專利名稱：歐洲白蠟樹種子提取物及其治療應(yīng)用的制作方法
歐洲白蠟樹種子提取物及其治療應(yīng)用
背景技術(shù)：
2型糖尿病(DM-2)是一種常見的全球性疾病，其特征在于胰島素缺乏和胰島素不 敏感。DM-2被認為是一種嚴重疾病，造成與高發(fā)病率和死亡率相關(guān)的健康問題，并且是美國 的第六大致死病因[MinifiO等，2007，National Vital Statistical R印ort，55]。預(yù)計到 2025年全球糖尿病患者數(shù)量將增至3億[King等，1998，Diabetes Care，21，1414-31]。在 美國，7%的人口 (即2080萬小孩和成年人)會受到糖尿病的侵襲[French, 2007, Inside, 12，46-7]，在2002年，美國在醫(yī)療費用和喪失生產(chǎn)力上的費用估計為1320億美元[Hogan 等，2003，Diabetes Care，26，917-32]。DM-2的治療方法包括使用胰島素、胰島素類似物或 修飾胰島素，增加胰島素釋放和提高胰島素作用，抑制肝葡萄糖的生成以及抑制葡萄糖攝 取[Moller，2001，Nature，414，821-27]。除這些治療劑之外，治療DM-2的傳統(tǒng)藥物也在世 界各地使用。超過1200種生物已在民族醫(yī)藥中或試驗性用于治療DM-2的癥狀[Maries and Farnsworth, 1996, Protocol J. Botanical Med. ,1,85-137]。普遍公認的是，迅速上升的肥胖流行成為美國一個嚴重的公共健康問題。根 據(jù) 1999-2000 年美國衛(wèi)生與營養(yǎng)調(diào)查(National Health andNutrition Examination Survey, NHANES)的數(shù)據(jù)，幾乎2/3(64. 5% )的美國成年人超重，與在1988年至1994年期 間進行的NHANES III研究的數(shù)據(jù)55. 9%形成對比。在此期間，肥胖的發(fā)病率也從22. 9%顯 著增至30.5%。肥胖者數(shù)量的增加很可能有發(fā)生各種肥胖相關(guān)疾病(包括糖尿病)的高風(fēng) 險[Flegal 等，2002，JAMA. 288，1723-1727 以及 Kuczmarski 等 1994，JAMA. 272，205-221]。木犀科植物歐洲白蠟樹(Fraxinus excelsior L.)在處于溫帶的亞洲和歐洲國家 通常被稱為“普通水曲柳”或“歐洲水曲柳” [Gilman andWatson，1993，F(xiàn)act Sheet ST-264， November] 0這種植物還廣泛分布于摩洛哥東南部地區(qū)的塔菲拉勒特(Tafilalet)，在那里 被稱為“1' ssanel' ousfour".塔菲拉勒特地區(qū)被認為是墨西哥地區(qū)中植物治療知識最 發(fā)達的地區(qū)[Eddouks等，2002，J. Ethnopharmacol. 82，97-103]。最近的研究表明歐洲白 蠟樹(FE)具有抗菌和抗氧化活性。FE的甲醇提取物顯示出強的抗氧化活性，通過定性α， α -二苯基-β -苦基胼基(DPPH)分析，RC5tl為1. 35X 10_2。FE的正己烷和二氯甲烷提取物也 具有抗所測試的八種革蘭氏陽性病原菌和革蘭氏陰性病原菌(包括耐甲氧西林的金黃色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的活性，最小抑菌濃度(MIC)值在1. 25X li^mg/mL以 內(nèi)[Middleton 等，2005，Indian J. Pharma. Res.，2，81-6]。據(jù)報道 FE 對正常血壓大鼠和原 發(fā)性高血壓大鼠均具有降血壓的作用。每日口服FE種子的水提取物能顯著降低兩種類型 大鼠的心收縮壓并顯著增加其排尿[Eddouks等，2005，J. Ethnopharmacol.，99，49_54]。FE 種子的水提取物在正常大鼠和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的大鼠中均顯示出強的降血糖活性 和抗高血糖活性而不影響基礎(chǔ)血漿胰島素濃度[Maghrani等，2004，J. Ethnopharmacol.， 91，309-16]。對腎臟葡萄糖重吸收抑制的根皮苷樣作用可能是FE降血糖作用機制之一 [Eddouks 等，2004，J. Ethnopharmacol.，94，149-54]。據(jù)報道FE主要含有香豆素類、裂環(huán)烯醚萜類和苯乙醇苷類[Kostovaand Iossifova，2007，F(xiàn)itoterapia 78,85-106] 在FE中發(fā)現(xiàn)的裂環(huán)烯醚萜類源于木犀欖苷(oleoside)。這些類型的裂環(huán)烯醚萜類僅存在于木犀科植物中[Egan等，2004，Biochem. Sys.Ecol.，32，1069-71]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從歐洲白蠟樹(俗名水曲柳(Ash))的種子提取物中分離出來的新 的裂環(huán)烯醚萜。