專利名稱：黃牛cidec基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的快速檢測方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用DNA分子標(biāo)記，可進(jìn)行家畜基因圖譜的構(gòu)建，標(biāo)記輔助保護(hù)遺傳資源，預(yù)測家畜雜種優(yōu)勢、鑒定個體或品種遺傳分化和親緣關(guān)系的分析等研究。隨著家畜基因組計劃的深入發(fā)展，家畜分子標(biāo)記育種已經(jīng)成為家畜遺傳育種的主要工具并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價值。標(biāo)記輔助選擇經(jīng)歷了三個發(fā)展階段:第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記技術(shù)日漸成熟，使覆蓋整個基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)，這稱為分子標(biāo)記輔助選擇。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指基因組DNA中單個核苷酸變異引起的一種二等位基因，或二態(tài)的遺傳變異，即在該位置上存在兩種不同的堿基。其核苷酸的變異形式有轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等，而且其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。SNP作為遺傳標(biāo)記有很多優(yōu)勢:首先SNP數(shù)量多，分布廣泛，其次SNP適于快速、規(guī)?；Y選，SNP等位基因頻率容易估計，SNP易于基因分型，最后SNP標(biāo)記密度高。牛肉蛋白質(zhì)含量豐富，脂肪含量低，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，同時還具有較多的維生素和微量元素，是一種營養(yǎng)價值較高的肉食品，能提高機(jī)體抗病能力。隨著人們生活水平的提高，對牛肉的需求量也日益增加，這對我國肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有很大的推動作用。我國有著豐富的牛種資源，秦川牛為我國五大優(yōu)良地方品種之一，具有風(fēng)味濃郁、細(xì)嫩多汁的特點(diǎn)。缺點(diǎn)主要·表現(xiàn)在后軀不發(fā)達(dá)，產(chǎn)肉少，育肥增重速度趕不上國外的專門化肉牛品種，優(yōu)質(zhì)高檔肉塊產(chǎn)量少。提高高檔優(yōu)質(zhì)肉塊的產(chǎn)量，也就是平時所說的雪花牛肉產(chǎn)量，主要涉及提高牛肉的肌間脂肪含量，在分子育種水平，可以通過提高影響脂肪代謝，脂質(zhì)沉積的基因表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)。作為影響脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵調(diào)控因子CIDEC基因可以作為一個重要的候選基因。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的DFF45樣效應(yīng)因子(Celldeath-1nducingDFF45_like effector)家族有三個成員，CIDEA，CIDEB和CIDEC。這些家族成員具有很高的序列同源性:它們均含有特殊的CIDE氮端和CIDE碳端，其中CIDE氮端與DFF碎片因子氮端高度同源。起初，研究集中在它們的促進(jìn)凋亡作用，但是近期研究發(fā)現(xiàn)這三個成員也是重要的調(diào)控因子，能夠參與很多代謝調(diào)控過程。Hall等研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖的模型小鼠中，這三個成員(CIDEA，CIDEB和CIDEC)在肝細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。1998年，首次在TAl脂肪生成中鑒定出上調(diào)的CIDEC，在嚙齒類動物中這個基因也叫脂肪特異蛋白27 (Fsp27)，在人類研究中該基因被稱為CIDE3。有報道稱，由于卡路里攝入量的降低能夠誘導(dǎo)CIDE3基因的下調(diào)。一個女性病人CIDE3基因位于CIDE碳端的第186位氨基酸的突變(E186X)表現(xiàn)出部分脂肪代謝障礙，白色脂肪細(xì)胞有多房性脂滴，還表現(xiàn)出胰島素抵抗型糖尿病。這些研究證明CIDEC對于單房脂滴的形成以及人體脂肪組織最佳能量儲存有著非常重要的意義。肥胖群體肝臟中CIDEC的表達(dá)明顯上升，而且隨著體重降低肝臟CIDEC的表達(dá)也隨之降低。李等研究發(fā)現(xiàn)CIDEC是一個調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，減少脂肪細(xì)胞團(tuán)的靶基因。在人泡沫細(xì)胞中，CIDEC對細(xì)胞中脂滴的形成，分解以及動脈粥樣硬化過程很重要。也有結(jié)果表明，在人體脂肪細(xì)胞中，胰島素通過P13K調(diào)控CIDEC的表達(dá)。Fsp27/CIDEC敲除小鼠表現(xiàn)出較瘦的表型，因?yàn)楦吣芰肯牡街付ㄖ窘M織萎縮，說明Fsp27/CIDEC與線粒體功能相關(guān)。這個敲除小鼠也受到抵抗飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗。在二型糖尿病模型小鼠肝臟中也檢測到Fsp27/CIDEC的表達(dá)，在脂肪組織和肝臟中的生理作用證明了 Fsp27/CIDEC參與代謝紊亂的發(fā)展。在TAKl (/)小鼠的脂肪組織中，肝臟和原發(fā)性肝細(xì)胞中CIDEA和CIDEC顯著降低，這些小鼠表現(xiàn)出明顯的肝臟甘油三酯的降低和脂質(zhì)堆積的減少。在ROR alpha(sg/sg)小鼠肝臟中，CIDEC和CIDEA表達(dá)水平也降低了很多。還有研究表明Ad-36能夠誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞中的脂滴形成，這個過程可能是由促進(jìn)Fsp27/CIDEC的表達(dá)介導(dǎo)的。Kim等提出再脂肪細(xì)胞分化過程中，PPARg對于CIDEC的轉(zhuǎn)錄活性很重要，這個結(jié)果有助于了解脂肪細(xì)胞脂滴形成的分子機(jī)制。關(guān)于牛CIDEC基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如:體重和日增重等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。