專利名稱：一種染料及其制備方法與在檢測特殊dna二級結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型染料及其制備方法，以及其在檢測DNA特殊二級結(jié)構(gòu)的用途。
背景技術(shù)：
G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的DNA 二級結(jié)構(gòu)。人類基因組中很多富鳥嘌呤區(qū)域具有形成這一結(jié)構(gòu)的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復(fù)序列，以及多種基因的啟動子區(qū)域,如c-myc，c-myb, bcl-2, c-kit, PDGF, kRAS, VEGF, Rb和胰島素基因等。同時，富鳥嘌呤序列的互補(bǔ)序列，即富胞嘧啶的序列可以在微酸性條件下，以半質(zhì)子化的形式特殊的二級結(jié)構(gòu)，叫i-motif. G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的形成對于體內(nèi)的一系列生理過程都存在調(diào)控作用。據(jù)報道，在人類基因組中大約包含了 376，000個具有形成G-四鏈體可能性的序列。研究證明，某些啟動子區(qū)域的G-四鏈體結(jié)構(gòu)會顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，因此G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的形成和拆散可能涉及到信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等一系列體內(nèi)重要的生理過程。所以，在體內(nèi)或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的存在或者形成，對于研究G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的相關(guān)生物學(xué)功能以及開發(fā)以G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。目前，在體內(nèi)和體外檢測G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的研究都取得了一些進(jìn)展。由于體內(nèi)大大過量的雙螺旋DNA的存在，以及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使得體內(nèi)的檢測相對于體外檢測需要解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實現(xiàn)體內(nèi)G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的檢測。而目前體外實驗中檢測G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法，核磁共振，表面等離子共振，熒光共振能量轉(zhuǎn)移等方法，這些方法對儀器和技術(shù)操作的要求都較高，而且價格較昂貴，基本上不能普及使用。目前也有一些文獻(xiàn)報道了一些熒光探針來檢測G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)。噻唑橙(TO)染料分子主體由苯并噻唑鹽通過一個次甲基橋鏈與喹啉鹽連接而成，TO與DNA有很高的親和力，高量子產(chǎn)率及結(jié)合后極高的熒光增強(qiáng)，因此TO是一個非常好的DNA熒光探針，但其對各種DNA缺乏選擇性，限制了其作為特異性識別G-四鏈體方面的應(yīng)用。苯乙烯染料也是一類被廣泛應(yīng)用的染料，其早期的主要用途是作為光譜增感劑應(yīng)用于鹵化銀照相乳劑中。近年來，發(fā)現(xiàn)其具有自聚集等性質(zhì)，并被應(yīng)用于一些新的領(lǐng)域，如對一些生物分子的檢測和標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型的染料。本發(fā)明的另一個目的在于提供該染料的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供該類染料在檢測G-四鏈體和i-motif結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
4
發(fā)明提供了ー種新型染料，其結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.一種染料，其特征在于結(jié)構(gòu)式為Ar-RM式中-Ar為芳香環(huán)或芳香雜環(huán)；R為H、F、Cl、Br、I、烷基、環(huán)烷基、胺類取代基、硝基、羧基取代基中的一種； A—為陰離子。
2.如權(quán)利要求1所述的染料，其特征在于所述的Α—為N原子甲基化反應(yīng)后的陰離子。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的染料的制備方法，其特征在于包括以下步驟先用甲基化試劑，將2-甲基苯并噻唑甲基化，得到化合物V/再將2-吡咯酮與鄰氨基苯甲酸混合，在三氯氧磷存在下，關(guān)環(huán)反應(yīng)得到化合物f^^VA將其與甲基化試劑反應(yīng)，甲基化后得到化合物將其與化合物-S-W7-反應(yīng)，得到化合物再將其與帶取代的芳香醛反應(yīng)，得到最終染料化合物
4.如權(quán)利要求1或2所述的染料在檢測DNA特殊二級結(jié)構(gòu)上的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)1)將待測DNA溶于PH值7.2-7. 4的緩沖液，得到溶液A ；將該染料溶解，再用PH值 7. 2-7. 4的緩沖液稀釋，得到溶液B ；2)將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與染料的摩爾比大于等于1小于等于 3，混合后3到5分鐘，對混合液進(jìn)行顏色觀察或者紫外可見光譜分析；·2. 1)與溶液B對比，若混合液有明顯的顏色變化，出現(xiàn)染料單體的顏色，即可判斷待測 DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)；若混合液的顏色與溶液B的顏色一樣或者只有非常微弱的變化，仍為聚集體的顏色，既可以判斷待測DNA樣品為非G-四鏈體結(jié)構(gòu)；·2. 2)也可以對混合液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，與溶液B相比，若混合液紫外可見吸收光譜中最大吸收峰明顯紅移至染料單體特征峰，則可以判斷待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)；若混合液的紫外可見吸收光譜與溶液B相比，最大吸收峰沒有明顯的紅移現(xiàn)象，則可以判斷待測DNA為非G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測i-motif結(jié)構(gòu)1)將待測DNA溶于PH值5.5-6. 0的緩沖液，得到溶液C ；將該染料溶解，再用PH值 5. 5-6. 0的緩沖液稀釋，得到溶液D ；2)將溶液C和溶液D混合，是混合液中待測DNA與染料的摩爾比大于等于1小于等于 3，混合后3到5分鐘，對混合液進(jìn)行顏色觀察或者紫外可見光譜分析；·2. 1)與溶液D對比，若混合液有明顯的顏色變化，出現(xiàn)染料單體的顏色，即可判斷待測 DNA為i-motif結(jié)構(gòu)；若混合液的顏色與溶液C的顏色一樣或者只有非常微弱的變化，仍為聚集體的顏色，既可以判斷待測DNA樣品為非i-motif結(jié)構(gòu)；·2. 2)也可以對混合液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，與溶液D相比，若混合液紫外可見吸收光譜中最大吸收峰明顯紅移至染料單體特征峰，則可以判斷待測DNA為i-motif結(jié)構(gòu)； 若混合液的紫外可見吸收光譜與溶液D相比，最大吸收峰沒有明顯的紅移現(xiàn)象，則可以判斷待測DNA為非i-motif結(jié)構(gòu)。
7.如權(quán)利5和權(quán)利6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液或者 Tris-醋酸緩沖液；所述染料用二甲基亞砜溶解。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型染料的設(shè)計，制備及其在比色法檢測DNA特殊二級結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。該類染料制備簡單，易得，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可用于特異性檢測DNA特殊二級結(jié)構(gòu)，可以通過紫外可見吸收光譜，或者直接通過肉眼觀察就可以快速檢測出溶液中的DNA樣品的二級結(jié)構(gòu)。應(yīng)用該染料對DNA特殊二級結(jié)構(gòu)的檢測方法具有操作簡便，快捷，肉眼可見的優(yōu)點，克服了其他檢測方法價格昂貴，設(shè)備要求高，技術(shù)操作相對復(fù)雜等缺點。
文檔編號C09B23/10GK102408741SQ201110273189
公開日2012年4月11日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者古練權(quán), 葉文杰, 譚嘉恒, 顏金武, 黃志紓 申請人:中山大學(xué)