所述兩個化合物被鑒定為(1)(2S，3E，4S)2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙 基-2- [ (6-0- β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖基)氧基]_3，4- 二氫-5-(甲氧基羰 基)甲基酯，命名為白蠟?zāi)拒?excelsideM，化學(xué)式為C22H32O16(圖1-1)；以及⑵(2S，3E， 4S) 2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2- [ (6-0- β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖基)氧 基]-3，4- 二氫-5-(甲氧基羰基)2-(4-羥基苯基)乙基酯，命名為白蠟?zāi)拒誃，分子式為 C30H40O17(圖1-2)。這兩個化合物均是木犀欖苷型裂環(huán)烯醚萜，其特征為環(huán)外的8，9_烯烴官 能團。本發(fā)明還涉及獲得分離的來源于FE的組合物的方法。所述組合物可通過獨特的 提取和分離方法獲得。將種子研磨成粒徑為0. lmm-30mm范圍的顆粒以增加與溶劑接觸的 表面積和提高提取效率。在所述方法的一個實施方案中，所述提取溫度為20°C至100°C。 在一個優(yōu)選實施方案中，提取溫度為50°C至70°C。所述提取方法中所用的植物材料與溶劑 混合物的比為1 1至1 10(以克/毫升計)。在所述方法的一個實施方案中，所述比 為1 3至1 8。植物材料與溶劑混合物接觸的孵育時間為約2小時至約24小時的一 段時間。所述提取溶劑可以為水、水-醇混合物(醇的至99%的水溶液)和醇。優(yōu)選 的醇為乙醇(EtOH)和甲醇(MeOH)。孵育植物材料和溶劑后，將溶劑與剩余植物材料分開， 然后濃縮提取物組合物直到所述提取的組合物的固體成分通常含有約-35%的歐洲白 蠟裂環(huán)烯醚萜。所述裂環(huán)烯醚萜包含兩種新的木犀欖苷型葡萄糖苷白蠟?zāi)拒誂和白蠟?zāi)拒?B，二聚體裂環(huán)烯醚萜女貞子苷(3)(圖1-3)、GI3 (4)(圖1_4)以及GI5 (5)(圖1_5)，以及 ligstroside，木犀欖苷二甲基酯(6)(圖1_6)和木犀欖苷_11_甲基酯。其他成分包括酚 類化合物、紅景天苷(salidroside)、香豆素類和類黃酮化合物。在完成上述提取后，分離所 述裂環(huán)烯醚萜。所述裂環(huán)烯醚萜可以通過色譜方法從FE提取物中分離出來。所述裂環(huán)烯醚萜是從FE干粉提取物中分離出來的。將粉末溶于醇中，通過醇將所 述裂環(huán)烯醚萜從所述粉末中提取出來。然后蒸發(fā)所述醇，將含有裂環(huán)烯醚萜的剩余殘留物 加樣至填充反相C-18樹脂的色譜柱中。用一系列的水和10% Me0H/90%水以及MeOH系統(tǒng) 洗脫含有不同化合物的幾個級分。通過高效液相色譜(HPLC)分析比較所述級分，合并具有 相似HPLC譜圖的洗脫液。通過正相硅膠柱色譜分離所合并的級分并用如下溶液洗脫氯仿 (CHCl3)、CHCl3-甲醇混合物(從90%,80% CHCl3至100% MeOH)，以得到幾個亞級分。通 過HPLC比較所述亞級分，分別合并含有白蠟?zāi)拒誂和白蠟?zāi)拒誃的級分。通過C-18、MCI GEL CHP-20P和/或交聯(lián)葡聚糖凝膠(S印hadex) LH-20樹脂柱色譜的組合來進一步純化所 合并的級分，以提供純的白蠟?zāi)拒誂和白蠟?zāi)拒誃。利用波譜法(包括核磁共振(NMR)、紫外(UV)、紅外(IR)以及質(zhì)譜(MS))鑒定白蠟 木苷A和白蠟?zāi)拒誃的新化學(xué)結(jié)構(gòu)，還測定了其物理特性。通過與文獻中的NMR譜圖進行直 接比較來鑒定裂環(huán)烯醚萜的已知化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用KBr片在Perkin-Elmer 1600FTIR分光光 度計上記錄IR譜圖。利用氘代甲醇(OT3OD)作為溶劑通過Varian INOVA 400測定NMR譜圖。使用Varian NMR軟件的標準梯度脈沖序列獲得所有的二維相關(guān)譜。所述相關(guān)譜包括 COSY (相關(guān)譜)、TCOSY (總相關(guān)譜)、HMQC (異核多量子相關(guān)譜)、HMBC (異核多鍵相關(guān)譜) 以及ROESY(旋轉(zhuǎn)坐標系奧氏增益譜)。使用Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(配備四元泵、自 動進樣器、四通道在線脫氣裝置、光電二極管陣列檢測器以及Agilent化學(xué)工作站軟件)進 行所述HPLC分析。使用LC/MS ESI/APCI模式在FirmiganLCQ離子阱質(zhì)譜儀上測定分子量。 通過Schimadzu UV-1700紫外-可見分光光度計獲取UV光譜。本發(fā)明還涉及兩種二聚體裂環(huán)烯醚萜，即GI5 (5)和女貞子苷(nuzhenide) (3)對 未分化3T3-L1細胞的抑制作用。重量增加的主要因素是通過脂肪生成過程在體內(nèi)堆積脂 肪組織。脂肪生成的特征在于脂肪細胞的數(shù)量和大小的增加。通過抑制脂肪細胞合成以降 低脂肪細胞的數(shù)量和大小來抑制脂肪生成能控制體重。本發(fā)明涉及歐洲白蠟(FE)和從FE中分離出的裂環(huán)烯醚萜即木犀欖苷二甲基 酯(6)、白蠟?zāi)拒誂(I)以及GI3 (4)對PPAR-α的活化作用。過氧化物酶體增殖物活化 受體(PPAR)是細胞核受體，其控制許多細胞和代謝過程。PPAR-α主要在肝臟中表達， 在那里其在控制脂肪酸氧化方面起到關(guān)鍵作用[Reddy and Hashimoto, 2001, Annu Rev Nutr.，21，193-230]。通過PPAR-α活化作用誘導(dǎo)脂肪酸氧化可改善血漿脂質(zhì)特性。在 許多小鼠模型中，PPAR-α激動劑降低血漿甘油三酯、減少肥胖和提高肝臟和肌肉的脂肪 變性(steaosis)，進而提高胰島素敏感性和降低血液中葡萄糖[Guerre-Millo等，2000， J. Biol. Chem.