專利名稱：一種巴貝斯蟲的熒光定量pcr檢測和分型的引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巴貝斯蟲分子診斷的熒光定量PCR檢測試劑和檢測方法。此發(fā)明有效擴增感染犬、貓、牛、羊、馬和人的巴貝斯蟲的21個重要種(B.gibsoni, B.can iscams, B.cams rossi，B.cams vogli, B.felis，B.leo，B.bovis, B.equi，B.bigemina，B.caballi，B.capreoli，B.0docoilei，B.crassa，B.hongkangensis，B.vitalii, B.0vata, B.motasi，B.rodhaini, B.poelea，B.divergens，B.microti)，而不擴增其它類似的血液寄生蟲的核酸。
背景技術(shù)：
巴貝斯蟲(Babesia spp.)能引起多種動物和人以發(fā)熱、貧血、消瘦為特征的疾病。巴貝斯蟲是世界范圍內(nèi)第二最常見的感染哺乳動物的血液傳播寄生蟲病。巴貝斯蟲感染的已有實驗室診斷技術(shù)主要包括:I)血液圖片法觀察巴貝斯蟲。此技術(shù)的靈敏度較低，而且不能有效的區(qū)分巴貝斯蟲和其它類似的血液寄生蟲；2)血清學(xué)和ELISA方法檢測抗巴貝斯蟲的抗體。此技術(shù)的局限性是不能區(qū)分巴貝斯蟲感染者和感染后的康復(fù)者；3) PCR技術(shù)檢測巴貝斯蟲的核酸。世界范圍內(nèi)鑒定的巴貝斯蟲有超過數(shù)十種，而現(xiàn)有的PCR技術(shù)僅能擴單ー種或幾個種巴貝斯蟲的核酸。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有分子診斷技術(shù)只能檢測單一種或幾個種巴貝斯蟲的核酸不足，本發(fā)明提供ー種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的定量PCR檢測重要種的巴貝斯蟲的核酸的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明的原理和最核心的技術(shù)關(guān)鍵是科學(xué)地設(shè)計擴增和檢測巴貝斯蟲的特異、高效的引物和探針。在保證設(shè)計的 引物高效擴增巴貝斯蟲、設(shè)計的探針特異檢測巴貝斯蟲的同時，確保此引物和探針不擴增和檢測其它類似的血液寄生蟲。從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下巴貝斯蟲以及相關(guān)寄生蟲的代表株的rRNA的序列后，用ClustalMultiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進行對齊:巴貝斯蟲:Babesia microti,基因序列號:U09833;Babesia divergens,基因序列號:GQ3CM525;Babesia canis,基因序列號:DQ439545;Babesia felis,基因序列號:AY452706;Babesia gibsoni,基因序列號:AB118032;Babesia bovis,基因序列號:L19077, HQ264127。和巴貝斯蟲相關(guān)的其它寄生蟲:Theileria,基因序列號:L02366;
Cryptosporidium,基因序列號:DQ059473;Hepatozoon,基因序列號:AF176836;Eimeria,基因序列號:AY613853;Toxoplasma,基因序列號:L37425。圖1、圖2、圖3、圖4、圖5顯示設(shè)計的引物和探針如下:上游引物-1:5’ -ATGGCTTTGCCGGCGATGTATCA-3’ (SEQ ID N0.1)上游引物-2:5’-TTTHGCGATGKACCATTCAAGTTTCTG-3，(SEQID N0.2)下游引物:5’-CTGGCACCAGACTTGCCCTCCAAT-3’ (SEQ ID N0.3)6-FAM 探針:5，-ACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTC-(6-FAM)-3，(SEQ ID N0.4) Cy5.5探針:5’ _(CY5.5)-AITCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAA-PH0S (磷酸)-3’ (SEQ ID N0.5)。本發(fā)明還公開了巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，該試劑盒由下列組成:包括5倍定量PCR反應(yīng)液22 u I,以及22 ill的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 ii M的上游引物-1、上游引物-2、5 ii M下游引物、I ii M的6-FAM探針、111] 的075.5探針。本發(fā)明進一歩提供了巴貝斯蟲分型方法，該方法包括以下步驟:(1)用上述引物和探針PCR擴增待測樣本，擴增出290bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為巴貝斯蟲陽性樣本；(2)PCR完成后，對步驟(I)巴貝斯蟲陽性樣本擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對巴貝斯蟲進行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是:i)Babesia felis和Babesia microti的溶角軍溫度為 57°C；ii)Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和 Babesiabovis的雙峰的熔解溫度為63°C和69°C。本發(fā)明的PCR技術(shù)特異性從五個方面得到保證。i)設(shè)計的引物用于GenBank的BLAST捜索，確認(rèn)本發(fā)明設(shè)計的引物特異地擴增巴貝斯蟲，而不擴增其它類似的血液寄生蟲(圖1、圖2、圖3) ;ii)由Intergrated DNA Technology公司合成如下巴貝斯蟲的6個代表株的 DNA,此序列涵蓋 PCR 的擴增區(qū)域:Babesia microti, Babesia divergens, Babesiacanis, Babesia felis, Babesia gibsoni, Babesia bovis。