專利名稱：節(jié)桿菌zjb-09277及其在制備(s)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的菌種-節(jié)桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)，及利用該微生物選擇性拆分3-氰基-5-甲基己酸酯制備普瑞巴林中間體
(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技術(shù)：
(S)-3_氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的重要手性中間體。普瑞巴林，化學(xué)名為⑶-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是由美國(guó)輝瑞公司開發(fā)的的Y-氨基丁酸的3位異丁基取代物(Angew Chem Int Ed, 2008, 47(19): 3500-3504)。由于普瑞巴林能夠有效抑制與神經(jīng)病理性疼痛、癲癇相關(guān)的神經(jīng)元過度興奮及神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加(Curr OpinPharmacol, 2006, 6(1): 108- 113)，已被FDA批準(zhǔn)用于帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病外周神經(jīng)痛、癲癇、纖維肌痛等。與傳統(tǒng)藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數(shù)少、副作用小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性強(qiáng)(Curr Med Res Opin, 2006，22(2): 375-384)，因此被國(guó)際疼痛學(xué)會(huì)(IASP)、歐洲神經(jīng)病學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟(EFNS)和英國(guó)NICE等多個(gè)國(guó)際指南推薦為一線治療藥物，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)前景十分廣闊。國(guó)內(nèi)外報(bào)道了大量有關(guān)普瑞巴林及其中間體合成工藝的文獻(xiàn)，可歸為手性拆分法、不對(duì)稱催化法、手性配體法和手性化合物直接合成法等四大類化學(xué)合成工藝。由于上述工藝步驟冗長(zhǎng)、手性拆分試劑昂貴、反應(yīng)條件苛刻、有毒有害溶劑用量大，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。生物催化法由于反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)成為最受矚目的醫(yī)藥及精細(xì)化學(xué)品合成技術(shù)之一。目前，已報(bào)道的生物催化合成普瑞巴林手性中間體工藝主要有以下幾種:Xie 等(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 41: 75 - 80)以從Arabidopsis thaliana中克隆得到的重組腈水解酶AtNitl為催化劑拆分外消旋異丁基丁二腈合成(S) -3-氰基-5-甲基己酸，ee值高達(dá)98%，(S) -3-氰基-5-甲基己酸催化加氫，制得普瑞巴林。Felluga 等(Tetrahedron: Asymmetry, 2008, 19(8): 945-955)報(bào)道了以異戊醛為原料，在t-Bu0K存在條件下與Witting試劑反應(yīng)，得到α，β -不飽和酸酯。α，β-不飽和酸酯與硝基甲烷發(fā)生Michael加成得到外消旋β-異丁基-Y-硝基酯，經(jīng)Novozyme 435動(dòng)力學(xué)拆分得到S型β-異丁基-Y-硝基酸,最后在酸性環(huán)境中氫化還原得到普瑞巴林。Sterimbaum 等利用 Candida antartica 脂肪酶 CALB (Candida antarcticlipase B)選擇性酯化3_異丁基戊二酸，產(chǎn)物ee為95.5%，再通過化學(xué)反應(yīng)得到普瑞巴林(W02009158343-A1)。Thijs等在拆分步驟引入豬肝臟酯酶對(duì)吡咯酮化合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分，ee值達(dá)到97%，最后在酸性條件下水解2-吡咯酮得到普瑞巴林(W02009149928-A1)。輝瑞公司普瑞巴林生產(chǎn)工藝已經(jīng)更新至第二代，該工藝引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。該手性中間體經(jīng)脫羧、堿性水解、氫化等步驟制得普瑞巴林(US20050283023)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株可用于制備光學(xué)純(S)-3_氰基-5-甲基己酸的新菌種——節(jié)桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277)。其次提供該新微生物在選擇性拆分外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明涉及一種節(jié)桿菌ZJB-09277 (Arthrobacter sp.ZJB-09277),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日。該新菌株特征如下:菌落形態(tài):30 °C在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，直徑2 3 mm，隆起形狀為凸鏡狀，乳白色·，邊緣整齊，光滑。菌落隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，數(shù)天后直徑可達(dá)5 _以上。細(xì)胞形態(tài):16 h培養(yǎng)物的細(xì)胞呈不規(guī)則的桿狀，0.8 1.2 μ mX 1.8^8.0 μπι。呈V形排列，端圓，無(wú)絲狀體，無(wú)芽孢形成。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變短，老培養(yǎng)物變成球狀。生理生化特征:革蘭氏陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，利用Biolog (GENIII)自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行了 94種表型測(cè)試，包括71種碳源利用情況檢測(cè)以及23種化學(xué)敏感性檢測(cè)，具體特征見表I及表2。本發(fā)明所涉及的微生物是通過以下方法篩選得到的:(I)稱取從杭州及周邊地區(qū)采集的土樣I g加入到9 ml 0.85%的生理鹽水中，在渦流振蕩器上充分混勻。取上清I ml，加入到49 ml富集培養(yǎng)基中，30°C，150 rpm下培養(yǎng)72 h，然后再取I ml培養(yǎng)基加入到49 ml的富集培養(yǎng)基，30°C，150 rpm下培養(yǎng)72 h，如此進(jìn)行三輪富集。富集培養(yǎng)基以2 3 g/L (R，S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為唯一碳源，其它組分如下(g/L): (NH4)2SO4:5 15，MgSO4.7H20:0.5 1，NaCl:Γ .5，K2HPO4:Γ2, FeSO4.7Η20:
0.01 0.03，以蒸餾水配制，用1.0 M鹽酸或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.(Γ8.0。(2)最后一次富集培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落至斜面保藏。平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入1.5^2.0%的瓊脂。(3)挑取的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，組份如下(終濃度):葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏 5 15 g/L, (MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，NaCl Γ .5 g/L，K2HPO4 I 2g/L, FeSO4.7H 20 0.θΓθ.03 g/L, pH 6.0^8.0(115。C 下，滅菌 30 min) ;25 35°C下，搖瓶轉(zhuǎn)速15(T200 rpm，培養(yǎng)48 72 h，離心后懸浮于磷酸緩沖液體系中，加入(R，S)_3_氰基-5-甲基己酸酯作為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(4)用手性毛細(xì)管氣相色譜法分析底物和產(chǎn)物的含量及對(duì)映體過量值(ee)。所用氣相色譜儀為用日本島津GC-14C，手性毛細(xì)管氣相色譜柱為BGB-174。色譜條件為:進(jìn)樣量1.0 μ 1，進(jìn)樣口、檢測(cè)器的溫度均為220 °C;載氣為氦氣，流速為1.6 mL/min，流量為40 mL/min,分流比為30:1。3-氰基-5-甲基己酸乙酯和3-氰基-5-甲基己酸丙酯的程序升溫條件為:初始溫度為130 °C，保持17 min,以10 °C/min的速度升到170 °C，保持13 min ;3_氰基-5-甲基己酸丁酯的程序升溫條件為:110°C持30 min,5°C/min升溫至170°C,保持14 min ;3_氰基-5-甲基己酸戊酯的程序升溫條件為:130°C保持45 Hiinao0C /min升溫至170°C，保持11 min。本發(fā)明還涉及節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S) _3_氰基_5_甲基己酸中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯為底物，以節(jié)桿菌ZJB-09277發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或含濕菌體的菌懸液為催化劑，于PH 6.5^8.0的緩沖液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系a中，在25、0°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng),反應(yīng)完全后,將反應(yīng)液分離純化得到式(II)所示(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
權(quán)利要求
1.節(jié)桿菌ZJB-09277(Arthrobacter sp.ZJB-09277)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22曰。
2.—種權(quán)利要求1所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:以式(I )所示外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯為底物，以節(jié)桿菌ZJB-09277發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或含濕菌體的菌懸液為催化劑，于pH 6.5^8.0的緩沖液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系a中，在25、0°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng),反應(yīng)完全后,將反應(yīng)液分離純化得到式(II)所示⑶-3-氰基-5-甲基己酸；
3.如權(quán)利要求2所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體系a中底物初始濃度為100 400mmol/Lo
4.如權(quán)利要求2所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體系a中催化劑的質(zhì)量用量以濕菌體的質(zhì)量計(jì)為10(T300 g/L，所述濕菌體含水質(zhì)量為7(Γ90%。
5.如權(quán)利要求2所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體系a還包括有機(jī)溶劑，由底物、催化劑、有機(jī)溶劑與pH 6.5^8.0的緩沖液構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系b，有機(jī)溶劑占轉(zhuǎn)化體系b總體積1(Γ80%，轉(zhuǎn)化體系b中底物初始濃度為100 400mmol/L，催化劑的質(zhì)量用量以濕菌體的質(zhì)量計(jì)為10(T300 g/L，所述濕菌體含水質(zhì)量為70 90%。
6.如權(quán)利要求5所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜、二甲基甲酰胺或乙腈。
7.如權(quán)利要求2或5所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在25飛(TC下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12、6 h。
8.如權(quán)利要求2所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液分離純化方法為:反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液離心，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，有機(jī)層即為含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的粗品，將粗品提純即獲得(S) -3-氰基-5-甲基己酸。
9.如權(quán)利要求2所述節(jié)桿菌ZJB-09277在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備: (1)斜面培養(yǎng):將節(jié)桿菌ZJB-09277接種至斜面培養(yǎng)基，在3(T35°C下恒溫培養(yǎng)48 72h后，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖1(T20 g/L，酵母膏5 15 g/L,(MM)2SO4 5 15 g/L，MgSO4.7Η20 0.5 I g/L,NaCl Γ .5 g/L,K2HPO4 I 2 g/L，F(xiàn)eSO4.7Η200.0Γ0.03 g/L，瓊脂 15 20 g/L，溶劑為水，pH 6.0 8.0 ; (2)發(fā)酵培養(yǎng):從斜面菌體上挑取一接種環(huán)菌體，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在3(T35°C、150^200 rpm條件下振蕩培養(yǎng)36 72 h，培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液離心，沉淀用生理鹽水洗滌后，收集濕菌體，將濕菌 體懸浮于pH 7.0的磷酸緩沖液中，獲得含濕菌體的菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:檸檬酸鈉1(T25 g/L，酵母提取粉2(T40 g/L, Na2HPO4 Γ2 g/L,KH2PO4 Γ2 g/L，MgSO4.7H20 0.5 I g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 0.θΓθ.03 g/L，NaCl Γ .5 g/L，溶劑為水，pH 6.0 8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種節(jié)桿菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)及其在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó) 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日；本發(fā)明提供了一種立體選擇性水解制備 (S)-3-氰基-5-甲基己酸的新菌種，通過該菌種可制備普瑞巴林的重要手性中間體——(S)-3-氰基-5-甲基己酸；本發(fā)明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制備方法具有原子經(jīng)濟(jì)性高、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103114054SQ20121059404
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 鄭仁朝, 李愛朋, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)