，275，16638-42 以及 Kim 等，2003，Diabetes, 52，1770-8]。本發(fā)明還涉及上述組合物，其可用于治療代謝綜合癥以降低患有DM-2的患者體 內(nèi)的血液葡萄糖，有助于減輕體重以及平衡胰島素水平以防止高胰島素血癥(DM-2患者中 的胰島素抵抗癥狀)。當(dāng)雄性C57BL/6J小鼠進食高脂肪食物后，它們出現(xiàn)肥胖、高血糖癥以 及高胰島素血癥。有效量的FE給藥可顯著降低小鼠中葡萄糖水平、減少它們的體重和身體 脂肪并降低血漿胰島素水平。在人臨床試驗中，給予16名空腹健康志愿者50克葡萄糖以誘導(dǎo)餐后高血糖，并以 FE或安慰劑(麥糠)給藥。與安慰劑組相比，F(xiàn)E提取物組降低了餐后血漿葡萄糖濃度的增 加。其在統(tǒng)計學(xué)上(P = 0.002)降低了血液葡萄糖曲線下血糖面積。所述FE種子提取物 還在葡萄糖給藥后90分鐘時誘導(dǎo)顯著的(ρ = 0. 002)胰島素分泌。


通過以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細論述并參照附圖，本發(fā)明的進一步特征、 優(yōu)點和特點對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將變得顯而易見，在附圖中圖1-1至1-6分別舉例說明了白蠟?zāi)拒誂、白蠟?zāi)拒誃、女貞子苷、GI3、GI5以及木 犀欖苷二甲基酯的分子結(jié)構(gòu)；圖2舉例說明了化合物GI5 (5)和女貞子苷(3)對1未處理、2胰島素、3胰島素和 甲醇、4女貞子苷(濃度為0.004%、0.02%、0.05%和0· 1% )以及5GI5 (濃度為0. 004%、 0. 02%、0. 05%和0. )的葡萄糖攝取活性(cpm)；圖3舉例說明了歐洲白蠟樹種子提取物和ΙΟΟμΜ非諾貝特(陽性對照)相比于 DMSO (對照條件)作用而言對GAL4/PPARci融合受體的相對活化(數(shù)值是平均值士 SD (η = 4)。*Ρ < 0. 05 ;**Ρ < 0. 01 ;***Ρ < 0.001.學(xué)生 t 檢驗)；
圖4舉例說明了處理16周后低脂肪(LF)、高脂肪(HF)以及白蠟(HF+FE提取物) 處理的小鼠的空腹血液葡萄糖(mg/dL)結(jié)果；圖5舉例說明了低脂肪(LF)、高脂肪(HF)以及白蠟(HF+FE提取物)處理的小鼠 在不同處理周的平均體重(g)結(jié)果；圖6舉例說明了濃度為IO-5M至IO-9M的選擇性合成PPAR α活化劑WY14，643 和濃度為10_4Μ的分離化合物以及FE種子提取物的1 10水溶液(其中化合物標記 FE19028 (女貞子苷，3)、FE20015 (GI3,4)、FE20031 (木犀欖苷二甲基酯，6)、FE21008 (白蠟 木苷A，l)和FE21023(GI5，5))對受體細胞系的相對PPAR α活化潛能(% )；圖7分別舉例說明了 LF組(η = 10)、HF組(η = 10)和FE種子提取物組各小鼠 的網(wǎng)膜脂肪的重量(g)； 圖8分別舉例說明了 LF組(η = 10)、HF組(η = 10)和FE種子提取物組各小鼠 的腹膜后脂肪的重量(g)；圖9分別舉例說明了 LF組(η = 10)、HF組(η = 10)和FE種子提取物組各小鼠 的空腹血漿胰島素水平(ng/mL)；圖IOA和IOB分別舉例說明了歐洲白蠟樹種子提取物(FE) (1. Og)和匹配的麥糠 安慰劑(l.og)對以50g葡萄糖給藥的健康志愿者中血糖的比較(mmol/L對時間)，其中 (A)在各時間點的血糖增加，⑶血液葡萄糖曲線下面積(AUC)，數(shù)值是平均值士SEM. *P = 0.02，配對學(xué)生t檢驗(η = 16)；圖IlA和IlB分別舉例說明了歐洲白蠟樹種子提取物(FE) (1. Og)和匹配的麥糠 安慰劑(l.Og)對以50g葡萄糖給藥的健康志愿者中胰島素水平的比較(mU/L對時間)， 其中(A)在各時間點的血液胰島素增加，(B)血液胰島素曲線下面積(AUC)，數(shù)值是平均值 士 SEM. *P = 0. 002，學(xué)生 t 檢驗(η = 16)；發(fā)明詳述現(xiàn)在參照附圖和以下實施例描述歐洲白蠟樹種子提取物的本發(fā)明優(yōu)選實施方案。實施例1用水從歐洲白蠟樹提取裂環(huán)烯醚萜。將總量為2. 5kg的歐洲白蠟樹種子在空氣中 干燥，然后研磨成粒徑為約l_2mm的粗粉。將所述粗粉在80-90°C下于滲濾器的水中浸泡 5小時，然后使水提取物從所述滲濾器中排出。重復(fù)該提取步驟三次。將所有水提取物合 并在一起，于旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀中濃縮。在蒸發(fā)掉水后，獲得總量為550g的干燥粉末狀提取 物。HPLC分析顯示，該粉末提取物含有兩種主要的裂環(huán)烯醚萜，11. 4% (重量/重量)女貞 子苷和6. 2%的GI3。所述組合物還含有0. 19%木犀欖苷-11-甲基酯、0. 41%白蠟?zāi)拒誃、 0. 63% GI5、0. 2%紅景天苷以及一些少量的裂環(huán)烯醚萜，包括=Iigstroside、木犀欖苷二 甲基酯和白蠟?zāi)拒誂。實施例2用水、水-乙醇和乙醇從歐洲白蠟樹種子中提取裂環(huán)烯醚萜。準備五份樣品，每份 樣品包含5g歐洲白蠟樹種子。將每份樣品磨成粉末，分別用200ml水、25%乙醇/75%水、 50%乙醇/50%水、75%乙醇/25%水以及乙醇進行溶劑提取。在室溫(22_24°C )下提取24 小時后，蒸發(fā)溶劑，通過HPLC分析殘留固體。裂環(huán)烯醚萜含量和紅景天苷列舉在表1中。表1.利用不同溶劑獲得的主要裂環(huán)烯醚萜含量和紅景天苷(結(jié)果以重量百分比表不)O
