專利名稱：一種驗(yàn)證cidec基因5端調(diào)控區(qū)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)遺傳效應(yīng)的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)遺傳效應(yīng)的驗(yàn)證方法與應(yīng)用，特別涉及一種驗(yàn)證黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)遺傳效應(yīng)的驗(yàn)證方法。
背景技術(shù)：
SNP是基因組上的單個(gè)核苷酸的變異所形成的遺傳標(biāo)記，基因組上的SNP數(shù)量多，而且多態(tài)性豐富。據(jù)研究SNP在基因組中分別相當(dāng)廣泛，人類基因組中每300個(gè)堿基對就出現(xiàn)一次。SNP可以分為單個(gè)核苷酸的置換、顛換、缺失和插入。從對生物的遺傳性狀的影響的分子機(jī)制上來看，SNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymousc SNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymousc SNP),指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因，cSNP中約有一半為非同義cSNP。錯(cuò)義SNP功能分析的一個(gè)重要問題是預(yù)測一個(gè)特定的錯(cuò)義SNP是否是有害的，一般采用一系列離散或連續(xù)的特征來構(gòu)造預(yù)測模型，包括SNP位點(diǎn)的氨基酸物理和化學(xué)特征，SNP位點(diǎn)和附近區(qū)域的序列保守性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)化特征等，這些特征可大致分為基于序列的和基于結(jié)構(gòu)的。同義SNP雖然不改變基因編碼的蛋白質(zhì)序列，但其也具有重要的作用，特別在影響基因外顯子剪切方面。按照SNP在基因組上的位置不同又可以將SNP分為以下幾類:大約有95%的SNP位于非編碼區(qū)，其中有一小部分位于基因調(diào)控區(qū)的SNP位點(diǎn)成為調(diào)控SNP (rSNP);而存在于基因編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)稱為編碼SNP (cSNP).目前對編碼區(qū)SNP研究比較多，對于非編碼區(qū)的SNP，雖然其功能研究意義重大，但是該區(qū)域的SNP數(shù)據(jù)難以收集，所以沒有得到和編碼區(qū)SNP的研究那樣的重視。而本專利以CIDEC基 因?yàn)槔峁┝艘环N新的驗(yàn)證位于非編碼區(qū)SNP遺傳效應(yīng)的思路。CIDEC基因?qū)儆贑IDE家族，該家族成員還有CIDEA和CIDEB。該家族成員序列有高度同源性，它們都包含一個(gè)CIDE氮端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CIDE碳端結(jié)構(gòu)域。以前的研究結(jié)果認(rèn)為CIDE家族成員與胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，近些年來很多研究證明CIDE家族也參與了很多重要代謝過程的調(diào)控，例如肥胖。尤其是CIDEC基因，在小鼠上該基因也叫脂肪特異蛋白27 (Fsp27)，該基因?qū)τ趩畏啃灾蔚男纬珊桶咨窘M織的能量儲(chǔ)存非常重要。Fsp27敲除小鼠表現(xiàn)出由于高能量消耗引起的消瘦體型，同時(shí)這些小鼠還表現(xiàn)出抵抗飲食誘導(dǎo)性肥胖和胰島素抵抗。一個(gè)女性患者CIDEC基因碳端的突變導(dǎo)致其患有脂肪代謝障礙綜合癥。從這些研究可以推測出CIDEC基因可能對牛的脂肪代謝也很重要，尤其是對牛肉的肌間脂肪沉積有重要作用。我們經(jīng)過試驗(yàn)也驗(yàn)證了這個(gè)推測，我們在牛CIDEC基因5端調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了 10個(gè)SNP突變位點(diǎn)，這10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在213頭的南陽牛群體中共形成了 9種單倍型，經(jīng)與南陽牛體重和日增重進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，不同單倍型與南陽牛18月齡體重和日增重顯著相關(guān)，差異極顯著。本專利描述了一種驗(yàn)證CIDEC基因5端SNP位點(diǎn)遺傳效應(yīng)的新思路，以便促進(jìn)中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于通過CIDEC基因不同單倍型所顯示的不同活性來驗(yàn)證它們與黃牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):黃牛CIDEC 基因(AC_000179.1) 5 端調(diào)控區(qū)有十處 SNP 位點(diǎn):g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -727C>T; -762C>T; -763C>T; _841T>C; _956G>A; -974C>T,這十處 SNP 位點(diǎn)在南陽牛群體中共形成了 9種單倍型，其中單倍型5，6，7頻率過低，所以在轉(zhuǎn)錄活性分析中只分析了單倍型1，2，3，4，8，9六種。黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法包括以下步驟:(I)、以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴(kuò)增黃牛CIDEC基因不同單倍型；(2)、對步驟(I)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化；(3)用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI分別消化步驟(2)的純化產(chǎn)物和熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3_Basic質(zhì)粒；(4)步驟(3)中的消化產(chǎn)物經(jīng)切膠回收及純化；
