專利名稱：多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法。
背景技術：
誘導多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是將成體細胞重編程為具有多分化潛能的干細胞，它在形態(tài)學、表觀遺傳學、全基因表達譜及分化潛能方面與胚胎干細胞(ESCs)極其相似，其優(yōu)點是個體特異來源的iPS細胞能避免免疫排斥問題。同時iPS細胞生成技術不涉及胚胎毀損等倫理學問題。科學研究等工作中需要多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法簡便、易操作、效果好的多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法。本發(fā)明的技術解決方案是:一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征是:包括下列步驟: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包裝(I)轉染前質粒的準備1.1重組質粒Pac I單酶切，37°C酶切2h ；1.2采用經(jīng)典酚氯仿抽提法對單酶切質粒進行純化，用紫外分光光度計測定純化質權濃度；(2)轉染2.1取處于對數(shù)生長期的293A細胞，用0.05%胰酶消化，細胞計數(shù)后，按照每孔
4.5X105個細胞，種于6孔板，37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；2.2第二天轉染前移去培養(yǎng)液，換2ml Opt1-MEM培養(yǎng)液；2.3取2 μ g線性化的質粒加入250 μ I經(jīng)37°C預熱的Opt1-MEM中，混勻；2.4取5“ llipofectamine2000 加入 250μ I Opt1-ΜΕΜ 中，混勻，室溫放置 5min ；2.5將500 μ I復合物加入到細胞孔中，搖動培養(yǎng)板，混勻；在37°C，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時后,換上完全培養(yǎng)液,繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2.6轉染后48小時，用0.05%胰酶消化細胞，并轉移至IOcm培養(yǎng)皿中，加入IOml
完全培養(yǎng)基；2.7每2-3天換入新鮮培養(yǎng)基，觀察是否有病變效應出現(xiàn)；2.8讓感染繼續(xù)發(fā)生，直至80%細胞出現(xiàn)病變效應；收集細胞及上清液至滅菌的15ml離心管，_80°C保存；(3)用反復凍融法使病毒從細胞中釋放出來，離心收集初級病毒液；(4)初級病毒液的擴增
4.1病毒感染前一天對293A細胞進行計數(shù)，在IOcm培養(yǎng)皿中以3X IO6細胞種板，以保證轉導時細胞密度達到90% ；4.2感染時在IOcm皿中加入100 μ I初級病毒液，混勻；4.3在37°C，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80-90%細胞變圓并漂??；4.4收集細胞至滅菌的15ml離心管；4.5將收集的細胞置于_80°C，30分鐘，隨后置于37°C 15分鐘；反復凍融3次使病毒從細胞中釋放出來；4.6室溫下3000rpm離心15分鐘，除去細胞碎片；4.7將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于1.5ml DMEM培養(yǎng)液中，分裝小管，放置于_80°C保存?zhèn)溆茫?二)小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)細胞的制備(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合籠；(2)每天早上觀察母小鼠陰道口，有陰道栓確定為懷孕，見栓當天上午定為懷孕的
0.5 天；

(3)取懷孕12.5 13.5天母鼠，斷頸處死，取出胎鼠，將胎鼠軀干部分置于一盛有PBS的平皿內(nèi)，用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞；(7)用顯微剪將鼠胚軀干剪成lmm3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)；(8)室溫下靜置5分鐘，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；(9)向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內(nèi)加入2ml0.05%胰蛋白酶，輕輕吹吸30秒，靜置5分鐘后吸出上清于MEF培養(yǎng)基中，反復多次以上操作直至組織塊消失；(10)離心后重懸細胞于MEF培養(yǎng)基中，待細胞80%_90%融合時傳代或凍存；(11)在第3 