化合物EtOH75% EtOH50% EtOH25% EtOH水女貞子苷9. 0515. 0415. 4314. 101. 50GI 39. 2014. 7717. 069. 181. 14木犀欖苷二甲基酯0. 570. 910. 780. 740. 96白蠟?zāi)拒誃0. 060. 090. 100. 120. 03GI 50. 911. 451. 700. 830. 10紅景天苷0. 080. 170. 160. 180. 74實施例3從歐洲白蠟樹分離裂環(huán)烯醚萜。加入3. 5升甲醇，室溫下與500g由實施例1所示 的方法步驟獲得的粉末提取物混合3小時。通過過濾方法將甲醇溶液從粉末中分離出來。 重復(fù)相同處理一次，然后合并兩次甲醇提取物，并在減壓下濃縮得到總量為54g的干燥甲 醇提取物。將所述甲醇提取物再溶于水中，過濾除去不溶于水的物質(zhì)。進一步在C-18樹脂 上對所述濾液進行反相柱色譜分離，用水以及從溶于水中的10% MeOH至100% MeOH的梯 度MeOH-水溶劑體系進行洗脫?？偣彩占?個級分。真空下蒸發(fā)從柱上洗脫下的每一級分 并通過HPLC分析進行合并。將級分2、3和7加樣至填充硅膠樹脂的色譜柱上，然后使用氯 仿 _ 甲醇體系從 CHCl3、10 % MeOH/CHCl3、20 % MeOH/CHCl3 至 100 % MeOH進行洗脫。通過HPLC 分析來比較從硅膠柱上收集的級分，將每個分離的洗脫液重復(fù)加樣至MCI GEL CHP-20P和 /或S^hadex LH-20樹脂上進行柱色譜分離，并用水/甲醇體系進行洗脫直至得到單一的 純化合物。發(fā)現(xiàn)兩個新化合物白蠟?zāi)拒誂和白蠟?zāi)拒誃，以及幾種已知化合物女貞子苷、 GI3、GI5、ligStr0Side、木犀欖苷二甲基酯、木犀欖苷-11-甲酯和紅景天苷。所有的化學(xué)結(jié) 構(gòu)均通過波譜法進行鑒定。實施例4白蠟?zāi)拒誂和白蠟?zāi)拒誃的結(jié)構(gòu)鑒定白蠟?zāi)拒誂(I)是以無定形粉末形式獲得 的。其分子式為C22H32O16，是基于其MS測定的并且由1H和13C NMR數(shù)據(jù)確認(表2)。紫外 譜圖顯示232 (sh) nm處的特征吸收來源于與羰基共軛的環(huán)烯醚萜型(iridoidic)烯醇醚體 系。IR譜圖表明羥基官能團在Umax 3401，酯在1734、1717，α , β -不飽和酯在1626CHT1。 對其1HJ3C-NMR以及二維相關(guān)譜的詳細分析表明，白蠟?zāi)拒誂具有木犀欖苷型裂環(huán)烯醚萜 葡糖苷部分，由在 δΗ 7. 51 (s，H-3)、5· 93(s，H_l)、6· 08(qd，J = 7. 2,0. 8Hz，H_8)、1. 72 (d，J =7. 6Hz, H3-IO)和4.80(cU = 8.0HZ，H-l，)處的質(zhì)子信號支持，相應(yīng)的碳-13信號在5C 155. 2 (C-3)、94· 8 (C-I)、124. 7 (C_8)、13. 6 (C-10)和 100. 5 (C-1，)。在 δ Η3· 62 (OCH3, δ c 51. 9)和3. 70 (OCH3, δ c 52. 3)的兩個甲氧基信號顯示分別與gHMBC譜中的C_7 ( δ cl73. 7) 和C-ll(Sc 168.6)相關(guān)聯(lián)，表明白蠟?zāi)拒誂具有7，11-木犀欖苷二甲基酯單元[Boros
8and Stermitz, 1991，J. Nat. Prod.，54，1173-246]。除此之外，由于 β -吡喃葡萄糖基部分 (5c 100. 6、77. 6、77. 8、71.6、75. 3和70. 1)引起的其它NMR信號表明白蠟?zāi)拒誂為具有另 一個葡萄糖基的7，11-木犀欖苷二甲基酯。經(jīng)測定所述葡萄糖基的位置連接所述木犀欖苷 部分的C-6’，因為當(dāng)與白蠟?zāi)拒誂相當(dāng)位置的7，11-二甲基木犀欖苷信號相比時，在C-6’ 處的信號有7. 5ppm的低場位移，在C-3’以及C-5’處有0. 5和2. 6ppm的高場位移。該推 斷進一步得到gHMBC相關(guān)譜的支持，其中發(fā)現(xiàn)在δΗ 4.35的!1-1”’和5C 70. Ippm的C_6’ 之間以及在H-6，( δ H 4. 15和3. 84ppm)和C-1”，( δ c 105. 3ppm)之間有交叉峰存在。甲 基基團位于8，9-烯烴鍵的E-構(gòu)型，得到ROESY譜的支持，其中觀察到在H-IO ( δ Hl. 72)和 Η-5( δ Η 3. 96)之間具有強相關(guān)性。在同一譜圖中，H-I ( δ Η 5. 93)和Η_6( δ 2. 51)之間的相 關(guān)性表明C-I處的葡萄糖基為β-構(gòu)型。因此，白蠟?zāi)拒誂的結(jié)構(gòu)確定為(2S，3E，4S)2H-吡 喃-4-乙酸-3-亞乙基-2-[(6-0-β -D-吡喃葡萄糖基- β -D-吡喃葡萄糖基)氧基]_3， 4-二氫-5-(甲氧基羰基)甲基酯，命名為白蠟?zāi)拒咋　Ｍ暾?H和13C NMR數(shù)據(jù)歸屬在表 2中給出。白蠟?zāi)拒咋?2)是以無色無定形粉末形式分離出的。經(jīng)MS測定其分子式為 C3tlH4tlO17，并經(jīng)NMR數(shù)據(jù)確認。在2的紫外譜圖中，除了 230nm處的與羰基共軛的環(huán)烯醚萜 型烯醇醚特征吸收之外，275nm和283nm處的其它吸收表明存在苯酚。