǎng)10 12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟C生產(chǎn)發(fā)酵的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):黃豆餅粉45 55g/L、玉米淀粉 15 25g/L、CaC034 8g/L、(NH4)2SO40.5 2g/L、花生餅粉 4 8g/L、玉米漿 6 14g/L，pH 值為 6.5 7.5 ; 所述步驟C生產(chǎn)發(fā)酵的培養(yǎng)條件為500mL三角瓶裝生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的液量為25 150mL，將經(jīng)步驟B種子發(fā)酵后的菌液以體積百分比2%接種量，180 300r/min，溫度37°C，發(fā)酵培養(yǎng)48h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌，其特征在于所述菌株為地衣芽孢桿菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，該菌株保藏在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NOM2011345。本發(fā)明的目的在于提供一種能高產(chǎn)桿菌肽的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌的菌株、構(gòu)建方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103146629SQ201310069879
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者李俊輝, 樓麗君, 賴建平 申請(qǐng)人:綠康生化股份有限公司