專利名稱：用于口服胰島素遞送的pH敏感性納米粒子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的納米粒子和其制備方法，特別涉及pH敏感性納米粒子和其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病的特征是血液葡萄糖含量長期保持很高。到2007年為止，全世界有大約250，000, 000名糖尿病患者，特別是在不發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家。據(jù)估計到2025年為止將會有380，000, 000名患者。因此，糖尿病是一個嚴(yán)重的全球性問題。因為胰島素的半衰期短并且在胃腸道中發(fā)生降解，所以胰島素以液體注射形式遞送以用于治療糖尿病。它必須頻繁地提供給患者，這會帶來極大的不便和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。亟需針對胰島素開發(fā)一種更方便的非注射形式。已經(jīng)廣泛研究了口服劑型。胰島素pH敏感性納米粒子可以控制胰島素釋放并提高其口服生物利用度。PCT公布第W02010113177-A2號公開一種口服胰島素pH敏感性藥劑，其包含胰島素和Eudragit LlOO0所述藥劑在粒度40 μ m時顯示良好的pH敏感性,然而,這一粒度不適合于胰島素吸收。此外，該公開的制備技術(shù)具有某些局限，因為所需的包含液體石蠟的藥劑的復(fù)乳液是不穩(wěn)定的，且溶劑的蒸發(fā)較慢。專利申請公布第US2010021549-A1號提供一種核-殼粒子，其包含胰島素和pH敏感性聚合物。所述PH敏感性聚合物是HPMCP和HPMCAS。胰島素從粒子中的釋放在酸性介質(zhì)中慢，而在中性介質(zhì)中快。所述粒子是通過流化床噴霧技術(shù)制備，粒度為2_。論文(JPharm Sci_US，2007，96，421)描述一種由 HP55 和 PLGA 組成的口服胰島素PH敏感性納米粒子。所述納米粒子是通過溶劑揮發(fā)法制備。在這種方法中，聚合物和胰島素兩者都溶解于含水溶劑中，這具有某些局限性。雖然在濃度較高時容易發(fā)生相分離，但這種方法的缺點為封裝效率較低。此外，雖然胰島素容易向外擴(kuò)散，但PH敏感性卻較低。HP55是一種pH敏感性纖維素包衣，它被設(shè)計用于腸溶包衣物質(zhì)中。HP55可以經(jīng)受住與酸性胃環(huán)境的長時間接觸，但在小腸的微酸性到中性的流體中容易溶解。當(dāng)用于制備負(fù)載胰島素的納米粒子時，HP55能夠減少胃中的胰島素釋放且因此增加生物利用度。然而，仍然需要可口服遞送且具有增加的生物利用度的胰島素粒子，以及制備高產(chǎn)量的所述胰島素粒子的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是使用經(jīng)過改進(jìn)的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法(double emulsionsolvent evaporation method)(也稱作復(fù)乳溶劑揮發(fā)法)來提供新穎且有效的用于口服胰島素遞送的PH敏感性納米粒子。負(fù)載胰島素的納米粒子對pH變化具有敏感性，且因此可以快速溶解于小腸的上部區(qū)域并釋放胰島素。PH敏感性納米粒子可以被配置為控制胰島素釋放并提高其口服生物利用度。通過將兩種不同的溶劑與溶解的聚合物、PH敏感性聚合物和生物可降解的聚合物進(jìn)行混合，以及通過使用胰島素溶液和聚乙烯醇(PVA)溶液，可以通過超聲乳化來形成復(fù)乳液，且溶劑的蒸發(fā)引起最終形成PH敏感性納米粒子。與通過常規(guī)的單乳溶劑擴(kuò)散方法制備的粒子相比，發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備的PH敏感性納米粒子可以增加胰島素的生物利用度。本發(fā)明的方法增加現(xiàn)有技術(shù)特有的一個步驟，也就是通過復(fù)乳來產(chǎn)生納米粒子。復(fù)乳形成步驟包載親水藥物，并且可以快速蒸發(fā)溶劑以形成納米粒子。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于其可以從PH敏感性納米粒子中完全釋放出胰島素。本發(fā)明還具有避免低包封率的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)僅提供了約65%的包封率，但使用本發(fā)明的方法可以獲得高達(dá)95%的包封率。