5代MEFs的培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素C，使絲裂霉素C的終濃度為10 μ g/ml，放回培養(yǎng)箱處理2.5小時；(12)將0.1%明膠水溶液吸入培養(yǎng)瓶內(nèi)，覆蓋培養(yǎng)瓶底面，室溫下靜置2小時后吸棄明膠水溶液，用PBS洗滌一次；(13)棄含有絲裂霉素C的MEFs培養(yǎng)上清，PBS洗滌5遍；(14)消化經(jīng)絲裂霉素C處理的MEFs，種植到預先用明膠處理過的培養(yǎng)瓶內(nèi)，種植的細胞數(shù)為6 X IO4個/cm2 ；(15)待細胞貼壁后進行觀察，如細胞過稀則補加細胞，保證細胞能連成一片而沒有間隙，為飼養(yǎng)層細胞；(16)將制備好的飼養(yǎng)層細胞放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用；在5天內(nèi)使用，使用前要更換培養(yǎng)基為胚胎干細胞培養(yǎng)基；(三)MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞(I)先用0.1%明膠預包被一個T25瓶，包被時間為10分鐘；(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一個15ml離心管中，用血小板計數(shù)板計數(shù)，取出IXIO5個細胞用于感染實驗所需的細胞量；(3)將所需的含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表達rtTA的慢病毒加入一個15ml離心管中，混勻后，用0.45 μ m過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；(4)將IXlO5的細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，溶液體積最后補足至5ml，最后加入5μ I助轉劑polybrene,助轉劑polybrene使用濃度為10 μ g/ml,將整個體系混勻后，轉移到已經(jīng)預包被好的T25瓶中，搖勻后放入37° C培養(yǎng)箱中，10小時后去病毒；(5)將上述慢病毒感染后的細胞用0.25%trypsin/EDTA消化下來，按六孔板每孔IXio4的細胞量鋪到事先準備好的飼養(yǎng)層細胞上；(6)第2天，將MEF培養(yǎng)基換成mESC培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2天換液一次；(7)細胞長至第13天左右，挑克隆，將mESC樣的克隆挑至新的飼養(yǎng)層細胞上，用mESC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，擴增；得到小鼠iPS細胞；(四)小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞(I)小鼠iPS細胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培養(yǎng)基重懸于IOOmm細胞培養(yǎng)皿中，50分鐘后吸出上清，用細胞計數(shù)板計數(shù)；(2)將所需的分別含目的基因rox-l，NeuroD, MafA的腺病毒載體Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一個 15ml 離心管中，混勻后，用0.45 μ m過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；(3)將小鼠iPS細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，加入MEF培養(yǎng)基后重懸于超低吸附六孔板中，2ml/孔，讓病毒維持在MEF培養(yǎng)基中2天，第4天重復轉導胚體一次；(4) 6天后收集胚體，用MEF培養(yǎng)基重懸于普通六孔板中；(5)待大量細胞自胚 體爬出時消化傳代。本發(fā)明方法簡便、易操作、效果好。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1小鼠iPS細胞克隆在顯微鏡下的形態(tài)(X 200)圖。圖2 (A)第16代小鼠iPS細胞克隆的堿性磷酸酶染色(X 200) (B)第16代小鼠iPS細胞克隆的干細胞表面標記Nanog、ReX-l及SSEA-1的免疫熒光染色(X400) (C)小鼠iPS細胞干細胞內(nèi)源基因的RT-PCR檢測結果(D)小鼠iPS細胞的核型圖。圖3A)小鼠iPS細胞來源的胚體在體視顯微鏡下的形態(tài)(X60) (B)小鼠iPS細胞來源的胚體三胚層基因的RT-PCR檢測結果(C)小鼠iPS細胞形成畸胎瘤的HE染色。圖4是I3DX-UNeuroD和MafA轉染的小鼠iPS在熒光顯微鏡下同一視野的明視野及熒光圖(X 100)。圖5是定向誘導分化的小鼠iPS細胞外源性轉錄因子及胰島細胞功能基因的RT-PCR檢測結果使用圖。圖6是胰島素分泌細胞胰島素蛋白的表達(X 400)示意圖。圖7是定向誘導分化的小鼠iPS細胞在不同濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌量對比示意圖。圖8是細胞移植區(qū)胰島素表達的免疫組化檢測結果(A)正常胰島(X100) (B)鏈脲霉素破壞后的胰島(Xioo) (C)糖尿病小鼠肝臟注射區(qū)(X40)⑶圖C局部放大圖(X100)。圖9是移植組和未移植組糖尿病小鼠7周的空腹血糖值不意圖。