用設(shè)計的PCR系統(tǒng)(上游引物-1,上游引物-2，下游引物，6-FAM探針，Cy5.5探針)對合成的巴貝斯蟲核酸進行PCR擴增；iii)對120個巴貝斯蟲陽性樣品進行PCR擴增；iii)對陰性對照和其它類似的血液寄生蟲的核酸(Theileria, Cryptosporidium, Hepatozoon, Eimeria, Toxoplasma)進行 PCR 擴增；iv)觀察以上擴增對象在PCR過程中熒光強度(640nm)的變化，以及PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。熒光在640nm波長出現(xiàn)或增強，顯示陽性；巴貝斯蟲的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的290bp的條帶；v)對擴增的PCR產(chǎn)物進行進行測序，測序的結(jié)果和GenBank的序列進行比較。結(jié)果顯示，設(shè)計的巴貝斯蟲PCR特異地擴增巴貝斯蟲，而不擴增其他類似的血液寄生蟲。巴貝斯蟲定量PCR靈敏度的確定:由Intergrated DNA Technology合成巴貝斯蟲及相關(guān)血液寄生蟲的rRNA的序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技木，計算合成物所含的rRNA的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 ill合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的rRNA。用上述的PCR系統(tǒng)擴增含不同濃度rRNA的巴貝斯蟲，依此確定本發(fā)明檢測巴貝斯蟲的靈敏度。結(jié)果顯示，此發(fā)明可以擴增反應(yīng)系統(tǒng)中10個拷貝的巴貝斯蟲的rRNA。高分辨率熔解曲線分析:PCR完成后，對巴貝斯蟲的擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同株巴貝斯蟲的熔解溫度。由于設(shè)計的引物特異地擴增所有株的巴貝斯蟲，而設(shè)計的探針和不同種的巴貝斯蟲的核酸有不同程度的差異(圖4、圖5)，這樣高分辨率熔解曲線技術(shù)方便地把巴貝斯蟲分成2組(圖6):1)Babesia felis和Babesia microti的溶角軍溫度為 57°C ；ii)Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和 Babesiabovis的雙峰的熔解溫度為63°C和69°C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于快速、特異、靈敏地檢測巴貝斯蟲的重要種，而且方便把6種重要的巴貝斯蟲分為2組。巴貝斯蟲診斷的主要現(xiàn)有技術(shù)包括:1)血液圖片法觀察巴貝斯蟲法。此方法的靈敏度較低(僅能發(fā)現(xiàn)急性感染者血液中的大量巴貝斯蟲)；而且此方法不能有效的區(qū)分巴貝斯蟲和其它類似的血液寄生蟲；2)血清學(xué)實驗和ELISA檢測抗巴貝斯蟲的抗體。此技術(shù)的局限性是不能區(qū)分巴貝斯蟲感染者和感染后的治療康復(fù)者；3) PCR技術(shù)檢測巴貝斯蟲的核酸。此技術(shù)有較高的敏感性和特異性，但是現(xiàn)有的技術(shù)僅能擴增巴貝斯蟲的單ー種或幾個種，而不同種的巴貝斯蟲的宿主特異性不強。本發(fā)明建立了一套高靈敏度和高特異性、快速檢測巴貝斯蟲、適合臨床使用的分子診斷方法。此技術(shù)可同時檢測多種動物(犬、貓、牛、羊、馬；B.gibsoni, B.canis canis, B.canis rossi, B.cams vogii，B.felis, B.leo, B.dovis, B.equi，B.bigemina，caballi, B.capreoli, B.0docoilei, B.crassa, B.hongkangensis, B.vitalu, B.0vata, B.motasi, B.rodhaini，B.poelea)和人(Babesia divergens, Babesia microti)的巴貝斯蟲，而不擴增其它蟲媒血液寄生蟲。


圖1:巴貝斯蟲定量PCR的上游引物-1。巴貝斯蟲定 量PCR的上游引物-1的序列為:5’ -ATG GCT TTG CCG GCG ATG TATCA-3’。如圖所示，此引物能有效地擴增感染貓和人的巴貝斯蟲(Babesia felis, Babesiamicroti)，而和其它4個巴貝斯種的DNA有9_11個堿基對的差異，不能作為擴增Babesiagiosoni，Babesia cams, Baoesia divergens, Babesia bovis 核酸的引物。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(僅搜索100%吻合的序列)顯示51個結(jié)果(hits)，此引物和6個巴貝斯蟲的rRNA序列完全吻合(B.felis, B.equi, B.microti, B.丄eo，B.rodnaini，B.poelea)。圖2:巴貝斯蟲定量PCR的上游引物_2。巴貝斯蟲定量PCR的上游引物-2的序列為:5’ -TTT HGC GAT GKA CCA TTC AAGTTT CTG-3，o 如圖所不，此引物能有效地擴增 Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesiadivergens, Babesia bovis,而和其它2個巴貝斯種的DNA有8個堿基的差異，不能作為擴增Babesia felis和Babesia microti核酸的引物。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(僅搜索100%吻合的序列)顯示350個結(jié)果，此引物和15個巴貝斯蟲的rRNA序列完全僅有ニ個degenerate減達(H和K)イヽ吻合(B.gibsoni, B.divergens, B.canis canis, B.canisrossi, B.cams vogli, B.bovis, B.bigemina, B.cabalii，B.capreoli，B.0docoilei，B.crassa, B.hongkangensis, B.vitalii，B.0vata, B.motasiノ。