本發(fā)明提供的檢測方法為CIDEC基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立 奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS )，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用Forced-PCR-RFLP方法檢測黃牛CIDEC基因的多態(tài)性，并將其與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴(kuò)增黃牛CIDEC基因；用限制性內(nèi)切酶HaeII1、Acc1、HaeIII分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的單核苷酸多態(tài)性，所述的引物對Pl為:上游引物:agctgtgctgcccaggatggctgccagcgg30bp ；下游引物:gggactttctaccatggtgggttctatatcc ； 31bp0所述的引物對P2為:上游引物:ggcactgctggtggaggaactgacttcagg30bp ；下游引物！cttattgaatgttaactggtttagatgtat ； 30bp。所述的引物對P3為:上游引物:gactctgtccccaaggacagaaactagctgag32bp ；
下游引物:accaagttggagaccccctcagtacccaggctcggc ；36bp。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 5min ;30 34 個循環(huán) 94°C 變性 30s，62、60、58 °C 退火 30s，72 °C 延伸30s ;72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.5%。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛CIDEC基因第-974位的單核苷酸多態(tài)性為:CC基因型表現(xiàn)為165bp條帶和30bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為195bp、165bp和30bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為195bp。第-956位的單核苷酸多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為174bp條帶；GA基因型表現(xiàn)為174bp、144bp和30bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為144bp和30bp。第-501位的單核苷酸多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為143bp條帶和35bp ;GA基因型表現(xiàn)為178bp、143bp和35bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為178bp。本發(fā)明根據(jù)CIDEC基因的序列設(shè)計引物，分別以5種黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序后得到黃牛CIDEC基因的部分序列。與NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)在存在第_974位、第-956位、第-841位，第-763位，第-727位，第-714位，第-643位，第-546位，第-501位十處SNP多態(tài)性。針對上述十處SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計特定的弓I物PCR擴(kuò)增特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對5個黃牛品種的SNP基因型進(jìn)行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點(diǎn)與黃牛部分生長性狀(體重和日增重等)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高黃牛生長性狀的分子標(biāo)記。


圖1為檢測黃牛CIDEC基因5端多態(tài)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為黃牛CIDEC基因酶切電泳結(jié)果圖，其中圖2a、2b、2c分別為黃牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位的多態(tài)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果；圖3為黃牛CIDEC基因SNP多態(tài)性測序結(jié)果圖，其中圖3a、3b、3c分別為黃牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位多態(tài)位點(diǎn)的測序結(jié)果圖，曲線上方的“方框”包括的堿基為突變堿基；圖4是本發(fā)明用來檢測SNP多態(tài)性的PCR引物設(shè)計和擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)突變的示意圖，圖4a、4b、4c分別檢測是黃牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位多態(tài)位點(diǎn)的PCR引物設(shè)計，其中方框中表示突變位點(diǎn)、陰影部分為內(nèi)切酶識別序列，小寫是引入的錯配堿基。
具體實(shí)施方式
:本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對黃牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行 檢測，下面結(jié)合對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛CIDEC基因含5端側(cè)翼區(qū)PCR引物的設(shè)計