具體實施例方式材料:健康C57BL/6J 小鼠(南通大學實驗動物中心)，LV-ef la-Hygromicin-TRE-0ct4/Sox2/Klf4/cMyc及表達rtTA的慢病毒載體(上海Sidansai公司)，293T細胞(Invitrogen), pVSVG, delta8.91 (Invitrogen), HIVp24ELISA (Cell Biolabs),轉染試劑 Fugene (Roche), polybrene (Sigma), Opt1-MEM 培養(yǎng)液(Invitrogen) ,0.25%Trypsin/EDTA (Sigma), DMEM 低糖培養(yǎng)基(Hyclone),胎牛血清(Gibco),谷氨酰胺(Sigma), PBS緩沖液(Hyclone),必需氨基酸(Sigma),絲裂霉素 C (Sigma), LIF (Prospec), DEPC(Sigma),微量 RNA 提取試劑盒(OMEGA), RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit (Fermentas),瓊脂糖(Takara), Goldenview (上海賽百盛)，堿性磷酸酶染色試劑盒(Millipore), DNAMarker DL2000 (TaKaRa), PCR 試劑盒(Fermantas),兔抗小鼠膜島素多克隆抗體(Santa Cruz), Cy3羊抗兔突光抗體(Proteintech),小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(Mercodia), Triton X-100 (Sigma),牛血清白蛋白(Sigma), Hochest (Sigma),鏈服霉素(Sigma),明膠(Sigma), knockout DMEM (Gibco), β -巰基乙醇(Sigma),抗突光淬滅封片液(碧云天公司)，羊抗小鼠Rex-1IgG抗體(Santa Cruz SC-50668),兔抗小鼠Nanog IgG抗體(Santa CruzSC-33760)，小鼠抗小鼠 SSEA-1IgM 抗體(Abeam abl6285), FITC 驢抗羊突光抗體(Proteintech)，Texas Red羊抗兔突光抗體(Proteintech)，Cy3羊抗小鼠突光抗體(Proteintech)，C02細胞培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)，生物安全柜(美國Thermo公司)，正置、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀(美國BIO-RAD公司)，PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，生物分光光度計(美國MPLEN公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),體視顯微鏡(日本Olympus公司)1、含目的基因PDX-1，NeuroD, MafA腺病毒載體

由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供。2、含目的基因PDX-1，NeuroD, MafA腺病毒包裝(I)轉染前質粒的準備1.1重組質粒Pac I單酶切，37°C酶切2h。1.2采用經(jīng)典酚氯仿抽提法對單酶切質粒進行純化，用紫外分光光度計測定純化質權濃度。(2)轉染2.1取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293A細胞，用0.05%胰酶消化，細胞計數(shù)后，按照每孔4.5X105個細胞，種于6孔板，37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；2.2第二天轉染前移去培養(yǎng)液，換2ml Opt1-MEM培養(yǎng)液；2.3取2 μ g線性化的質粒加入250 μ I Opt1-MEM (經(jīng)37°C預熱)中，輕輕混勻；2.4 取 5 μ I lipofectamine2000 加入 250 μ I Opt1-MEM 中，輕輕混勻，室溫放置5min ；2.5將500 μ I復合物加入到細胞孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37°C，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時后,換上完全培養(yǎng)液,繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2.6轉染后48小時，用0.05%胰酶消化；并細胞轉移至IOcm培養(yǎng)皿中，加入IOml