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(5)使用T4DNA連接酶將步驟(4)中的純化產(chǎn)物進(jìn)行連接；(6)將步驟(5)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取的單克隆通過菌液PCR、雙酶切鑒定以及測序三重驗(yàn)證；(7)將步驟(6)中連接正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中，48小時(shí)以后使用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒測定不同單倍型的轉(zhuǎn)錄活性；(8)將步驟(7)中的不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性與其與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行比對，達(dá)到驗(yàn)證關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的目的。(9)將包含十個(gè)突變序列的相應(yīng)CIDEC片段輸入Genomatix數(shù)據(jù)庫(http://www.genomatix.de),搜索識(shí)別序列包含或臨近這十個(gè)突變位點(diǎn)的順式作用元件。從順式作用元件與其對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子水平解釋關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(I)所述的引物對P為:上游引物:cggggtacctgggaacaggagaacatttcag 3Ibp ；下游引物:ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca 32bp0所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;30 個(gè)循環(huán) 94°C變性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 60s ;72°C延伸lOmin。如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(2)、(4)所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1.5%。
如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(3)所述的酶切體系為:KpnI和XhoI各5 μ L，IOXBuffer MlO μ L，純化產(chǎn)物或pGL3-Basic載體質(zhì)粒〈5 μ g,超純水補(bǔ)至100 μ L。如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(5)所述的連接體系為:10XT4DNA Ligase Bufferl μ L, DNA 片段 XyL，pGL3_Basic載體(約50叩/^1^)1口1^，T4DNA Ligase (3U/μ L) I μ L，加超純水至10 μ L，其中載體與目的片段的摩爾比控制在1:3-1:8。如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(6)所述的菌液PCR所使用的引物和擴(kuò)增條件與步驟(I)中的一樣，步驟(6)所述的雙酶切體系為:KpnI和XhoI各I μ L，IOXBuffer Ml μ L，連接產(chǎn)物質(zhì)粒〈0.5 μ g，超純水補(bǔ)至10 μ L0如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(7)所述的轉(zhuǎn)染體系為:385ng不同單倍型載體，15ng內(nèi)參質(zhì)粒載體pRL_TK, I μ L脂質(zhì)體2000，60 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基。


圖1為黃牛CIDEC基因PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為黃牛pGL3-Basic_CIDEC系列表達(dá)載體雙酶切鑒定圖；圖3為黃牛pGL3-Basic_CIDEC系列表達(dá)載體菌液PCR檢測圖；圖4牛CIDEC基因不同 單倍型轉(zhuǎn)錄活性示意圖。將不同單倍型(BtCIDEC_Hl，BtCIDEC-H2, BtCIDEC-H3, BtCIDEC_H4，BtCIDEC_H8 和 BtCIDEC_H9)轉(zhuǎn)染小鼠 3T3-L1 細(xì)胞后測定熒光素酶活性。使用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值來表示單倍型的相對轉(zhuǎn)錄活性。誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增得到黃牛CIDEC基因不同單倍型，擴(kuò)增產(chǎn)物通過純化、酶切后連接到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic上，代表不同單倍型的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞中，通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒測定不同單倍型的轉(zhuǎn)錄活性，通過與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行比對，達(dá)到驗(yàn)證關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的目的。下面結(jié)合對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1、CIDEC基因不同單倍型的擴(kuò)增及真核表達(dá)載體的構(gòu)建1.1黃牛CIDEC基因不同單倍型的擴(kuò)增以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴(kuò)增黃牛CIDEC基因不同單倍型(具體單倍型信息如表I)。表1.南陽牛CIDEC基因10個(gè)SNPs的單倍型及其頻率
權(quán)利要求
1.黃牛CIDEC 基因(AC_000179.1 )5 端調(diào)控區(qū)有十處 SNP 位點(diǎn):g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -727C>T; -762C>T; -763C>T; _841T>C; _956G>A; -974C>T,這十處 SNP 位點(diǎn)在南陽牛群體中共形成了九種單倍型，其中單倍型5，6，7頻率過低，所以在轉(zhuǎn)錄活性分析中只分析了單倍型1，2，3，4，8，9六種。
