專利名稱：一種促進(jìn)小球藻生長并提高其葉綠素和菌體蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用廉價(jià)纖維素生物質(zhì)促進(jìn)小球藻生長及提高葉綠素量和菌體蛋白的方法。
背景技術(shù)：
小球藻屬于綠藻門，是一類普通單細(xì)胞藻類，形狀呈圓形或橢圓形，種類繁多，在淡水、海水中均有分布，在人工培養(yǎng)基上也能良好生長，是第一種人工培養(yǎng)的微藻(陳穎，李文彬，孫勇如.小球藻生物技術(shù)研究應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J].生物工程進(jìn)展，1998，18 ￠) : 12-16)。由于小球藻分布廣泛，生長速度快，易于培養(yǎng)，是進(jìn)行生物技術(shù)研究很好的材料。小球藻作為一種添加劑，可以廣泛用于食品行業(yè)，同時(shí)可以利用其生產(chǎn)葉綠素、脯氨酸、油脂(李志勇，郭祀遠(yuǎn)，李琳.微藻保健食品的開發(fā)與利用[J].食品研究與開發(fā).1997，18(2). 38-40)。在臨床上小球藻已用于多種疾病如高血壓、糖尿病、嬰兒營養(yǎng)不良、動(dòng)脈粥樣硬化和高膽固醇血癥的治療等(Pinnan Soong. Production and Development of Chlorella and Spirulina in Taiwan. Shelef and Soeder CJ[J]. Algae Biomass Production an d Use. Amserdam, 1997，103:23-26.)。利用小球藻處理廢水，可有效地去除廢水中有機(jī)物質(zhì)氮、磷和重金屬，并且還可異氧培養(yǎng)，將富含養(yǎng)分的無毒廢水進(jìn)行資源化處理，為廢水的資源化處理提供了一條新的高效而經(jīng)濟(jì)的途徑(胡月薇，邱承光.小球藻處理廢水研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2003，26 (4): 48-49)。此外，小球藻還具有抗腫瘤、 抗微生物生長及增強(qiáng)免疫力等生理作用。本發(fā)明以纖維素生物質(zhì)高溫?zé)峤猱a(chǎn)物內(nèi)醚糖或熱解液作為生長促進(jìn)劑，可以提高小球藻的產(chǎn)量，為上述各種應(yīng)用提供更多的原材料。
纖維素類生物質(zhì)主要指樹木、農(nóng)作物、草類等，廣義的生物質(zhì)還包括城市垃圾和工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的下腳料等(Mckendry P. Energy production from biomass (parti) :overview ofbiomass[J]. Bioresource Technology, 2002, 83 :37_46)。目前的生物質(zhì)處理方法主要有酸解、酶解和熱化學(xué)處理法，其中熱化學(xué)轉(zhuǎn)化通常又可分為熱解、氣化和燃燒法，熱解技術(shù)是熱化學(xué)處理技術(shù)研究的核心和熱點(diǎn)，是在完全無氧或氧含量極小因而氧化反應(yīng)程度極為有限的情況下進(jìn)行的降解反應(yīng)(Demirbas A. Biomass resource facilities and biomass conversion processing for fuels and chemicals[J]. Energy Conversion&Man agement, 2001, 42:1357-1378)(Bridgewater A V. Principles and practice of biomass fast pyrolysis processes for liquids[J]. Journal of Analyti cal and Applied Pyrolysis, 1999，51:3-22)。熱解技術(shù)與稀酸水解法、同步糖同化法相比,原料處理時(shí)間短， 糖得率高，有望降低生產(chǎn)成本(任普鮮，蔣劍春，楊秀山，劉軍利.木質(zhì)纖維素快速熱解產(chǎn)物生產(chǎn)燃料乙醇研究進(jìn)展[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2009，43 (3) :47-51)。
現(xiàn)有研究表明，通過控制熱解條件可以有效地將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成含有高濃度內(nèi)醚糖(1，6_脫水-13D_吡喃葡萄糖)的熱解液，但自然界能利用內(nèi)醚糖的微生物很少。隨著纖維素?zé)峤饧夹g(shù)研究的深入，內(nèi)醚糖在微生物培養(yǎng)中的應(yīng)用引起了人們關(guān)注。內(nèi)醚糖可促進(jìn)樹干畢赤酵母的生長，在YPD培養(yǎng)基中加入O. 1%的內(nèi)醚糖，菌體濃度增加14. 3%，乙醇產(chǎn)率提高25. 4%(代江紅，余志晟，王曉燕，張洪勛.樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的利用，食品與發(fā)酵工業(yè)[D].北京中國科學(xué)院研究生院，2010)。韓國應(yīng)用內(nèi)醚糖對微球藻進(jìn)行培養(yǎng)， 最高促生長量為 150%(Luyen H Q, Cho J, Shin H, et al. Microalgal growth enhancement by levoglucosan isolated from the green sea-weed Monostroma nitidum[J]· Journal of Applied Phycology,2007, 19 (2) : 175-180)。但韓國報(bào)道中應(yīng)用的內(nèi)醚糖為藻類的提取物。