完全培養(yǎng)基；
2.7每2-3天換入新鮮培養(yǎng)基，觀察是否有病變效應出現(xiàn)；2.8讓感染繼續(xù)發(fā)生，直至80%細胞出現(xiàn)病變效應。收集細胞及上清液至滅菌的15ml離心管，_80°C保存。(3)用反復凍融法使病毒從細胞中釋放出來，離心收集初級病毒液。(4)初級病毒液的擴增4.1病毒感染前一天對293A細胞進行計數(shù)，在IOcm培養(yǎng)皿中以3X IO6細胞種板，以保證轉導時細胞密度達到90%。4.2感染時在IOcm皿中加入100 μ I初級病毒液，輕輕混勻。4.3在37°C，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80-90%細胞變圓并漂浮。4.4收集細胞至滅菌的15ml離心管。4.5將收集的細胞置于_80°C，30分鐘，隨后置于37°C 15分鐘。反復凍融3次使病毒從細胞中釋放出來。4.6室溫下3000rpm離心15分鐘，除去細胞碎片。4.7將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于1.5ml DMEM培養(yǎng)液中，分裝小管，放置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br>
(5)腺病毒的滴度測定采用免疫法檢測腺病毒滴度，原理是通過抗腺病毒的多抗與感染了腺病毒供試樣品的細胞結合，再用辣根過氧化物酶標記的二抗(辣根過氧化物酶標記的兔抗)與一抗(兔抗腺病毒多抗)結合，經(jīng)顯色液顯色，被感染的細胞顯示出明顯的棕色，通過計數(shù)及計算，即可確定腺病毒的滴度。3、含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表達rtTA的慢病毒由上海斯丹賽生物技術有限公司提供。4、小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)細胞的制備(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合籠。(2)每天早上觀察母小鼠陰道口，有陰道栓確定為懷孕，見栓當天上午定為懷孕的0.5 天。(3)取懷孕12.5 13.5天母鼠，斷頸處死，取出胎鼠，將胎鼠軀干部分置于另一盛有PBS平皿內(nèi)，用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞。(7)用顯微剪將鼠胚軀干剪成1_3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)。(8)室溫下靜置5分鐘，棄上層液，留下胚胎組織碎塊。(9)向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內(nèi)加入2ml0.05%胰蛋白酶，輕輕吹吸30秒，靜置5分鐘后吸出上清于MEF培養(yǎng)基(DMEM低糖+10%FBS+4mmol/L谷氨酰胺)中，反復多次以上操作直至組織塊消失。(10)離心后重懸細胞于MEF培養(yǎng)基中，待細胞80%_90%融合時傳代或凍存。(11)在第3 5代MEFs的培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素C，使絲裂霉素C的終濃度為10 μ g/ml，放回培養(yǎng)箱處理2.5小時。(12)將0.1%明膠水溶液吸入培養(yǎng)瓶內(nèi)，覆蓋培養(yǎng)瓶底面，室溫下靜置2小時后吸棄明膠水溶液，用PBS洗滌一次。(13)棄含有絲裂霉素C的MEFs培養(yǎng)上清，PBS洗滌5遍。
(14)消化經(jīng)絲裂霉素C處理的MEFs，種植到預先用明膠處理過的培養(yǎng)瓶內(nèi)(種植的細胞數(shù)為6 X IO4個/cm2)。(15)待細胞貼壁后進行觀察，如細胞過稀則補加細胞，保證細胞能連成一片而沒有間隙，得飼養(yǎng)層細胞。(16)將制備好的飼養(yǎng)層細胞放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用。在5天內(nèi)使用，使用前要更換培養(yǎng)基為胚胎干細胞培養(yǎng)基。5、MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞(I)先用0.1%明膠預包被一個T25瓶，包被時間約為10分鐘。(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一個15ml離心管中，用血小板計數(shù)板計數(shù)，取出IXIO5個細胞用于感染實驗所需的細胞量。