一種雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種編碼雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶中的應(yīng)用。該雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，再分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得重組大腸桿菌。改重組大腸桿菌含有重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，可以重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可以5’-三磷酸鳥(niǎo)苷三鈉(GTP)為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備環(huán)二鳥(niǎo)苷單磷酸(c-di-GMP)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種編碼雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體 轉(zhuǎn)化得到的重組工程菌、及在制備雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和生物合成c-di-GMP方面的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸（c-di-GMP)作為細(xì)菌第二信號(hào)分子，普遍存在于各種微生物中，包 括對(duì)人類(lèi)有害的病原菌。在這些微生物中，c-di-GMP調(diào)控著毒力因子的表達(dá)，生物膜的形 成，抗生素的耐藥性（ref. in Qinghua)。在急性與慢性細(xì)菌引起的感染與疾病中，c-di-GMP 有著非常重要的作用。因此c-di-GMP具有良好的藥物開(kāi)發(fā)前景。
[0003] 已經(jīng)有四個(gè)專(zhuān)利公開(kāi)了 c-di-GMP的應(yīng)用價(jià)值。W02005/030186發(fā)現(xiàn)c-di-GMP 可以減弱微生物病原菌的毒性，抑制或減少微生物病原菌的定居。US2005/0203051發(fā)現(xiàn) c-di-GMP可以抑制癌細(xì)胞增殖或增加癌細(xì)胞凋亡。US2006/0040887發(fā)現(xiàn)c-di-GMP可 以刺激或者增強(qiáng)病人的免疫反應(yīng)，可以作為疫苗的佐劑來(lái)增強(qiáng)病人對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。 EP1782826也描述了 c-di-GMP可以作為疫苗的佐劑及其在藥物組合物（如疫苗）中的用 途。
[0004] 針對(duì)c-di-GMP所進(jìn)行的研究是新型藥物開(kāi)發(fā)中的一個(gè)熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外大量的研究 機(jī)構(gòu)正在努力闡明c-di-GMP信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，開(kāi)發(fā)c-di-GMP新的應(yīng)用價(jià)值。要使得上述的 研究順利進(jìn)行，必須要有足夠量的c-di-GMP提供。因此大量合成c-di-GMP具有十分重要 的意義。
[0005] 目前已有報(bào)道的主要是化學(xué)合成方法。在整個(gè)合成反應(yīng)中，要使用大量的保護(hù)基 團(tuán)，增加了生產(chǎn)成本。同時(shí)正常存在以下問(wèn)題：產(chǎn)率較低，反應(yīng)劇烈，有環(huán)境污染。用酶法合 成，工藝簡(jiǎn)單，成本低.且無(wú)需有機(jī)試劑及環(huán)境污染問(wèn)題。為此構(gòu)建具有工業(yè)用途的雙鳥(niǎo)苷 酸環(huán)化酶基因工程菌，并用這種工程菌來(lái)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)c-di-GMP，具有意義重大。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及 其在制備雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和生物轉(zhuǎn)化c-di-GMP方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因，具有SEQ ID N0 :1所不的核苷酸序列。
[0009] 為獲取目標(biāo)基因片段，本發(fā)明所用菌種的生物材料來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心，具有如下特征：保藏分類(lèi)命名：野油菜黃單胞菌Xccl635RifYXanthomonas campestris Xccl635Rifr。保藏編號(hào)：CCTCC N0:M2012464。保藏日期：2012 年 11 月 20 號(hào)。 保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址：武漢.武漢大學(xué).430072。
[0010] 該雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因序列由如下方法獲得：利用PCR技術(shù)在引物1(GACTCTAGA ACTTCACGACGAGAAGCTGGCGGTAG)、引物 2(GACTCTAGAACCCATAATGGATAGGCAC)的作用下，以來(lái) 源于野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)菌株CCTCC N0:M2012464中的總基因組 DNA為模板，克隆得到約1. lkb的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的基因片段。將該片段連接到pDSK519載 體上，獲得克隆載體pDSK-dgcX。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并利用軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，分 析表明該序列含有一個(gè)長(zhǎng)為l〇26bp的開(kāi)放閱讀框。改基因核苷酸序列為（SEQ ID N0:1):
