專利名稱：與碳氮代謝相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及與碳氮代謝相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和隨之而來(lái)的汽車保有量的增加，石油消費(fèi)快速遞增，進(jìn)口依賴度日益增加，已經(jīng)對(duì)我國(guó)能源安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展形成了巨大影響和制約。發(fā)展石油的替代燃料已成當(dāng)務(wù)之急，其中燃料乙醇是目前世界上使用量最大、最現(xiàn)實(shí)可行的替代石油的生物燃料。加工燃料乙醇的原料包括淀粉類的玉米、薯類等，糖類的甘蔗、甜菜等以及纖維素類的秸桿等。在世界糧食生產(chǎn)中甘薯總產(chǎn)量排第七位，在我國(guó)排第四位，總產(chǎn)量?jī)H次于水稻、玉米和小麥。我國(guó)每年種植面積約600萬(wàn)公頃，約占世界甘薯種植面積的55.0%，是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)家，目前我國(guó)甘薯總產(chǎn)量約占世界的75.6% (FA0, 2008 )0甘薯高產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)，單位面積、單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量比水稻、小麥等主要糧食作物高得多，且富含淀粉，可以轉(zhuǎn)化為乙醇；而且甘薯耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣，特別適宜于丘陵山區(qū)種植，而不與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)糧爭(zhēng)地，還可以使農(nóng)民增收，緩解“三農(nóng)”問(wèn)題，成為世界各國(guó)公認(rèn)的最合適的能源作物之一。淀粉是植物通過(guò)光合作用產(chǎn)生的一種多糖高分子化合物，淀粉生物合成過(guò)程中有四種關(guān)鍵酶，即腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGpase)、淀粉合成酶(Starch Synthase)、分支酶(branching enzyme)及去分支酶(de-branchingenzyme)。在AGPase的作用下，葡萄糖-1-磷酸(Glu_l_P)與ATP作用生成ADP-葡萄糖(ADP-Glu)，隨后ADP-Glu合成具有一定結(jié)構(gòu)特性的淀粉結(jié)晶體。AGPase是淀粉合成過(guò)程中的限速酶，催化淀粉合成的第一步，其活性的改變將直接影響著淀粉的合成速率，直接決定貯藏組織中淀粉積累的水平
發(fā)明內(nèi)容
`本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與碳氮代謝相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的與碳氮代謝相關(guān)的蛋白，名稱為IbSnRKl,來(lái)源于甘薯(Ipomoeabatatas),如下的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物組織中淀粉含量相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。編碼上述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述基因是如下(1)-(3)中任一種的DNA分子(I)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物組織中淀粉含量相關(guān)蛋白的DNA分子；
(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物組織中淀粉含量相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
O.1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由1515個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為自5'末端第I位-第1515位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白。含有上述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
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在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為載體pCB⑶S ;上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入PCB⑶S·的Sac I和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。上述pCB⑶S載體是通過(guò)包括如下步驟的方法得到的(I)將pCAMBIA1301載體(購(gòu)自CAMBIA公司)經(jīng)過(guò)Hind III和EcoR I雙酶切，回收11786bp的載體大片段；(2)將pBI121載體(購(gòu)自Clontech公司；含35S啟動(dòng)子，gusA報(bào)告基因，nos終止子片段)也經(jīng)過(guò)Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)將步驟(I)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段經(jīng)T4DNA酶連接，得到重組載體pCB⑶S。上述pCAMBIA3301載體購(gòu)自CAMBIA公司；上述pBI121載體購(gòu)自Clontech公司。擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)為如下所示
權(quán)利要求
1.ー種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物組織中淀粉含量相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下(1)-(3)中任ー種的DNA分子 (1)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物組織中淀粉含量相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物組織中淀粉含量相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在干 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物組織中淀粉含量中的應(yīng)用； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。
8.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物組織中淀粉含量高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述組織為葉片； 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了與碳氮代謝相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供一種蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物組織中淀粉含量相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的IbSnRK1蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧蜔煵葜?，得到轉(zhuǎn)基因煙草，研究發(fā)現(xiàn)，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的淀粉含量提高，說(shuō)明該蛋白及其編碼基因在提高煙草葉片中的淀粉含量中具有重要的應(yīng)用價(jià)值；本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103044536SQ201210585260
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者劉慶昌, 翟紅, 何紹貞, 姜濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)