(3)將所需的含有目的基因0ct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒(LV-efla-Hygromicin-TRE-0ct4> LV-efla-Hygromicin-TRE-Sox2>LV-ef Ia-Hygromicin-TRE-Klf4>LV-ef Ia-Hygromicin-TRE-cMyc)及表達 rtTA 的慢病毒加入一個15ml離心管中，混勻后，用0.45 μ m過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；(4)將IXlO5的細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，溶液體積最后補足至5ml，最后加入5 μ I助轉劑polybrene (使用濃度為10 μ g/ml),將整個體系混勻后,轉移到已經(jīng)預包被好的T25瓶中，搖勻后放入37° C培養(yǎng)箱中，10小時后去病毒。(5)將慢病毒感 染后的細胞用0.25%trypsin/EDTA消化下來，按六孔板每孔IX IO4的細胞量鋪到事先準備好的飼養(yǎng)層細胞上。(6)第2天，將MEF培養(yǎng)基換成mESC培養(yǎng)基(knockout DMEM+15%FBS+1 X必需氨基酸+1XL-G+0.1mM β -巰基乙醇+LIF1000U/ml )，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2天換液一次。(7)細胞長至第13天左右，可以挑克隆，將mESC樣的克隆挑至新的飼養(yǎng)層細胞上，用mESC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，擴增。6、堿性磷酸酶染色(I)吸出細胞培養(yǎng)液，用PBS潤洗2-3次，用多聚甲醛固定1-2分鐘。(2)吸出固定液，用PBS洗2次。(3)吸出 PBS，用 TBST 潤洗一次。(4)準備堿性磷酸酶試劑(上海斯丹賽生物技術有限公司):溶液A:溶液B:溶液C=50y 1:50 μ 1:400 μ I。加足量的染色試劑使染色液能足夠覆蓋孔底，室溫避光放置15分鐘。吸出染色液，用PBS緩沖液潤洗一次，最后保持于PBS中，顯微鏡下觀察結果。7、核型分析(I) 40 μ g/ml秋水仙素處理3小時，終止培養(yǎng)，PBS洗一次。(2)低滲氯化鉀(0.075mol/L)處理30分鐘。(3)滴加少量固定液(冰醋酸:甲醇為1:3)預固定I分鐘，離心1500rpmX5分鐘。(4)去上清液，保留1ml，輕輕吹打懸起，緩慢加入5ml固定液，30分鐘后離心1500rpmX 5 分鐘。(5)重復步驟(4)兩遍。(6)滴片(載玻片要事先放在冰水浴中，取出玻片后不要等玻片溫度上升及干燥就從聞處滴片)。(7) 80°C烤片3小時后取出置室溫，胰酶消化后吉姆薩染色10分鐘顯帶。(8)鏡檢。8、擬胚體形成小鼠iPS細胞擴增培養(yǎng)后，按正常傳代步驟消化下來，洗滌去除飼養(yǎng)細胞，吹打成單細胞后懸浮培養(yǎng)在MEF培養(yǎng)基中。3天后換第一次液，之后每2-3天換液一次。收集擬胚體后用Trizol裂解，抽提RNA，_80°C保存待檢測。9、畸胎瘤形成實驗將得到的小鼠iPS細胞系傳代培養(yǎng)至10代以上后，消化洗滌，去除飼養(yǎng)細胞后懸浮在小于400 μ I的培養(yǎng)液中，無菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每個注射點的細胞量約為2-3 X 106。8周后取出畸胎瘤進行HE染色，觀察分化為三胚層情況。10、RT-PCR10.1細胞總RNA的提取(I)將細胞培養(yǎng)基去掉，用DEPC水洗一遍，加Iml Trizol裂解約5分鐘。(2)每使用Iml Trizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，靜置約2_3分鐘。(3)4°C 12 000Xg離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。(4)把水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用Im Trizol加入
0.5ml異丙醇，靜置10分鐘。(5)4°C 12000Xg離心10分鐘，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清。(6)用75%乙醇洗滌RNA沉淀，加lml75%乙醇，4°C 7500g離心5分鐘，棄上清。(7)室溫放置干燥RNA沉淀，大約晾5_10分鐘，加入50-100 μ I無RNase的水，用槍頭吸打幾次溶解RNA，紫外分光光度計測RNA濃度后-80°C保存。10.2 第一鏈 cDNA 合成( I)取出逆轉錄試劑盒置于冰上融化，混勻。(2)取各組模板 RNA0.lng-5 μ g, oligo (dT) 18primerl μ I,再加 nuclease-freewater 至 12 μ I。(3)按以下組份繼續(xù)添加至無菌的nuclease-free的離心管中。(4)混勻并離心，42° C孵育60分鐘。(5)70° C孵育5分鐘終止反應。10.3PCR 擴增反應條件:94°C預變性5分鐘，后經(jīng)過35個循環(huán)的94°C變性30秒、55_60°C退火30秒、72 °C延伸30秒，最后72°C總延伸10分鐘。10.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳PCR 結束后，每管加入 6 X loading buffer4 μ I (如為 Dream TaqTM GreenPCRMaster Mix (2 X)則不需加6 X loading buffer)，混勻后取10 μ I上樣，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結果。11、細胞免疫熒光(I)首先把細胞固定在4%多聚甲醛中，室溫放置30分鐘。