葉綠素具有排除腸、肝、腎及血管中毒素，凈化血液，刺激細(xì)胞組織重生等作用，因此以內(nèi)醚糖和熱解液為促進(jìn)劑，可大幅度增加葉綠素產(chǎn)量。
小球藻是單細(xì)胞蛋白(SCP)的重要來源之一。小球藻所含的維生素A、維生素E、 硫氨素、核黃素、吡多醇、維生素B12、維生素C、生物素、肌醇、葉酸、泛酸鈣、煙酸及葉綠素等增加了其作為SCP的價(jià)值。通過以內(nèi)醚糖和熱解液促生小綠球藻，為小球藻單細(xì)胞蛋白的高質(zhì)量生產(chǎn)提供了一條有效途徑。
纖維素類生物質(zhì)原料來源廣泛，以纖維素生物質(zhì)熱解液的主要產(chǎn)物-內(nèi)醚糖和熱解液為促進(jìn)劑，可使纖維素生物質(zhì)得到更有效的利用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在用內(nèi)醚糖和熱解液促進(jìn)小球藻(Cladophora aegagrophila)快速生長，并提高培養(yǎng)液中菌體葉綠素和菌體蛋白含量。
本發(fā)明提供一種促進(jìn)小球藻生長并提高葉綠素和菌體蛋白含量的方法，是在小球藻培養(yǎng)液中添加來自生物質(zhì)熱解的內(nèi)醚糖或經(jīng)脫毒處理的纖維素?zé)峤庖?。?nèi)醚糖添加量為5mM-50mM，最適濃度為25mM，纖維素?zé)峤庖禾砑恿堪粗亓勘佑?jì)為O. 25%_2%，最適濃度為O.5%。
本發(fā)明除在培養(yǎng)液中添加內(nèi)醚糖或熱解液外，其他培養(yǎng)條件按常規(guī)培養(yǎng)小球藻的要求進(jìn)行。分別用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法測定小球藻的生物量。
本發(fā)明中的內(nèi)醚糖來自秸桿、木材或竹材纖維素?zé)峤庖?，與從生物中直接提取相比，其來源、生產(chǎn)效率和產(chǎn)量均有巨大的優(yōu)勢，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱解液和內(nèi)醚糖對藻類葉綠素和蛋白質(zhì)含量均有提高的作用。內(nèi)醚糖為纖維素?zé)峤庖旱闹饕煞种唬瑹峤庖褐兄饕煞譃閮?nèi)醚糖(約占38%)，但熱解液中還含有酚類、醛類等對小球藻有害的物質(zhì)，所以熱解液必須脫毒后才能使用。利用熱解液中內(nèi)醚糖的成分作為促進(jìn)劑，無須從熱解液中提取和純化內(nèi)醚糖，熱解液中的內(nèi)醚糖不經(jīng)提取作為作為液體促進(jìn)劑使用成本更低。
本發(fā)明中所提到的熱解液或內(nèi)醚糖通過常規(guī)方法制備，具體方法是將秸桿、竹材、 木材等生物質(zhì)烘干并粉碎，利用管式爐熱解反應(yīng)器(主要由管式爐熱解器、電加熱器、溫控儀、冷凝和真空系統(tǒng)組成)在高溫條件下進(jìn)行熱解，收集冷凝得到的組分即為熱解液，熱解液經(jīng)脫毒使用，或經(jīng)常規(guī)提取方法得到其中的內(nèi)醚糖。
本發(fā)明中所述的熱解液經(jīng)脫毒是指將熱解液稀釋后，加入脫毒劑(5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣、5%活性炭、5%沸石等)，室溫下震蕩脫毒2h，過濾后即得到脫毒好的熱解液。


圖1內(nèi)醚糖濃度對小球藻生長量的影響(培養(yǎng)時(shí)間5天)。
圖2熱解液濃度對小球藻生長量的影響(培養(yǎng)時(shí)間5天)。
圖3內(nèi)醚糖濃度對小球藻葉綠素含量的影響(培養(yǎng)時(shí)間5天)。
圖4-圖7內(nèi)醚糖濃度(OmM，IOmM, 25mM, 50mM)對小球藻促生長的顯微攝影照片。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明本發(fā)明，舉例是為了說明本發(fā)明的過程， 而非僅限于實(shí)施例。
葉綠素測定方法小球藻培養(yǎng)液IOmL, IOOOOrpm離心5min,加入2ml DMF (二甲基甲酰胺)4°C避光24h，離心取上清液，測定647nm和664. 5nm下吸光度，根據(jù)下式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量
葉綠素a=[12. 7XOD664J-[2. 79XOD647]
葉綠素 b= [20. 7 X OD647] + [4. 62 X OD664.5]
總?cè)~綠素Total chi = 17. 9 X 0D647+8. 08 X OD664 5°
實(shí)施例1
50ml藻液中加入IOmM內(nèi)醚糖，另外一份作對照(不加內(nèi)醚糖),在25°C, 4000Lux 光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與空白對照相比，產(chǎn)量增加率為92%，總?cè)~綠素量增加82%，菌體蛋白增加76%. (5mM-50mM濃度的內(nèi)醚糖對小球藻促生作用見圖1所示，對葉綠素含量的影響見圖3所示)O