圖3:巴貝斯蟲定量PCR的下游引物。巴貝斯蟲定量PCR的下游游引物的序列為:5’ -CTG GCA CCA GAC TTG CCC TCCAAT-3’。下游引物和圖示的序列成反義關(guān)系。如圖所示，此引物和所有6個種的巴貝斯蟲的 DNA 序列完全吻合(Babesia gibsoni, Babesia canis,Babesia divergens, Babesiabovis,Babesia ielis 和 Baoesia microtiノ。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(僅搜索100%吻合的序列)顯示604個結(jié)果，此引物和26個巴貝斯蟲的rRNA序列完全吻合(B.gibsoni, B.divergens, B.caniscams, B.cams rossi, B.cams vogli, B.bovis, B.Digemina, B.caballi, B.capreoli, B.0docoilei, B.crassa, B.hongkangensis, B.vital 11, B.0vata, B.motasi, B.f el is, B.equi, B.microti, B.leo, B.rodhaini, B.poelea, B.0ccultans, B.0vis, B.bennetti, B.conradae, B.0rientalis)。圖4:巴貝斯蟲定量PCR的6-FAM探針。巴貝斯蟲定量PCR的6-FAM探針的序列為5’ -ACG GGT AAC GGG GAA TTA GGGTTC-(6-FAM) _3，。此探針與巴貝斯蟲 4 個種(Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesiadivergens和Babesia bovis)的序列完全吻合,而和另外2個巴貝斯種(Babesia felis和Babesia microti)有2個喊基的不吻合。圖5:巴貝斯蟲定量PCR的Cy5.5探針。

巴貝斯蟲定量PCR的下游引物的Cy5.5探針的序列為:5’ _(CY5.5)-ATT CCG GAGAGG GAG CCT GAG AAA-(PHOS)-3’。此探針與巴貝斯蟲4個種的序列完全吻合(Babesiafelis, Babesia microti, Babesia gibsoni 和 Babesia divergens),而和另夕卜 2 個巴貝斯種(Babesia canis和Babesia bovis)有I個喊基的不吻合。圖6:巴貝斯蟲定量PCR的高分辨率熔解曲線分析。PCR完成后，對6個種巴貝斯蟲的DNA擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，觀察其熔解溫度。本發(fā)明設(shè)計的巴貝斯蟲定量PCR的6-FAM探針與巴貝斯蟲4個種的序列完全吻合(Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和Babesia bovis),而和另夕卜2個巴貝斯種有2個喊基的不吻合(Babesia felis和Babesia microti)(圖4)。因此，Babesia felis 和 Babesia microti 的溶解溫度(57°C )低于 Babesia gibsoni, Babesiacanis, Babesia divergens 和 Babesia bovis 的雙峰的溶解溫度(63°C和 69°C )。
具體實施例方式本發(fā)明的PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:上游引物-1:5，-ATG GCT TTG CCG GCG ATG TAT CA-3，上游引物-2:5’ -TTT HGC GAT GKA CCA TTC AAG TTT CTG-3，下游引物:5，-CTGGCA CCA GAC TTG CCC TCC AAT-3，6-FAM 探針:5，-ACG GGT AAC GGG GAA TTA GGG TTC-(6-FAM)-3’Cy5.5 探針:5，-(CY5.5) -ATT CCG GAG AGG GAG CCT GAG AAA-PH0S-3，本發(fā)明的檢測方法過程如下:(I)制備 PCR 用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑(standards)。由 Intergrated DNA Technology合成巴貝斯蟲的核酸序列，此序列涵蓋PCR的擴增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技木，計算合成物所含的rRNA的基因拷貝數(shù)目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的rRNA,作為PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑。(2)制備待檢樣品的DNA模板。收集犬的全血于含EDTA的試管，用于DNA純化；純化的 DNA 洗脫在 100 u I T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA，pH8.5)作為 PCR 的擴增模板。(3) PCR擴增體系。20 U I的擴增體系包含10 U I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑(standard )、IxPCR緩沖液、0.7 y M上游引物-1、0.7 y M上游引物-2、I y M下游引物、