(2)在無水乙醇中浸泡3次，每次10分鐘(限于核蛋白)。(3)吸干上述溶液，先用I XPBS洗滌一次，再用抗體稀釋液(0.2%牛血清白蛋白和
0.l%TritonX100 溶于 PBS)洗滌 2 次。(4)用封閉液(含6%牛血清白蛋白+0.3%TritonX100的PBS溶液)封閉細胞。(5)將一抗稀釋在抗體稀釋液中，加到樣品上，4°C放置過夜。(6)用 PBT (0.l%TritonX100)洗滌細胞 3 — 5 次。(7)將二 抗稀釋在抗體稀釋液中，并加到細胞樣品上，室溫放置I小時(從步驟7開始，樣品要注意避光)。(8)用 PBT 洗滌 3 次。(9)將hochest (lmg/ml)母液以1: 1000用PBS稀釋,室溫放置30分鐘。(10)用PBS洗滌3次，每次5分鐘。12、小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞(I)小鼠iPS細胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培養(yǎng)基重懸于IOOmm細胞培養(yǎng)皿中，50分鐘后吸出上清，用細胞計數(shù)板計數(shù)。(2)測定病毒感染靶細胞的最適病毒滴度，將所需的Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad -mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一個 15ml 離心管中，混勻后，用 0.45 μ m 過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質。(3)將小鼠iPS細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，加入MEF培養(yǎng)基后重懸于超低吸附六孔板中(2ml/孔)，讓病毒維持在MEF培養(yǎng)基中2天，第4天重復轉導胚體一次(24小時)。(4) 6天后收集胚體，用MEF培養(yǎng)基重懸于普通六孔板中。(5)待大量細胞自胚體爬出時消化傳代，備下一步實驗用。13、ELISA13.1標本收集(I)取受染11天的分化細胞，吸去培養(yǎng)液，加入KRB緩沖液預培養(yǎng)I小時。(2)吸去緩沖液，再加入不同葡萄糖濃度的KRB緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)I小時。(3)將緩沖液收集-80°C保存待檢測。13.2操作步驟(I)提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒及標本，平衡至室溫。(2)以酶結合物稀釋液稀釋酶結合物(1:10)，臨用前15分鐘配好。(3)以雙蒸水稀釋洗滌液(1:20)，臨用前15分鐘配好。(4)取出板條，吸出10 μ I標準品和標本加入相應的孔中。(5)每孔加入100 μ I酶結合物稀釋液。(6)封板膠紙封住反應孔，室溫下在搖床上反應2小時。(7)每孔加入350 μ I洗滌液，洗板6次。(8)每孔加入200 μ I顯色液,室溫避光孵育15分鐘。(9)每孔加入50 μ I終止液，充分混勻。(10)多功能酶標儀(450nm吸光度)測量結果。14、細胞移植
14.1糖尿病動物模型的建立(I) 12-16周的C57BL/6J小鼠共18只，雌雄各半，隨機分為3組(n=6)，第一組為糖尿病小鼠未移植組(糖尿病未移植組)，第二組為糖尿病小鼠肝臟注射轉PDX-l+NeuroD+MafA iPSCs組(糖尿病移植組)，第3組為無糖尿病正常小鼠組(健康對照組)。(2)鏈脲霉素以160mg/kg的劑量注射到第一、二組每只小鼠腹腔內(nèi)，健康對照組不予處理。(3)監(jiān)測小鼠空腹血糖。14.2體外獲取的胰島素分泌細胞移植至糖尿病小鼠肝臟(I)待小鼠鏈脲霉素注射后7天，將胰島素分泌細胞計數(shù)后用少量完培重懸。(2)細胞移植前小鼠以3%戊巴比妥鈉按50mg/kg腹腔注射麻醉。(3)糖尿病小鼠麻醉后固定消毒，手術進腹，胰島素分泌細胞懸液100 μ I注射到肝左葉。(4)移植后每三天測定糖尿病小鼠空腹血糖。15、免疫組化檢測(I)細胞移植后9天處死實驗及正常小鼠，取出肝臟及胰腺，10%福爾馬林固定48小時。 (2)行石蠟包埋切片，片厚ΙΟμπι。(3)石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS洗3次X3分鐘。