本發(fā)明還提供其它優(yōu)勢，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)生更好的pH敏感性的胰島素釋放。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于封裝胰島素以形成pH敏感性納米粒子的方法，所述方法包含形成內(nèi)水相，所述內(nèi)水相包含濃度范圍為5到lOmg/mL的胰島素溶液；形成油相，所述油相包含濃度范圍為20到50mg/mL的HP55與聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)的二氯甲烷/丙酮溶液；形成外水相，所述外水相包含濃度范圍為I到10mg/mL的PVA溶液作為穩(wěn)定劑；形成初乳液，所述初乳液包含體積為O. 5到ImL的內(nèi)部水相和體積為
3到5mL的油相，其中所述初乳液是通過在40到60w的功率范圍下進(jìn)行超聲乳化并持續(xù)30到60s的時間范圍而形成；形成復(fù)乳液，所述復(fù)乳液包含體積為3. 5到6mL的初始乳液和體積為20到40mL的外部含水相，其中所述復(fù)乳液是通過在40到60w的功率范圍下進(jìn)行超聲乳化并持續(xù)60到120s的時間范圍而形成；通過從復(fù)乳液中蒸發(fā)二氯甲烷/丙酮而形成負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子；通過離心和水洗PLGA/HP55納米粒子三次而形成純化的負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子；通過冷凍干燥純化的負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子而形成陽離子性的PH敏感性納米粒子。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供pH敏感性納米粒子。所述納米粒子是通過本文所述的方法制造。本發(fā)明的方法產(chǎn)生比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法形成的納米粒子具有更好的物理特征、生物利用度和生物活性的產(chǎn)品。PH敏感的納米粒子的聚合物是羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)，所述HPMCP選自由HP50和HP55組成的組。在一個示例性實施方案中，使用HP55作為pH敏感性聚合物以用于制備本發(fā)明的納米粒子。此外，通過所述方法制備的每個納米粒子都另外包含疏水聚合物，具有生物可降解特性。


圖I顯示負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子的SEM圖像。圖2顯示在pH = 7.4PBS(左圖)和pH = 1.2HC1 (右圖)中，胰島素從具有不同量的HP55的納米粒子中的體外釋放性質(zhì)。圖3顯示在代表性體外研究中，在模擬胃腸介質(zhì)中pH敏感性納米粒子的胰島素藥物釋放曲線圖。圖4顯示在對疾病模型口服施用負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子或皮下施用胰島素溶液之后血液葡萄糖含量與時間的曲線圖。圖5顯示在對疾病模型口服施用負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子或皮下施用胰島素溶液之后血清胰島素含量與時間的曲線圖。
具體實施方式
定義I.胰島素如本文所用的術(shù)語“胰島素”是指任何天然存在的胰島素或重組胰島素。因此，用于本發(fā)明的胰島素包括例如胰島素類似物和衍生物?？梢允褂脕碜匀魏芜m合物種的胰島素，例如人、豬、牛、狗、羊。在一個優(yōu)選實施方案中，胰島素是豬胰島素。豬胰島素是經(jīng)過糖基化的雙鏈多肽鏈，其含有51個氨基酸且具有5，777道爾頓的分子量。α和β鏈通過兩個鏈間二硫鍵連接起來。α鏈含有一個鏈內(nèi)二硫鍵。胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和儲存，并且抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。具有各種程度的生物活性的胰島素能夠購買得到。