[0011] TTGCCACACA TCGAGGCCTG GAGCATCAGC AGCAATGCCC CGATGCGCTT GGAGGAAAGG 60 AGCAAGGACA TGATGGTTCA GCATGAGGAC GAACTACGCA CCCCACCAAA GGCGAGCACC 120 CTGCTGCGAG TGCTGAGCGC TCTTCCGTTC GGCATCGCGT GGGCCAGCTT TCCTGATGGA 180 AAAATTCAGT ACTGCAATGC GGAGTTCGTT CGTCTATTCG GCCACGACGC CAGCCACTTC 240 CGTACAGTCG ATCAATTCGT GGACAGCCTC TATCTTCATG AACGGCAGCG CGAGATGGTA 300 CGCAAGCGCT GGCTAGACAT CGAACTGCAT CACTCGGCAC ATCCTGTTGC GACCGGTGAT 360 ATGGAGATTG ATGTCGTGAC CAGCGGAGGG TCAATCCGCA CGGTGTTGCA CTCGGGCTTG 420 ATACTTCACG ACGAGAAGCT GGCGGTAGCG ATCTTCAAAG ATTTTTCTGG TGTGCAGTCC 480 AATCGGCGGC AGCTTTTGGA GCTGATCTAT CGAGACGATC TGACTGGTGT TTCCAATCGG 540 CGTGGCCTTC GCGAGCGTTG GCATGCGGAG GTCTCCGAAG ATCCGCAGCG TCGTCTTGCA 600 TTCCTCATGC TGGATCTTGA TGACTTCAAA CCCATCAACG ATTCCTATGG GCACGCGGTA 660 GGTGACACCG TGCTTCAGAT CATCGCAGAG CGACTGAAAG GGGCTGTGCG AGAGACAGAC 720 TTGGTATGCC GCCTCGGTGG CGATGAGTTC GGTATCTTGC TTGTTGCACC AAGTGACCTG 780 TCTCATATCG AAATGGTCTG CAGCCGCATA CTGGAGTCGG TGAATACGCC GCTTCTGGTG 840 GACAACCTAA AACTTAGCAT CGGCGTCAGC ATTGGCGCCT GCCTCTATCC AGATCAAGCT 900 GCAGATAAGC ACGAACTACT GCGGCGCGCT GACCGGGCCC TGTATCAAAT CAAAAGGACC 960 GGGGGAAAAG GCTCCTGGCG CTGGTTCCAA GGAGAGCATC CGGTCGAAGG TATGGCTATT 1020 TCTTGA 1026
[0012] 利用軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行分析，推知所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因編碼SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列：
[0013] MPHIEAWSIS SNAPMRLEER SKDMMVQHED ELRTPPKAST LLRVLSALPF GIAWASFPDG 60 KIQYCNAEFV RLFGHDASHF RTVDQFVDSL YLHERQREMV RKRWLDIELH HSAHPVATGD 120 MEIDVVTSGG SIRTVLHSGL ILHDEKLAVA IFKDFSGVQS NRRQLLELIY RDDLTGVSNR 180 RGLRERWHAE VSEDPQRRLA FLMLDLDDFK PINDSYGHAV GDTVLQIIAE RLKGAVRETD 240 LVCRLGGDEF GILLVAPSDL SHIEMVCSRI LESVNTPLLV DNLKLSIGVS IGACLYPDQA 300 ADKHELLRRA DRALYQIKRT GGKGSWRWFQ GEHPVEGMAI S 341
[0014] 本發(fā)明還涉及含有所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因的重組載體，以及利用所述載體轉(zhuǎn)化 得到的重組基因工程菌。
[0015] 本申請(qǐng)發(fā)明人根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物3 (CACGGATCCTTGCCACACATCGAGGCCTGG AGCATCA)和引物 4(CAGCTCGAGTCAAGAAATAGCCATACC)，以重組質(zhì)粒 pDSK-dgcX 為模板，通過(guò) PCR擴(kuò)增得到了用于表達(dá)的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因。本發(fā)明雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因同表達(dá)載體 pGEX-6p-l連接，構(gòu)建了含有雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基的表達(dá)重組載體pGEX-6p-dgcX。
[0016] 將表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-dgcX轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得含有表達(dá)重組質(zhì)粒 pGEX-6p-dgcX的重組大腸桿菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgcX，以重組菌或者融合蛋白 GST-dgcX為酶源，進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。