(4)用pH6.0,0.0lMCB熱誘導修復(微波3檔20分鐘)，室溫自然冷卻，PBS洗3次X 3分鐘。(5)0.3%Η202室溫下抑制內(nèi)源性過氧化物酶20分鐘。(6 ) PBS 洗 3 次 X 3 分鐘。(7) 20%正常羊血清室溫孵育30分鐘，不洗。(8)滴加一抗兔抗小鼠胰島素多克隆抗體(1:100) 37°C孵育2小時。(9 ) PBS 洗 3 次 X 3 分鐘。(10) EnVision 試劑(HRP/R) 37°C 30 分鐘。(11) PBS 洗 3 次 X3 分鐘。(12) DAB 顯色 8-12 分鐘。(13)蘇木素染色，熱水藍化。(14)吹干后，樹脂封片。(15)顯微鏡鏡檢。16、統(tǒng)計學處理每組數(shù)據(jù)來自3次獨立的實驗，所有數(shù)據(jù)均以Z±s表示，用STATA7.0軟件進行One-Way-ANOVA分析。結果P〈0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
權利要求
1.一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征是:包括下列步驟: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包裝 (1)轉染前質粒的準備 ·1.1重組質粒Pac I單酶切，37°C酶切2h ；· 1.2 采用經(jīng)典酚氯仿抽提法對單酶切質粒進行純化，用紫外分光光度計測定純化質粒濃度； (2)轉染 ·2.1取處于對數(shù)生長期的29 3A細胞，用0.05%胰酶消化，細胞計數(shù)后，按照每孔·4.5X105個細胞，種于6孔板，37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜； ·2.2第二天轉染前移去培養(yǎng)液，換2ml Opt1-MEM培養(yǎng)液； ·2.3取2Pg線性化的質粒加入250μ1經(jīng)37°C預熱的Opt1-MEM中，混勻； ·2.4 取 5μ1 lipofectamine2000 加入 250μ1 Opt1-ΜΕΜ 中，混勻，室溫放置 5min ； · 2.5將500μ1復合物加入到細胞孔中，搖動培養(yǎng)板，混勻；在37°C，5 %的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時后,換上完全培養(yǎng)液,繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； ·2.6轉染后48小時，用0.05%胰酶消化細胞，并轉移至IOcm培養(yǎng)皿中，加入IOml完全培養(yǎng)基； ·2.7每2-3天換入新鮮培養(yǎng)基，觀察是否有病變效應出現(xiàn)； ·2.8讓感染繼續(xù)發(fā)生，直至80%細胞出現(xiàn)病變效應；收集細胞及上清液至滅菌的15ml離心管，-80°C保存； (3)用反復凍融法使病毒從細胞中釋放出來，離心收集初級病毒液； (4)初級病毒液的擴增 ·· 4.1病毒感染前一天對293A細胞進行計數(shù)，在IOcm培養(yǎng)皿中以3X IO6細胞種板，以保證轉導時細胞密度達到90% ； ·4.2感染時在IOcm皿中加入ΙΟΟμΙ初級病毒液，混勻； `4.3在37°C，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80-90%細胞變圓并漂?。籤 ·4.4收集細胞至滅菌的15ml離心管； `4.5將收集的細胞置于-80°C，30分鐘，隨后置于37°C 15分鐘；反復凍融3次使病毒從細胞中釋放出來； `4.6室溫下3000rpm離心15分鐘，除去細胞碎片； `4.7將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于1.5ml DMEM培養(yǎng)液中，分裝小管，放置于-80°C保存?zhèn)溆茫? (二)小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)細胞的制備 (O性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合籠；(2)每天早上觀察母小鼠陰道口，有陰道栓確定為懷孕，見栓當天上午定為懷孕的0.5天; (3)取懷孕12.5 13.5天母鼠，斷頸處死，取出胎鼠，將胎鼠軀干部分置于一盛有PBS的平皿內(nèi)，用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞； (4)用顯微剪將鼠胚軀干剪成1_3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)；(5)室溫下靜置5分鐘，棄上層液，留下胚胎組織碎塊； (6)向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內(nèi)加入2ml0.05%胰蛋白酶，輕輕吹吸30秒，靜置5分鐘后吸出上清于MEF培養(yǎng)基中，反復多次以上操作直至組織塊消失； (7)離心后重懸細胞于MEF培養(yǎng)基中，待細胞80%-90%融合時傳代或凍存； (8)在第3 