IR顯示羥基在Umax 3400，α，β-不飽和酯在1701、1636，芳環(huán)在1518CHT1。白蠟?zāi)拒誃的1H NMR和13C譜圖顯示 由于木犀欖苷部分引起的特征信號烯烴信號在Sh 7.50(s，H-3)、5C 155.2(C-3)，烯丙 基乙縮醛在Sh 5.94(s，H-1)、5c 94. 7 (C-I)，葡萄糖基的異頭信號在δ H4. 82 (d，H-1，)、 δ c 100. 3 (C-1’)，亞乙基基團的烯烴質(zhì)子在δ η 6. 05(d，H-8)、Sc 124. 8 (C_8)，所述亞乙 基的甲基在Sh 1. 61 (d，H3-IO)、5c 13.6(C-10)。所觀察的苯乙醇苷信號以及芳環(huán)中的 AA，BB，自旋體系在 δΗ 6. 71(2H,dd,J = 6. 8,2. 8Hz)禾口 δ H7. 02 (2H，dd，J = 6. 8，2. 8Hz)， 提示了苯乙醇苷的對位取代形式。在gHMBC中所發(fā)現(xiàn)的在5C 67. Oppm 的C-7之間的遠程1H-13C相關(guān)表明所述苯乙醇連接在C-7位，使得白蠟?zāi)拒誃的結(jié)構(gòu)與 Iigstroside (對位羥基苯乙醇木犀欖苷酯)相關(guān)[Takenaka等，2000，Phytochemistry，55， 275-84]。與白蠟?zāi)拒誂相似，白蠟?zāi)拒誃中明顯的其它β _吡喃葡萄糖基單元被表明是與 C-6’相連的。當(dāng)與ligstroside的信號進行比較時，這可通過白蠟?zāi)拒誃的C-6’之C-13信 號的7. 3ppm低場化學(xué)位移與C-3’和C-5’各自的0. 7ppm和2. 9ppm的高場位移來證實。這 種相關(guān)性的進一步確認可在gHMBC譜中觀察到，其中在δΗ 4.31(Η-Γ”)和Sc70. 1(C_6’) 的葡萄糖基的異頭信號之間具有強相關(guān)性。甲基位置歸屬于C-Il位，這是由于gHMBC譜中 所觀察的Sh 3. 69 (OCH3)和Sc 168. 7 (C-Il)處的信號的遠程交叉峰引起的。因此，化合 物白蠟?zāi)拒誃被命名為(2S，3E，4S) 2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2- [ (6-0- β -D-吡喃葡 萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]_3，4-二氫-5-(甲氧基羰基)2-(4-羥基苯基)乙基 酯，命名為白蠟?zāi)拒誃。1H和13C NMR數(shù)據(jù)歸屬在表2中給出。表2.化合物白蠟?zāi)拒誂(I)和白蠟?zāi)拒誃 (2)的1H^3C和HMBC數(shù)據(jù)(CD3OD)12編號δΗδοHMBC (H 至 C)δΗ6cHMBC (H 至 C)]5,93 s94.8 d8，1’5.94 s94.7 d8，1，37.51 sJ55‘2d1,4, 5,117.50 s155.2 d1,4, 5, U4109.3 s109.3 s53.96 dd (9.0， 4.3)31.9 d1,3,4, 6，7， 8，9，113.95 dd (9.6’ 4.0)32.0 d7,1162.76 dd (14.4’41.1 t4，5’ 7’ 92.72 dd (14.0,41.3 t7
4.4)4,5,7,9 4.0)
2.51 dd (14.0,2.50 dd (14,0，
10.0)9.6)
10
是通過脂肪形成過程在體內(nèi)堆積脂肪組織。脂肪形成的特征在于脂肪細胞大小和數(shù)量的增 加。從歐洲白蠟樹分離出來的裂環(huán)烯醚萜即GI5和女貞子苷分別通過阻止未分化3T3-L1 細胞變成分化脂肪細胞的途徑顯示出顯著的和輕度的脂肪形成抑制活性，從而實現(xiàn)對體重 控制和身體脂肪減少的作用。在存在或不存在化合物的情形下，利用甲基異丁基黃嘌呤、地 塞米松以及胰島素(MDI)激素混合物誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細胞分化。分化誘導(dǎo)十天后，檢測 處理細胞各自的葡萄糖攝取活性，所述葡萄糖攝取活性是分化作用(脂肪形成)的間接衡 量值，因為前脂肪細胞不能進行胰島素誘導(dǎo)的、葡萄糖轉(zhuǎn)運_4(GLUT4)介導(dǎo)的葡萄糖攝取 而全部分化脂肪細胞則均能進行這種攝取。使用四種不同濃度的化合物GI 5和女貞子苷 0.004%、0.02%、0.05%以及0.1%。未處理(未分化)細胞用作陰性對照，而胰島素用作 陽性對照。所述化合物的溶劑甲醇(MeOH)也用作對照。結(jié)果表明，從歐洲白蠟樹分離出的 GI5和女貞子苷分別通過阻止未分化3T3-L1細胞變成分化脂肪細胞的途徑顯示出顯著的 和輕度的脂肪形成抑制活性，從而實現(xiàn)對體重控制和身體脂肪減少的作用(參見圖2)。實施例6歐洲白蠟樹的PPAR-α活化作用。過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)是細胞 核受體，其控制許多細胞和代謝過程。PPAR-α主要在肝臟中表達，在那里其在控制脂肪酸 氧化方面起到關(guān)鍵作用(Reddy andHashimoto,2001, Annu Rev Nutr.，21，193-230)。通過 PPAR-α活化作用誘導(dǎo)脂肪酸氧化可改善血漿脂質(zhì)特性。在許多小鼠模型中，PPAR-α激 動劑降低血漿甘油三酯、減少肥胖和提高肝臟和肌肉的脂肪變性，進而提高胰島素敏感性 和降低血液中葡萄糖[Guerre-Millo 等，2000，J. Biol. Chem.，275，16638-42 以及 Kim 等， 2003，Diabetes,52，1770-8]。