舉例來說，可以購買到慢效形式、中效形式和快效形式的胰島素。在一個優(yōu)選實施方案中，豬胰島素的生物活性范圍是27到28IU/mg。II. pH敏感性納米粒子如本文所用，pH敏感性納米粒子是指在胃酸環(huán)境中具有穩(wěn)定性且在腸環(huán)境中釋放胰島素的納米粒子。pH敏感性納米粒子包含pH敏感性聚合物，典型地是HP55。HP55在醫(yī)藥工業(yè)中廣泛用作腸溶包衣聚合物。其具有高含量(31%)的鄰苯二甲酸酯基團(tuán)。HP55不能直接溶解在二氯甲烷中，這是使用傳統(tǒng)的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法無法制造基于HP55的納米粒子的主要原因。用于本發(fā)明的基于HP55的納米粒子可以通過經(jīng)改進(jìn)的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法來制備，所述經(jīng)改進(jìn)的方法使用二氯甲烷與丙酮的混合物作為溶劑來溶解HP55和其它聚合物。實施例實施例I負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子的制備通過兩種不同的方法，使用HP55作為pH敏感性物質(zhì)/聚合物來制備PLGA/HP55納米粒子。方法A :將HP55溶解于丙酮與乙醇的有機(jī)相中以形成混合物，所述混合物用作PLGA納米粒子的包衣以形成PLGA/HP55納米粒子。方法B :將PLGA和HP55都溶解于有機(jī)相二氯甲烷與丙酮中以形成混合物，所述混合物直接用于形成PLGA/HP55納米粒子。表 I
HP55的加入方式方法A方法B
粒度，nm303.8+25.4181.9+19,0封裝效率，%74.54+1.0194.25+1.24如表I所示，方法B中的納米粒子的封裝效率高于方法A。方法A中的封裝效率較低的原因是(i)在長時間的磁力攪拌期間，胰島素容易擴(kuò)散到外層水相中，和(ii)部分HP55在水洗過程中發(fā)生溶解，導(dǎo)致胰島素的保護(hù)層變薄。此外，方法A所制備的納米粒子具有不規(guī)則的形狀。一些粒子形成聚集體。相比之下，方法B所制備的納米粒子是球形，且粒度較小。因此，方法B是用于制備負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子的一個優(yōu)選實施方案。負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子是如下制備分別將胰島素(5mg)溶解于作為內(nèi)部穩(wěn)定劑的O. 1% PVA(1. OmL, pH = 2)或甘油中以形成內(nèi)水相(Wl)，將聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA) (IOOmg)和HP55 (50mg)溶解于5mL有機(jī)溶劑(二氯甲烷與丙酮的體積比是
4 I或3 I)中以形成油相(O)。視情況而定，在將Wl倒入O之前，將疏水載體加入到油相(O)中。在25°C下，將ImL Wl倒入O中，并在60W下對混合物進(jìn)行超聲O. 5min以獲得初始W1/0乳液。將初始乳液迅速倒入含有I. 0% PVA的外水相(IOmL) (W2)中，并在60W下對混合物進(jìn)行超聲4min以獲得W1/0/W2復(fù)乳液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(45°C, 451mbar, 15min)完全除去復(fù)乳液中的丙酮和二氯甲烷。對殘留物進(jìn)行離心(10°C，20，000rpm，10min)。最后，在用蒸餾水洗滌至少兩次并進(jìn)行冷凍干燥之后，從沉淀物獲得PH敏感性納米粒子。本發(fā)明中所用的PVA的分子量是31，000到50，000道爾頓。本發(fā)明中所用的疏水聚合物或載體的分子量是20，000到40，000道爾頓。實施例2負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子的表征圖I所示的SEM圖像表明載胰島素的PLGA/HP55納米粒子形貌為白色細(xì)粉末。實施例I中的從方法B制備的PLGA/HP55納米粒子具有181. 9±19. Onm的平均粒度，PDI是O. 093±0. 031。胰島素包封率是90. 85± I. 09%。