0.2 ii M的6-FAM探針、0.2 y M的Cy5.5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 y M dNTP。(4) PCR擴增循環(huán)參數(shù)。PCR擴增包括18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(high-stringency step-down)和 25 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐还猥@得循環(huán)(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán):6xl5sec@95° C, 60seci74° C;9xl5seci95° C, 60seci72° C; 3xl5seci95° C, 10sec@70° C, 15sec@72。C.25 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán):25xl5sec@95° C，8sec@58。C, 10seci65° C, andl5seci72° C。(5)高分辨率熔解曲線分析。PCR擴增結(jié)束后，立即實施高分辨率熔解曲線分析，溫度從38° C上升到80° C，以每秒0.2° C遞增。數(shù)據(jù)分析是分析705nm:530nm(F3/Fl)的熒光強度的比例。F3/F1的第一衍生值(_d(F3/Fl)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。(6) PCR結(jié)果的判定和定量分析。DNA模板的制備過程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標(biāo)準(zhǔn)試劑海10 ill standard含104，IO3, IO2, IO1拷貝的巴貝斯蟲的rRNA)。本發(fā)明的PCR擴增效率高，有效地擴增含IO1拷貝的巴貝斯蟲的rRNA。

實施例1:巴貝斯蟲陽性株(Babesia gibsoni)的PCR擴增從感染Babesia gibsoni的陽性犬(17例)獲得的全血,并用商業(yè)試劑盒且用常規(guī)方法進行DNA提取，取10 ill作為PCR模板。用本發(fā)明技術(shù)進行PCR擴增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術(shù)細(xì)節(jié)如上所述)。結(jié)果顯示，PCR能特異高效的擴增所有17例陽性株的犬巴貝斯蟲，且出現(xiàn)雙峰(63°C和690C )的熔解溫度。實施例2:犬感染巴貝斯蟲的流行病學(xué)調(diào)查從372例來獸醫(yī)院做體檢、疫苗注射、或就診的犬獲得的全血，用商業(yè)試劑盒和常規(guī)的方法進行DNA提取，取10 Ul作為PCR模板。用本發(fā)明技術(shù)進行PCR擴增(具體技術(shù)細(xì)節(jié)如上所迷)。結(jié)果顯示，22%的犬(90/372)有巴貝斯蟲的感染。感染巴貝斯蟲的犬，僅6%顯示臨床癥狀，13%表現(xiàn)血常規(guī)異常；而81%的感染犬完全健康，不表現(xiàn)臨床癥狀和異常血常規(guī)。此PCR診斷結(jié)果經(jīng)電泳、測序等試驗確認(rèn)。
權(quán)利要求
1.ー種巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測和分型的引物及探針，其特征在于檢測引物為: 上游引物-1:5’ -ATGGCTTTGCCGGCGATGTATCA-3’ 上游引物-2:5’ - TTTHGCGATGKACCATTCAAGTTTCTG -3’ 下游引物:5’ - CTGGCACCAGACTTGCCCTCCAAT -3’ 所述探針為: 6-FAM 探針: 5，- acgggtaacggggaattagggttc-(6-FAM) _3’Cy5.5 探針:5，_ (Cy5.5) _attccggagagggagcctgagaaa_phos_3，
2.ー種巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括5倍定量PCR反應(yīng)液22μl,以及22 μl的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 PM的上游引物-1、上游引物-2、5 PM下游引物、1PM的6-FAM探針、1 PM的Cy5.5探針。
3.—種巴貝斯蟲分型方法，該方法包括以下步驟: (1)用權(quán)利要求1所述引物和探針PCR擴增待測樣本，擴增出290bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為巴貝斯蟲陽性樣本； (2)PCR完成后，對步驟(1)巴貝斯蟲陽性樣本擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對巴貝斯蟲進行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是:i) Babesia felis取Babesia microti的溶角軍溫度為 57 °C ;ii) Babesia gibsoni, Babesia can is, Babesia di vergens 和Babesiaか的雙峰的熔解溫度為63°C和69°C。
全文摘要
一種巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQIDNO.1、2和3所示，所述探針為SEQIDNO.4和5。用上述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出290bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為埃里希氏菌陽性樣本；再根據(jù)熔解溫度可對巴貝斯蟲進行分型。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢明顯，具有很高的特異性和敏感,且可以方便的檢測重要種的巴貝斯蟲。
文檔編號C12Q1/68GK103103286SQ20131006886
公開日2013年5月15日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者王成明, 陶建平 申請人:揚州大學(xué)