如實施例2所述用水作為溶劑獲得的歐洲白蠟樹種子提取物(FE提取物)已證實 能活化PPAR-α。以活性化合物與GAL4/PPAR-ci受體轉(zhuǎn)染細胞一起孵育后獲得的螢光素 酶(一種基因報告物)的發(fā)光信號來計算FE提取物和非諾貝特(陽性對照)與DMSO(對 照條件)相比的PPAR-Ci相對活性。首先，利用融合蛋白GAL4/PPAR-ci和攜帶螢光素酶 的DNA構(gòu)建體瞬間轉(zhuǎn)染C0S-7細胞(培養(yǎng)在DMEM+10% FCS中)。對于該轉(zhuǎn)染，首先通過在 pTK-pGL3質(zhì)粒的胸苷激酶啟動子前面插入五拷貝數(shù)GAL4(酵母轉(zhuǎn)錄因子)DNA結(jié)合位點而 獲得pGAL5-TK-pGL3質(zhì)粒。然后，通過PCR擴增hPPAR- α DEF結(jié)構(gòu)域(aa 180-464)來構(gòu)建 質(zhì)粒 pGAL4-hPPAR-α。將所得 PCR 產(chǎn)物克隆到 pBD_GAL4 (Stratagene，LaJolla, USA)中， 隨后將嵌合體亞克隆到P⑶NA3載體中。轉(zhuǎn)染后，使C0S-7細胞與0 μ g/mL(對照條件)、 1 μ g/mL、3 μ g/mL、10 μ g/mL、30 μ g/mL、100 μ g/mL、300 μ g/mL 禾口 1000 μ g/mL 的 FE 提取物 或100 μ M非諾貝特(陽性對照)一起孵育24小時。DMSO用作溶劑。孵育后，收集細胞并進 行螢光素酶測定。FE提取物和非諾貝特對PPAR-α的活化導(dǎo)致螢光素酶表達和隨后的發(fā)光 信號增強，采用Tecan紫外分光光度計(Tecan，Austria)測定所述發(fā)光信號。結(jié)果以GAL4/ PPAR-α相對活性表示，其與對照(DMSO)的發(fā)光活性相比的FE提取物和非諾貝特(陽性對 照)發(fā)射的發(fā)光信號成比例。結(jié)果報告為每一測試的四個試驗的平均值士SD(圖3)。利用 學(xué)生t檢驗(XLSTAT 2008, Addinsoft ,USA)計算組間的差異。FE提取物的PPAR-α活化 結(jié)果示于圖3中。在1000 μ g/mL下FE提取物的PPAR-α活化達到18%。結(jié)果以非諾貝特 (用作參照化合物的PPAR-α活化劑)的百分率表示。FE提取物活化PPAR- α的能力可部分地解釋在動物研究中所觀察到的降血糖作用。實施例7FE提取物對雄性C57BL/6J小鼠的降血糖活性。將雄性C57BL/6J小鼠分為三組 1)陰性對照組20只雄性小鼠，每天攝取約10千卡的低脂肪食物(LF) ；2)陽性對照組20 只雄性小鼠，每天攝取約60千卡的高脂肪食物(HF)，由于進食高脂肪，該組小鼠出現(xiàn)了肥 胖癥、高血糖癥和高胰島素血癥；3)0. 5% FE提取物組10只雄性小鼠如組2—樣進食高脂 肪食物，但是食物中還混有0.5%的FE提取物。每周測量食物和流體攝入量以及體重。監(jiān) 測異常和可能的毒性征兆。從尾靜脈取血樣，利用血糖測定儀測定空腹血液葡萄糖水平。實 驗前測定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。三組間無統(tǒng)計學(xué)差異。在處理16周后，與高脂肪對照組中小鼠相比，F(xiàn)E提取物處理組中小鼠顯示出顯著 降低的空腹血糖水平(P < 0. 001)，這表明FE提取物具有強的降血糖作用(圖4)。實施例8FE提取物對雄性C57BL/6J小鼠的體重減輕作用。測量實施例7中同樣三組中每 只小鼠的體重。三組的基礎(chǔ)體重之間無統(tǒng)計學(xué)差異。處理16周后，與低脂肪處理組的小鼠 相比，高脂肪處理組(組2和3)中所有小鼠的體重顯著增加更多。然而，F(xiàn)E組的體重增加 程度比陽性對照組低的多，這表明FE提取物對體重控制的活性(圖5)。實施例9白蠟?zāi)拒誂(I)、GI 3(4)和木犀欖苷二甲基酯(6)的PPAR-α活性。測定從歐洲 白蠟樹(FE)種子水提取物中分離出的五種單一化合物的PPAR-α活性。在測定中，將合成 的選擇性PPAR- α活化劑WY 14，643用作陽性對照，用于溶解這些化合物的DMSO用作陰性 對照。濃度為10_4Μ時，五種純的裂環(huán)烯醚萜具有部分活性。化合物白蠟?zāi)拒咋?、木犀欖?二甲基酯和GI3表現(xiàn)出良好的活性(圖6)。實施例10歐洲白蠟樹(FE)種子提取物對雄性C57BL/6J小鼠的脂肪減少作用。在本實驗 (從實例7起)結(jié)束時，在處理16周后，麻醉并處死所有組的小鼠，收集并稱重每只小鼠 的網(wǎng)膜脂肪和腹膜后脂肪。結(jié)果顯示FE種子提取物分別減少18.3%的網(wǎng)膜脂肪增加和 17. 8%的腹膜后脂肪增加(圖7和8)。實施例11歐洲白蠟樹(FE)種子提取物對雄性C57BL/6J小鼠的空腹血漿胰島素水平的降低 作用。在本實驗(從實施例7起)結(jié)束時，通過小鼠Elisa試劑盒測定空腹血漿胰島素水 平。與高脂肪對照組相比，白蠟樹種子提取物處理的小鼠具有顯著降低的空腹血漿胰島素 水平(P < 0. 05)(圖 9)。實施例12歐洲白蠟樹(FE)種子提取物對人的降血糖活性。為了評價本發(fā)明組合物對人的 作用，對人進行了一項隨機、雙盲、安慰劑對照和交叉設(shè)計的研究。招募了來自印度的一共 16名健康個體(11名男性和5名女性)。要求對象年齡在25至55歲之間，身體質(zhì)量指數(shù) 為26 士 2. 2kg/m2，空腹血糖水平為4. 4士0. 09mmol/L。FE種子提取物用于處理組，麥糠粉末 用于安慰劑組。在本研究中每人日劑量為Ig FE種子提取物。