本發(fā)明的方法中所用的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備的載胰島素的PLGA/HP55納米粒子具有高的包封率和較小的納米尺寸。實施例3胰島素體外釋放研究PLGA/HP55納米粒子上包覆的HP55的量將影響PLGA/HP55納米粒子的pH敏感性。因此，通過體外胰島素釋放研究來確定不同量的HP55對于PLGA/HP55納米粒子的pH敏感性的影響。在模擬胃腸液中評估不同量的HP55對于胰島素釋放特性的影響。圖2顯示在分別具有pH = 7. 4PBS(a)和pH = I. 2HC1 (b)的溶液中，胰島素從具有不同量的HP55的納米粒子中的體外釋放速率。具有不同量的HP55的PLGA/HP55納米粒子在pH = 7. 4PBS的情況下釋放超過75%的胰島素。當(dāng)PLGA和HP55都溶解于有機(jī)溶劑中以俘獲胰島素時，HP55與胰島素之間的相互作用要強(qiáng)于PLGA與胰島素之間的相互作用；大多數(shù)胰島素分子傾向于分散在HP55中而不是PLGA中。在pH = 7. 4PBS的情況下，HP55的羧基(-C00H)失去一個質(zhì)子而變?yōu)镃00_，從而增加其溶解度并促進(jìn)胰島素釋放。在pH = I. 2HC1的情況下當(dāng)HP55的量增加時，pH響應(yīng)性發(fā)生增加，且胰島素的釋放減少。當(dāng)HP55的量達(dá)到IOOmg時，只有20%的胰島素從PLGA/HP55納米粒子中釋放出來。然而，當(dāng)HP55的量超過IOOmg時，形成白色沉淀。圖3顯示pH敏感性研究中的代表性蛋白質(zhì)藥物(例如胰島素)體外釋放曲線圖，所述PH敏感性研究使用用于制備本發(fā)明的pH敏感性納米粒子的示例性組合物，其包含50mg PLGA> IOOmg HP55 和 IOmg 膜島素分子。實施例4糖尿病大鼠中口服載胰島素的PLGA/HP55納米粒體內(nèi)研究將載胰島素的PLGA/HP55納米粒子(50IU/kg) 口服施用給糖尿病大鼠。將純胰島
7素溶液(5IU/kg)皮下注射(SC)到糖尿病大鼠體內(nèi)以作為陽性對照。在預(yù)定時間點，從被處理的大鼠的尾部靜脈尖端收集血液樣品。通過血液葡萄糖含量相比初始值的變化百分比證實了降血液葡萄糖效果。圖4顯示純胰島素溶液和負(fù)載胰島素的PLGA/HP55納米粒子的降血液葡萄糖效果。血清樣品中的胰島素濃度與給藥時間關(guān)系如圖5所示。在口服載胰島素的PLGA/HP55納米粒子之后的血漿胰島素含量的藥物動力學(xué)參數(shù)見表2。HP55保護(hù)本發(fā)明的納米粒子不會被在胃道中酸和/或酶破壞。當(dāng)納米粒子到達(dá)腸道時，HP55/PLGA納米粒子迅速膨脹并釋放胰島素，從而產(chǎn)生顯著的降血液葡萄糖效果。血液葡萄糖含量在Ih內(nèi)降低約70%，這種降血液葡萄糖效果可持續(xù)6小時。表權(quán)利要求
1.一種pH敏感性納米粒子，其包含(a)胰島素、(b)疏水聚合物、(c) pH敏感性聚合物、(d)內(nèi)部穩(wěn)定劑和(e)外部含水穩(wěn)定劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PH敏感性納米粒子，其中所述疏水聚合物選自由聚乳酸、聚乳酸羥基乙酸共聚物(乳酸羥基乙酸的比率=85 15)、聚聚乳酸羥基乙酸共聚物(乳酸羥基乙酸的比率=75 25)、聚乳酸羥基乙酸共聚物(乳酸羥基乙酸的比率=50 50)組成的組，其中所述疏水聚合物的分子量在20，000到40，000道爾頓的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的pH敏感性納米粒子，其中所述pH敏感性聚合物是HPMCP，所述HPMCP選自由HP50和HP55組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pH敏感性納米粒子，其中所述pH敏感性聚合物是HP55。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的pH敏感性納米粒子，其中所述內(nèi)部穩(wěn)定劑選自由甘油和聚乙烯醇組成的組，其中所述外部含水穩(wěn)定劑是聚乙烯醇，且其中聚乙烯醇的分子量在31，000到50, 000道爾頓的范圍內(nèi)。