以NCBI所公布的牛(AC_000179.1)序列為參考，利用Primer5.0設(shè)計能夠擴(kuò)增包含黃牛CIDEC基因5端側(cè)翼區(qū)的PCR引物。擴(kuò)增5端側(cè)翼區(qū)的引物為:上游引物:aggagaacatttcagggtg19bp;下游引物:gcagtggaagttgggag17bp0以上述引物對黃牛基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增包含黃牛CIDEC基因5端側(cè)翼區(qū)片段，對擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序鑒定后，共發(fā)現(xiàn)十處突變位點(diǎn):AC_000179.l:g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -7270T; -7620T; -7630T; _841T>C; _956G>A; -974C>T。經(jīng)過分析，其中第-956位，第-841，-763，-727和-546位完全連鎖，第-501位和第-643位完全 連鎖，所以檢測第-974位、第-956位、第-501位的單核苷酸多態(tài)性即可代表這九處SNP的多態(tài)信息，而以上三處SNP均不存在天然酶切位點(diǎn)，因此，通過設(shè)計引物P(P1、P2、P3)分別對以上三處SNP引入HaeII1、Acc1、HaeIII酶切位點(diǎn)(其中_714T>C突變位點(diǎn)和任何位點(diǎn)都沒有連鎖關(guān)系，而且在群體中的頻率非常低，所以本實(shí)驗(yàn)后期多態(tài)檢驗(yàn)并沒有涉及該位點(diǎn))。b、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測黃牛的CIDEC基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以4個中國地方黃牛品種和I個中國培育品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1:表I黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
1.一種檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴(kuò)增黃牛CIDEC基因；用限制性內(nèi)切酶HaeII1、Acc1、HaeIII分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的單核苷酸多態(tài)性， 所述的引物對Pl為: 上游引物:agctgtgctgcccaggatggctgccagcgg 下游引物:gggactttctaccatggtgggttctatatcc ； 所述的引物對P2為: 上游引物:ggcactgctggtggaggaactgacttcagg 下游引物:cttattgaa tgttaactggtttagatgtat ； 所述的引物對P3為: 上游引物:gactctgtccccaaggacagaaactagctgag 下游引物:accaagttggagaccccctcagtacccaggctcggc。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 94°C 預(yù)變性 5min ;30 34 個循環(huán) 94°C變性 30s，62、60、58 °C退火 30s，72°C 延伸 30s ；72°C延伸 lOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.5%。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛CIDEC基因第-974位的單核苷酸多態(tài)性為:CC基因型表現(xiàn)為165bp條帶和30bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為195bp、165bp和30bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為195bp。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，第-956位的單核苷酸多態(tài)性為=GG基因型表現(xiàn)為174bp條帶；GA基因型表現(xiàn)為174bp、144bp和30bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為144bp和30bp。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，第-501位的單核苷酸多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為143bp條帶和35bp ;GA基因型表現(xiàn)為178bp、143bp和35bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為178bp。
7.權(quán)利要求1至7中任意一項權(quán)利要求所述的檢測黃牛CIDEC基因單核苷酸多態(tài)性的方法在鑒定不同黃牛群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
8.權(quán)利要求8所述的診斷應(yīng)用，其特征在于，鑒定不同黃牛多態(tài)性是，黃牛CIDEC基因BtCIDEC-H8/BtCIDEC-H8組合型可以作為為提高黃牛體重和日增重的候選分子遺傳標(biāo)記。CIDEC基因可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的候選基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃牛CIDEC基因5’調(diào)控區(qū)多個單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P(P1、P2、P3)為引物，PCR擴(kuò)增黃牛CIDEC基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII、AccI、HaeIII分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的單核苷酸多態(tài)性，因?yàn)橥耆B鎖，第-956位的多態(tài)性也代表了第-841,-763,-727和-546位的多態(tài)性、第-501位的多態(tài)性也代表了第-643位的單核苷酸多態(tài)性，這樣檢測三個位點(diǎn)的多態(tài)性就可以得到九個位點(diǎn)的多態(tài)信息。本發(fā)明提供的檢測方法為CIDEC基因的單核苷酸多態(tài)性與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK103243155SQ20131000390
公開日2013年8月14日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者陳宏 , 王璟, 曹修凱, 潘虹, 滑留帥, 藍(lán)賢勇, 胡沈榮, 雷初超 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)