實(shí)施例2
50ml藻液中加入25mM內(nèi)醚糖,另外一份作對照(不加內(nèi)醚糖)，在250,4000Lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與對照相比，產(chǎn)量增加194%，總?cè)~綠素含量增加156%，菌體蛋白增加122%。
實(shí)施例3
50ml藻液中加入50mM內(nèi)醚糖,另外一份作對照(不加內(nèi)醚糖)，在250,4000Lux光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與對照相比，產(chǎn)量增加155%，總?cè)~綠素含量增加121%，菌體蛋白增加99%。
實(shí)施例4
50ml藻液中加入O. 25%熱解液(經(jīng)5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣脫毒)，另外一份作對照(不加熱解液)，在25°C，4000LuX光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與對照相比，產(chǎn)量增加39%，總?cè)~綠素含量增加32%，菌體蛋白增長29%.(濃度為O. 25%-2%的熱解液對小球藻促生長作用見圖2所示)。
實(shí)施例5
50ml藻液中加入O. 5%熱解液(經(jīng)5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣脫毒)，另外一份作對照(不加熱解液)，在25°C，4000LuX光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與對照相比，產(chǎn)量增加98%，總?cè)~綠素含量增加87%，菌體蛋白增加72%。
實(shí)施例6
50ml藻液中加入1. 25%熱解液(經(jīng)5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣脫毒)，另外一份作對照(不加熱解液)，在25°C，4000LuX光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)5天(每天定時(shí)搖勻)，用血球板計(jì)數(shù)法和光密度法檢測小球藻的生長量，與對照相比，產(chǎn)量增加60%，總?cè)~綠素含量增加58%，菌體蛋白增加62%。
實(shí)施例7
將實(shí)施例5中熱解液脫毒方法5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣換成5%活性炭脫毒， 與對照相比，小球藻產(chǎn)量增加52%，總?cè)~綠素含量增加62%，菌體蛋白增加44%。
實(shí)施例8
.將實(shí)施例5中熱解液脫毒方法5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣換成5%沸石脫毒，與對照相比，小球藻產(chǎn)量增加63%，總?cè)~綠素含量增加67%，菌體蛋白增加65%。
實(shí)施例9
將實(shí)施例5中熱解液脫毒方法5%活性炭脫毒+5%氫氧化鈣換成5%硅藻土脫毒， 與對照相比，小球藻產(chǎn)量增加49%，葉綠素含量增加60%，菌體 蛋白增加42%。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)小球藻生長并提高葉綠素和菌體蛋白含量的方法，是在小球藻培養(yǎng)液中添加來自生物質(zhì)熱解的內(nèi)醚糖或經(jīng)脫毒處理的纖維素?zé)峤庖?，?nèi)醚糖添加量為5mM-50mM，纖維素?zé)峤庖禾砑恿堪粗亓坑?jì)為O. 25%-2%。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述內(nèi)醚糖添加量為25mM，纖維素?zé)峤庖禾砑恿繛镺. 5%。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述纖維素?zé)峤庖菏墙諚U、木材或竹材纖維素?zé)峤庖骸?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速促進(jìn)小球藻(Nannochlorisoculata)生長并且提高其葉綠素和單細(xì)胞蛋白含量的方法。本發(fā)明是在小球藻培養(yǎng)液中添加來自生物質(zhì)熱解的內(nèi)醚糖或經(jīng)脫毒處理的纖維素?zé)峤庖?，?nèi)醚糖添加量為5mM-50mM，纖維素?zé)峤庖禾砑恿堪粗亓坑?jì)為0.25%-2%。以纖維素生物質(zhì)高溫?zé)峤猱a(chǎn)物內(nèi)醚糖或熱解液作為促進(jìn)劑，結(jié)果表明內(nèi)醚糖或熱解液能明顯促進(jìn)小球藻的生長，促進(jìn)率最高達(dá)194%，并可顯著提高葉綠素和菌體蛋白含量，從而可提高纖維素生物質(zhì)的利用價(jià)值。
文檔編號C12N1/12GK103045481SQ20131000474
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者陳育如, 孫歡, 趙乙萱, 劉軍利, 衛(wèi)民 申請人:南京師范大學(xué)