為評價血糖反應(yīng)，在進行葡 萄糖激發(fā)(50g在IOOmL水中)之前，指導(dǎo)對象口服單劑量的兩粒FE種子提取物膠囊(每粒500mg)或者兩粒安慰劑膠囊(每粒500mg麥糠)。在1周的清洗期后，所述兩組相互轉(zhuǎn) 換。研究期間，于0、15、30、45、60、90和120分鐘時通過刺破手指取血樣。在取完空腹血液 樣品后的0分鐘時立即用IOOmL水送服測試提取物/安慰劑。然后在5-8分鐘內(nèi)對象攝 取葡萄糖溶液(50g在IOOmL水中，D-葡萄糖，Qualigens Co.，GlaxoIndia)。此時開始計 時。在服用葡萄糖溶液后15、30、45、60、90和120分鐘通過刺破手指取另外的血樣。利用 Bayer的血糖儀和Essentiaglucotrip測定毛細管中全血的葡萄糖濃度。計算安慰劑和FE 處理組的正性增加的曲線下面積(AUC)作為不同時間間隔的血液葡萄糖濃度。采用雙尾配 對學(xué)生t檢驗計算組間的顯著性差異。通過XLSTAT 2008軟件(Addinsoft ，USA)進行分 析。統(tǒng)計學(xué)顯著性設(shè)置為P <0.05。所有結(jié)果均以平均值士SEM表示。通過配對比較，血糖增加的圖形表明，與匹配的麥糠安慰劑相比，F(xiàn)E種子提取物在 實驗期間從 15 分鐘(2. 0士0. 26mmol/L 對比 1. 7士0. 21mmol/L) ,30(4. 0士0. 4lmmol/L 對 比 3. 7士0. 33mmol/L) ,45(4. 2士0. 41mmol/L 對比 3. 7士0. 47mmol/L) ,60(3. 4士0. 46mmol/L 對比 3. 4士0. 41) ,90(1. 8士0. 38mmol/L 對比 1. 6士0. 31mmol/L)至 120(0. 58士0. 29mmol/L 對比0. 21 士0. 27mmol/L)分鐘降低餐后葡萄糖水平(圖10A)。配對學(xué)生t檢驗表明處理 (FE對比安慰劑)對平均AUC的作用差異(299. 8 士 28. 8分鐘· mmol/L對比273. 2 士 25. 2分 鐘.mmol/L)是統(tǒng)計學(xué)顯著性的(P = 0. 02)。結(jié)果見圖10B。實施例13歐洲白蠟樹(FE)種子提取物對人的急性促胰島素釋放作用。所述組合物的促胰 島素釋放作用是作為實施例12中所述臨床研究的其它目的而評價的。在0、30、60、90和 120分鐘采集用測試FE/安慰劑處理的健康對象的靜脈血液樣品(7-8mL)，置于血清分離 管中。用15分鐘使血液凝集，然后以1500Xg離心10分鐘。然后利用電化學(xué)發(fā)光免疫檢 測(ECLIA)分析測定所得血清中的胰島素。計算安慰劑和FE處理組的正性增加的血液胰 島素曲線下面積(AUC)作為不同時間間隔的胰島素水平。采用雙尾配對學(xué)生t檢驗計算 組間的顯著性差異。通過XLSTAT 2008軟件(Addinsoft ，USA)進行分析。統(tǒng)計學(xué)顯著 性設(shè)置為P < 0. 05。所有結(jié)果均以平均值士SEM表示。相比于安慰劑(43. 5士5. 0mU/L)， FE(55. 5士4. 6mU/L)在90分鐘時誘導(dǎo)顯著的(P = 0. 002)胰島素分泌(圖11A)。相比于 安慰劑組(5，996. 3士594. 58 分鐘· mU/L)，F(xiàn)E 處理組(6,041. 6士340. 5 分鐘· mU/L)的平 均胰島素AUC平均值(0-120分鐘)無顯著性差異(圖11B)。對90分鐘時胰島素分泌的刺激似乎是FE對胰島細胞的直接作用，其在本研究結(jié) 束時(120分鐘)回歸正常。在這種情形下，這可降低胰島素抗性并提高胰島素敏感性。而 且，由于處理組和安慰劑組的平均血液胰島素AUC沒有顯著性差異，所以提取物的使用是 安全的，在處理后的幾個小時內(nèi)沒有出現(xiàn)高胰島素血癥。應(yīng)當(dāng)理解的是，F(xiàn)E提取物的有效量可根據(jù)接受治療的動物或人的重量而不同，如 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。而且，所述FE提取物可通過任意常規(guī)介質(zhì)，與非處方藥物 和膳食補充劑中常用的填充劑、添加劑、粘合劑、賦形劑、調(diào)味劑等一起以液體、粉末或囊片 (caplet)、片劑或膠囊或其他常規(guī)制劑形式遞送。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明可通過除所述實施方案、所給出的數(shù)值量 和范圍之外得到保護，所述實施方案、所給出的數(shù)值量和范圍均是為了舉例說明的目的而 提供的，并非是限制性的。
1權(quán)利要求
歐洲白蠟樹種子提取物，其包含約1wt％至約15wt％的女貞子苷，約1wt％至約17wt％的GI3，約0.5wt％至約1wt％的木犀欖苷甲基酯，約0.03wt％至約0.12wt％的白蠟?zāi)拒誃，約0.1wt％至約1.7wt％的GI5，以及約0.08wt％至約0.7wt％的紅景天苷。
2.(2S，3E，4S) 2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2- [ (6-0- β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡 喃葡萄糖基)氧基]_3，4-二氫-5-(甲氧基羰基)甲基酯的分離化合物。
3.(2S，3Ε，4S) 2Η-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2- [ (6-0- β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡 喃葡萄糖基)氧基]_3，4-二氫-5-(甲氧基羰基)2-(4-羥基苯基)乙基酯的分離化合物。
