專利名稱：一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內(nèi)生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內(nèi)生菌，因此可以推測(cè)內(nèi)生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌[2]。目前從植物中分離的內(nèi)生 菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~8]和具有促進(jìn)植物對(duì)不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。在促進(jìn)光合作用方面的內(nèi)生菌報(bào)道極少，僅有在水稻上發(fā)現(xiàn)一種具有光合作用能力的內(nèi)生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個(gè)株系。木麻黃科植物是兼有弗蘭克氏菌菌(Frankia)、內(nèi)生菌根菌和外生菌根菌的共生營養(yǎng)型植物，因此，關(guān)于木麻黃真菌學(xué)方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內(nèi)生真菌方面的研究尚未見報(bào)道[1°_11]。前人的研究中應(yīng)用菌株，多為外生真菌，同時(shí)也沒有從促進(jìn)光合作用的根本因素去尋找內(nèi)生真菌，提高其科學(xué)性和可靠性[12]。證實(shí)能促進(jìn)光合作用的內(nèi)生菌方面尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株。本發(fā)明提供的一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株，為葉點(diǎn)霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌16,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6308。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個(gè)部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法[13_15]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個(gè)部分的鱗狀葉小枝，每個(gè)鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個(gè)處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個(gè)部分；D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5— 7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化；生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化。固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過2-3次點(diǎn)接純化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種的上述的Phyllostic-ta sp.功能菌株；
其在平面培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，由中心向外輻射狀褶皺，中部隆起；背部褶皺，生長(zhǎng)速度極慢。分生孢子器暗色，有孔，兩面凸到球形；分生抱子梗短；分生孢子小，單孢，無色，卵圓形到長(zhǎng)；參照真菌鑒定手冊(cè)將其鑒定為葉點(diǎn)霉屬sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6308。上述的一種能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株應(yīng)用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48 72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發(fā)明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標(biāo)菌株為葉點(diǎn)霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌16,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6308。將木麻黃根際真菌16接種于木麻黃水培苗，根據(jù)光合作用的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)光合作用具有促進(jìn)作用以及實(shí)際對(duì)木麻黃的干物質(zhì)的增效作用，尋找到對(duì)促進(jìn)光合作用有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。菌株16處理的Fm值為對(duì)照苗木的2.13倍，F(xiàn)v為對(duì)照苗木的2.21倍，F(xiàn)v/Fm值與對(duì)照CK相比增加了 6.24%。OPSII較對(duì)照增加了 14.10%, Rfd對(duì)照CK相比增加了 6.30%。說明了接菌處理有利于提高苗木的潛在光合能力。菌株16號(hào)處理下苗木的生物量鮮重、生物量干重、地上部分鮮重和干重、地下部分鮮重和干重都顯著高于其他菌株處理下的苗木，生物量鮮重達(dá)到1.043g，為對(duì)照CK的2.34倍，生物量干重達(dá)到0.283g，為對(duì)照CK的1.66倍，地上部分與地下部分各生物量指標(biāo)較對(duì)照的增幅至少達(dá)到33%以上，因此，菌株16號(hào)對(duì)木麻黃苗木的生物量促進(jìn)作用很明顯。`


圖1為不同接菌處理下苗木Fm、Fv的比較。圖2為不同接菌處理植株苗木Fv/Fm的比較。
具體實(shí)施例方式1、水培繁殖中的應(yīng)用
取配制好的木麻黃根際真菌16 (菌株16)應(yīng)用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin?？商岣咧裁绯苫盥?0%以上。2、根際土壤澆施應(yīng)用
試驗(yàn)材料為惠安一號(hào)水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農(nóng)林大學(xué)森林生態(tài)研究所田間試驗(yàn)地。 水培苗根系長(zhǎng)齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個(gè)直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質(zhì)量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準(zhǔn)確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時(shí)間為24h。待土壤內(nèi)甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發(fā)，以免影響幼苗的移植成活率。經(jīng)過一個(gè)月的恢復(fù)性生長(zhǎng)，在木麻黃根際施入菌株濃度為9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復(fù)3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對(duì)照。菌液的制備:將菌株16接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g，其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經(jīng)過24h的培養(yǎng)，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進(jìn)行光合作用等指標(biāo)的測(cè)定，檢測(cè)方法和結(jié)果如下:
2.1菌株澆施后木麻黃葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析