2.黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法包括以下步驟: (1)以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴(kuò)增黃牛CIDEC基因不同單倍型； (2)對步驟(I)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化； (3)用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI分別消化步驟(2)的純化產(chǎn)物和熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3_Basic質(zhì)粒； (4)將步驟(3)中的消化產(chǎn)物經(jīng)切膠回收及純化； (5)使用T4DNA連接酶將步驟(4)中的純化產(chǎn)物進(jìn)行連接； (6)將步驟(5)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取的單克隆通過菌液PCR、雙酶切鑒定以及測序三重驗(yàn)證； (7)將步驟(6)中連接正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中，48小時(shí)以后使用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒測定不同單倍型的轉(zhuǎn)錄活性； (8)將步驟(7)中的不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性與其與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行比對，從轉(zhuǎn)錄活性水平解釋關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 。
(9)將包含十個(gè)突變序列的相應(yīng)CIDEC片段輸入Genomatix數(shù)據(jù)庫(http://www.genomatix.de),搜索識(shí)別序列包含或臨近這十個(gè)突變位點(diǎn)的順式作用元件。從順式作用元件與其對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子水平解釋關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。
如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(I)所述的引物對P為: 上游弓I物:cggggtacctgggaacaggagaacatttcag 31bp ； 下游弓I物:ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca 32bp0 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 94°C預(yù)變性5min ；30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸60s ;72°C延伸lOmin。
3.如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(2)、(4)所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1.5%。
4.如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(3)所述的酶切體系為:KpnI和XhoI各5yL，IOXBuffer MlOyL,純化產(chǎn)物或pGL3-Basic載體質(zhì)?！? μ g,超純水補(bǔ)至100 μ L。
5.如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(5)所述的連接體系為:10XT4DNALigaseBufferl μ L，DNA 片段 Χμ L，pGL3_Basic 載體(約50ng/yL) lyL，T4DNA連接酶(3U/μ L) I μ L，加超純水至10 μ L，其中載體與目的片段的摩爾比控制在1:3-1:8。
6.如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(6)所述的菌液PCR所使用的引物和擴(kuò)增條件與步驟(I)中的一樣，步驟(6)所述的雙酶切體系為:KpnI和XhoI各I μ L，IOXBuffer Ml μ L，連接產(chǎn)物質(zhì)粒〈0.5 μ g，超純水補(bǔ)至10 μ L0
7.如上述技術(shù)方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法，其中，步驟(7)所述的轉(zhuǎn)染體系為:385ng不同單倍型載體，15ng內(nèi)參質(zhì)粒載體pRL_TK，I μ L脂質(zhì)體2000,60 μ L無血清DMEM培 養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種驗(yàn)證黃牛CIDEC基因SNPs位點(diǎn)遺傳效應(yīng)的方法，以包含CIDEC基因的黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛CIDEC基因不同單倍型；用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pGL3-Basic空載體后，再使用DNA連接酶將不同單倍型連接到pGL3-Basic載體上，構(gòu)建pGL3-Basic-CIDEC-H1、H2、H3、H4、H8、H9表達(dá)載體，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至3T3-L1細(xì)胞中，使用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒檢測不同單倍型的轉(zhuǎn)錄活性。綜合不同單倍型的轉(zhuǎn)錄活性，以及SNP位點(diǎn)改變順式作用元件的信息來驗(yàn)證關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。本發(fā)明提供的檢測方法為驗(yàn)證CIDEC基因的單核苷酸多態(tài)性遺傳效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK103243156SQ20131000390
公開日2013年8月14日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者陳宏 , 王璟, 滑留帥, 潘虹, 曹修凱, 藍(lán)賢勇, 胡沈榮, 雷初超 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)