4.通過歐洲白蠟樹種子提取物給藥來對患者對象進行治療性處理的方法。
5.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來阻斷脂肪合成的方法。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述歐洲白蠟樹種子提取物包含GI5。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述歐洲白蠟樹種子提取物包含女貞子苷。
8.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來活化PPAR-α的方法。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述歐洲白蠟樹種子提取物為GI3。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述歐洲白蠟樹種子提取物為木犀欖苷二甲基酯。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述歐洲白蠟樹種子提取物為白蠟?zāi)拒咋　?br> 12.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來引起降血糖活性的方法。
13.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來減輕體重的方法。
14.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來減少身體脂肪的方法。
15.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來控制空腹血漿胰島素 水平對抗高胰島素血癥的方法。
16.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來提高胰島素敏感性和 引起有益的急性促胰島素釋放作用的方法。
17.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來治療代謝綜合癥的方法。
18.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來治療2型糖尿病的方法。
19.通過有效治療患者對象的量的歐洲白蠟樹種子提取物給藥來預(yù)防高胰島素血癥的 方法。
20.權(quán)利要求4、5、8或12-19中任一項的方法，其中所述患者對象是人。
21.通過包括以下步驟的工藝過程從歐洲白蠟樹種子中提取和分離裂環(huán)烯醚萜的方法將歐洲白蠟樹種子研磨成顆粒； 使所述研磨顆粒與溶劑混合物接觸；將所述研磨顆粒從所述溶劑混合物中分離出來； 將所述粉末溶于醇中；以及 蒸發(fā)所述醇。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述研磨顆粒具有約0.Imm至30mm的直徑。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述提取溫度為20°C至100°C。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述提取溫度為50°C至70°C。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述研磨顆粒與溶劑混合物的比率為約Ig Iml至約 Ig ； IOml0
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述研磨顆粒與溶劑混合物的比率為約Ig 3ml至約 Ig 8ml。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述研磨顆粒與所述溶劑混合物接觸約2小時至約24小時。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述溶劑混合物為水、水-醇混合物或者醇。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述溶劑混合物包含乙醇。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述溶劑混合物包含甲醇。
全文摘要
歐洲白蠟樹種子提取物，其可被給藥以通過阻斷脂肪合成、活化PPAR-α、提高降血糖活性、減輕體重、控制空腹血漿胰島素水平以防止高胰島素血癥、提高胰島素敏感性以及引起有益的急性促胰島素釋放作用來對包括人在內(nèi)的患者對象進行治療性處理。所述歐洲白蠟樹種子提取物包含分離的化合物(2S，3E，4S)2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-3，4-二氫-5-(甲氧基羰基)甲基酯(通用名為白蠟?zāi)拒誂)、分離的化合物(2S，3E，4S)2H-吡喃-4-乙酸-3-亞乙基-2-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-3，4-二氫-5-(甲氧基羰基)2-(4-羥基苯基)乙基酯(通用名為白蠟?zāi)拒誃)以及化合物GI5、GI3、女貞子苷和木犀欖苷二甲基酯等。
文檔編號A61Q9/00GK101918080SQ200880123641
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日
發(fā)明者何侃, 安托萬·比利, 白乃生, 阿爾溫·伊巴拉, 雅克·迪康斯基, 馬克·羅勒 申請人:Naturex有限公司