5代MEFs的培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素C，使絲裂霉素C的終濃度為IOPg/ml，放回培養(yǎng)箱處理2.5小時； (9)將0.1%明膠水溶液吸入培養(yǎng)瓶內(nèi)，覆蓋培養(yǎng)瓶底面，室溫下靜置2小時后吸棄明膠水溶液，用PBS洗滌一次； (10)棄含有絲裂霉素C的MEFs培養(yǎng)上清，PBS洗滌5遍； (11)消化經(jīng)絲裂霉素C處理的MEFs，種植到預先用明膠處理過的培養(yǎng)瓶內(nèi)，種植的細胞數(shù)為6 X IO4個Zcm2 ； (12)待細胞貼壁后進行觀察，如細胞過稀則補加細胞，保證細胞能連成一片而沒有間隙，為飼養(yǎng)層細胞； (13)將制備好的飼養(yǎng)層細胞放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用；在5天內(nèi)使用，使用前要更換培養(yǎng)基為胚胎干細胞培養(yǎng)基； (三)MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞 (1)先用0.1%明膠預包被一個T25瓶，包被時間為10分鐘；(2)用0.25% trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一個15ml離心管中，用血小板計數(shù)板計數(shù)，取出IX IO5個細胞用于感染實驗所需的細胞量； (3)將所需的含有目的基因0ct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表達rtTA的慢病毒加入一個15ml離心管中，混勻后，用0.45ΜΠ1過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質； (4)將IXlO5的細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，溶液體積最后補足至5ml，最后加入5μ1助轉劑polybrene,助轉劑polybrene使用濃度為10Pg/ml,將整個體系混勻后,轉移到已經(jīng)預包被好的T25瓶中，搖勻后放入37° C培養(yǎng)箱中，10小時后去病毒； (5)將上述慢病毒感染后的細胞用0.25%trypsin/EDTA消化下來，按六孔板每孔IXlO4的細胞量鋪到事先準備好的飼養(yǎng)層細胞上； (6)第2天，將MEF培養(yǎng)基換成mESC培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2天換液一次； (7)細胞長至第13天左右，挑克隆，將mESC樣的克隆挑至新的飼養(yǎng)層細胞上，用mESC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，擴增；得到小鼠iPS細胞； (四)小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞 Cl)小鼠iPS細胞用0.25% trypsin/EDTA消化后用mESC培養(yǎng)基重懸于IOOmm細胞培養(yǎng)皿中，50分鐘后吸出上清，用細胞計數(shù)板計數(shù)； (2)將所需的分別含目的基因roX-1，NeuroD,MafA的腺病毒載體Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一個 15ml 離心管中，混勻后，用0.45Mffl過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質； (3)將小鼠iPS細胞加入已經(jīng)過濾好的病毒溶液中，加入MEF培養(yǎng)基后重懸于超低吸附六孔板中，2ml/孔，讓病毒維持在MEF培養(yǎng)基中2天，第4天重復轉導胚體一次； (4)6天后收集胚體，用MEF培養(yǎng)基重懸于普通六孔板中； (5)待大量細胞自胚體爬出時消化傳代。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包裝、小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)細胞的制備、MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞、小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞。本發(fā)明方法簡便、易操作、效果好。
文檔編號C12N5/10GK103146754SQ20131004432
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權日2013年2月4日
發(fā)明者王志偉, 朱銘巖, 范向軍, 陸玉華, 朱沙俊, 王堯, 郭青松, 王雷, 黃龑, 薄祥坤, 常旭, 袁驍琪, 張?zhí)?申請人:南通大學附屬醫(yī)院