應(yīng)用 Photon Systems Instruments.(PSI)公司生產(chǎn)的 Handy Fluor Cam 突光成像儀在夜間19:00-22:00測(cè)定木麻黃苗木的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測(cè)定前先將苗木放入暗箱內(nèi)，充分暗反應(yīng)20min，隨后將苗木放于攝像頭之下，調(diào)節(jié)焦距至能看清葉片圖像為止。測(cè)量的原始參數(shù)有:Fo (最小、基礎(chǔ)或不變熒光強(qiáng)度等)是光系統(tǒng)II (PS II )反應(yīng)中心所有電子均處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量，它與葉片的葉綠素濃度有關(guān)；Fm(最大熒光)是葉片經(jīng)暗適應(yīng)20min后，光系統(tǒng)II (PS II )反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，可反映PS II的電子傳遞情況；Fo':(光下最小熒光)是光適應(yīng)狀態(tài)下全部PS II中心都開放時(shí)的突光強(qiáng)度；Fm'(光下最大突光)是光適應(yīng)狀態(tài)下全部PS II中心都關(guān)閉時(shí)的突光強(qiáng)度。其它動(dòng)力學(xué)參數(shù):
X Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm:PS II的最大或潛在的光化學(xué)效率，反映的是PS II原初光能轉(zhuǎn)化效率[19_2°]，非脅迫條件下該值變化極小，脅迫條件下該值有明顯下降[21]；:2 Yield=OPSII=AFziFm' =(Fm/ -FVFm':PS II 實(shí)際光化學(xué)量子效率，反映了植物目前的實(shí)際光合效率；
5: qN=(Fv-Fv' )/Fv=1-(Fm' -Fo' )/(Fm-Fo)或 NPQ=(Fm-Fm' )/Fm' =Fm' -1:非光化學(xué)淬滅系數(shù)；
Φ Rfd=Fd/Fs= (Fm-Fs )/Fs:此比值為葉片活力指標(biāo),反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉(zhuǎn)化效率。對(duì)不同處理下各苗木的原始熒光參數(shù)(Fm、Fv)和其他動(dòng)力學(xué)葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、OPSI1、Rfd和NPQ)進(jìn)行單因素方差分析，以檢驗(yàn)其變化的顯著性，多重比較采用Duncan法，所有數(shù)據(jù)處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。I不同處理水培苗Fm、Fv和Fv/Fm的值
熒光分析當(dāng)中，F(xiàn)m和Fv均反映著光系統(tǒng)II的光化學(xué)活性。最大熒光(即Fm)是光系統(tǒng)II (即PS II )反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉狀態(tài)下的熒光產(chǎn)量，它既可以反映光系統(tǒng)II的電子傳遞情況，也能反映光是否受到抑制的情況(當(dāng)Fm降低時(shí))；可變熒光(即Fv)為Fm與Fo之差，反映著光系統(tǒng)II的電子受體一初級(jí)醌受體(即QA)的還原情況，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v值的變化程度反映著植物對(duì)周圍環(huán)境脅迫的忍耐能力[16]。從圖1中的Fm可以看出，菌株16處理的Fm值較對(duì)照CK有顯著的提高，差異達(dá)到顯著水平，為對(duì)照苗木的2.13倍。從圖1中的Fv可以看出，菌株16號(hào)增幅較大，為對(duì)照苗木的2.21倍。熒光參數(shù)中，PS II的實(shí)際光化學(xué)效率(即Fv/Fm)是研究植物光合生理狀態(tài)的重要參數(shù)，反映著植物的潛在光合能力，同時(shí)也是研究植物脅迫的重要參數(shù)，在非脅迫的環(huán)境條件下，植物的物種與生長(zhǎng)條件對(duì)其影響不大，該參數(shù)值保持在0.75與0.85之間，一旦受到外界脅迫作用，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，其值的減小意味著光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的光化學(xué)損害與光能熱耗散的增加[17]。圖2直觀地反映了菌株16接菌方式對(duì)木麻黃苗木Fv/Fm的影響。菌株16處理的植株顯著高于對(duì)照，與對(duì)照CK相比，增加了 6.24%。說明了接菌處理有利于提高苗木的潛在光合能力。2不同處理水培 苗ΦPSI1、Rfd和NPQ的值
表I不同處理下木麻黃水培苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的特征值
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*在表中的同一列數(shù)值中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P < 0.05)
OPSII能準(zhǔn)確反映植物當(dāng)前PSII反應(yīng)中心的實(shí)際光合效率狀況，其值越大，光合結(jié)構(gòu)電子傳遞能力越強(qiáng)，參與光化學(xué)反應(yīng)的光能份額越大，越有利于提高植物的光合能力18]。由表I的參數(shù)特征值可以看出，菌株16號(hào)的OPSII較對(duì)照增加了 14.10% ;Rfd為葉片活力指標(biāo)，反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉(zhuǎn)化效率，與植物光合作用成線性關(guān)系，可直觀反映植物的光合作用能力，Rfd值的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，菌株16號(hào)與對(duì)照CK相比增加了 6.30%ο3不同處理對(duì)木麻黃水培苗生物量的影響
生物量是反映苗木生產(chǎn)力水平的重要指標(biāo)，它與苗木地上與地下部分的生長(zhǎng)發(fā)育之間有著極為密切的關(guān)系；植物的根冠比是指植物地下部分與地上部分的干重的比值，它的大小能夠表征苗木對(duì)土壤養(yǎng)分或光照的需求與競(jìng)爭(zhēng)能力，若根冠比值越大，則說明苗木對(duì)養(yǎng)分的需求和競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng)，相反根冠比值越小，則說明苗木對(duì)光照的需求和競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng)。用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)木麻黃苗木的各生物量指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明不同處理下木麻黃苗木的各生物量指標(biāo)的Sig均為0.000，即差異均達(dá)到顯著水平(顯著水平為
0.05)，各指標(biāo)的多重比較見表2。表19不同處理對(duì)木麻黃苗木生物量的影響
權(quán)利要求
1.一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株，為葉點(diǎn)霉5/7.)木麻黃根際真菌16，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6308。
2.一種如權(quán)利要求1所述的葉點(diǎn)霉菌株的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，是將所述的葉點(diǎn)霉sp.)木麻黃根際真菌16接入液體培養(yǎng)基,搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48 72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期蘸根?！?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一株能促進(jìn)木麻黃光合作用的葉點(diǎn)霉菌株，為葉點(diǎn)霉(Phyllostictasp.)木麻黃根際真菌16，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.6308。將木麻黃根際真菌16接種于木麻黃水培苗，根據(jù)光合作用的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)光合作用具有促進(jìn)作用以及實(shí)際對(duì)木麻黃的干物質(zhì)的增效作用，尋找到對(duì)促進(jìn)光合作用有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103173363SQ20131006879
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者吳承禎, 洪偉, 謝安強(qiáng), 林燕青, 林勇明 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)