6.一種制備根據(jù)權(quán)利要求I所述的負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子的方法，所述方法包括(a)形成包含胰島素和內(nèi)部穩(wěn)定劑的溶液A;(b)形成包含疏水載體、pH敏感性聚合物以及溶劑二氯甲烷與丙酮的溶液B;(c)形成包含外部含水穩(wěn)定劑的溶液C;(d)通過第一次超聲乳化而形成包含溶液A和溶液B的初始乳液；(e)通過第二次超聲乳化而形成復(fù)乳液，其包含所述初始乳液和溶液C的外部含水穩(wěn)定劑；(f)通過蒸發(fā)所述溶劑、水洗、離心所述納米粒子和冷凍干燥而形成所述負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶液A是通過將一份所述胰島素溶解于作為所述內(nèi)部穩(wěn)定劑的兩份PH 2的O. I %聚乙烯醇中而形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶液B是通過將兩份聚乳酸羥基乙酸共聚物和一份HP55溶解于所述溶劑二氯甲烷與丙酮中而形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中O.5-ImL的所述溶液A倒入3_5mL的所述溶液B中以形成第一混合物，接著立即將所述第一混合物在40-60W下經(jīng)歷所述第一次超聲乳化30-60秒以形成所述初乳。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述復(fù)乳是通過混合3.5-6mL的所述初乳與20-40mL的所述溶液C以形成第二混合物，然后將所述第二混合物在40-60W下經(jīng)歷所述第二次超聲乳化60-120秒以形成所述復(fù)乳而形成。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子如下形成通過在45°C和451mbar下蒸發(fā)所述復(fù)乳中的溶劑15分鐘，并在10°C和20，OOOrpm下離心10分鐘以獲得殘留物，然后通過所述水洗至少兩次、接著進(jìn)行所述冷凍干燥使所述殘留物沉淀。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中二氯甲烷與丙酮的體積比具有4 I到3 I的范圍。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述納米粒子具有約100-300納米的平均粒度。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述胰島素的量是約5mg，而所述O.1%聚乙烯醇的體積是約10mL。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述聚乳酸羥基乙酸共聚物的量是約lOOmg，而HP55的量是50mg。
16.一種用于制備口服組合物的PH敏感性納米粒子，其由根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法制備。
17.一種用于遞送胰島素到有需要的受試對象的口服組合物，其包含多個根據(jù)權(quán)利要求I所述的pH敏感性納米粒子。
18.一種用于遞送胰島素到有需要的受試對象的口服組合物，其包含多個根據(jù)權(quán)利要求16所述的pH敏感性納米粒子。
19.一種藥學(xué)上可接受的載體，其包含一個或多個根據(jù)權(quán)利要求I所述的pH敏感性納米粒子。
20.一種藥學(xué)上可接受的載體，其包含一個或多個根據(jù)權(quán)利要求16所述的pH敏感性納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開由pH敏感性聚合物、疏水物質(zhì)、內(nèi)部穩(wěn)定劑、外部穩(wěn)定劑內(nèi)容物和胰島素藥物組成的pH敏感性納米粒子。本發(fā)明還包括一種用于制備pH敏感性納米粒子的方法，特別是復(fù)乳溶劑揮發(fā)方法。本發(fā)明的pH敏感性納米粒子在粒度100-300納米時顯示良好的pH敏感性。在經(jīng)過鏈脲佐菌素(streptozotocin；STZ)誘發(fā)的糖尿病大鼠體內(nèi)，在口服施用負(fù)載胰島素的pH敏感性納米粒子之后觀察到血液葡萄糖含量的顯著降低，且胰島素的生物利用度超過10％。
文檔編號A61K47/34GK102908627SQ20121028520
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者章莉娟, 凌莉, 周麗英, 吳志民, 郭新東, 蔣薇, 羅茜, 錢宇 申請人:納米及先進(jìn)材料研發(fā)院有限公司