[0017] 本發(fā)明還涉及所述的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因在制備重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶中的應(yīng)用， 及雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶生物合成c-di-GMP方面的。
[0018] 具體的，所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因的重組載體，將重組載 體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組雙鳥(niǎo) 苷酸環(huán)化酶菌體細(xì)胞。
[0019] 所述的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可以5'-三磷酸鳥(niǎo)苷三鈉（GTP)為底物，進(jìn) 行轉(zhuǎn)化制備環(huán)二鳥(niǎo)苷單磷酸（c-di-GMP)。
[0020] 本發(fā)明的有效效果：
[0021] 本發(fā)明提供了一種來(lái)源于野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)菌株CCTCC NO :M2012464的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因核苷酸序列；并將該基因與表達(dá)載體轉(zhuǎn)接構(gòu)建重組載 體pGEX-6p-dgcX，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得含有表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-dgcX的重組 大腸桿菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgcX?？蓱?yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生 物催化與轉(zhuǎn)化，將5' -三磷酸鳥(niǎo)苷三鈉轉(zhuǎn)化成環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸。 (四）

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為克隆載體pDSK-dgcX的物理圖譜；
[0023] 圖2為重組質(zhì)粒pGEX-6p_dgcX的物理圖譜；
[0024] 圖3為雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖；1 :DNA marker ;2?5 :利用引物1 和引物2擴(kuò)增得到的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因片段。
[0025] 圖4為陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEX-6p-dgcX的酶切結(jié)構(gòu)圖：1 :DNA marker ;2 :雙鳥(niǎo)苷酸環(huán) 化酶基因片段；3 :pGEX_6p-dgcX/BamHI and Xhol 樣品；4 :pGEX_6p-dgcX/BamHI 樣品；5 : pGEX_6p-dgcX/XhoI 樣品。
[0026] 圖5為雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶SDS-PAGE圖；1 :蛋白分子量marker ;2 :E. coli BL21 ;3 : 未誘導(dǎo)的E.coli BL21/pGEX-6p-dgcX;4:0.1mM ITPG誘導(dǎo)的E.coli BL21/pGEX-6p-dgcX; 5 :lmM ITPG誘導(dǎo)的E. coli BL21/pGEX-6p-dgcX，誘導(dǎo)產(chǎn)生的GST-dgcX分子量大小大約為 65. 5kDa。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 此：
[0028] 實(shí)施例1 :
[0029] 用基因組DNA提取試劑盒，提取野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)菌株 CCTCC NO :M2012464的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引物1 (GACTCTAGAACTTCA CGACGAGAAGCTGGCGGTAG)、引物 2 (GACTCTAGAACCCATAATGGATAGGCAC)的作用下，進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增。
[0030] PCR反應(yīng)體系各組分加入量（總體積50 μ L) :10Xpfu DNA polymerase Buffer(Sigma)5y L，10mM dNTP mixturely L，濃度為 25μ L 的引物 1、引物 2 各 2μ L，基因 組 DNA1 μ L，pfu DNA polymerasel μ L，去離子水 28 μ L。
[0031] PCR 擴(kuò)增條件：1)95°C，變性 5min ;2)95°C，變性 lmin，60°C 退火 45s，72°C 延伸 1. lmin，30個(gè)循環(huán)；3) 72°C，延伸10分鐘，冷卻至4°C。
[0032] 取5 μ LPCR反應(yīng)液用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用PCR純化試劑盒純化該片 段，然后利用Xbal與EcoRI對(duì)該片段進(jìn)行處理，并在T4DNA連接酶的作用下，將改片段同用 相同的雙酶處理的PDSK-519進(jìn)行連接。利用藍(lán)白篩選系統(tǒng)進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取白色克隆測(cè) 序，利用軟件分析測(cè)序結(jié)果，結(jié)果表明：經(jīng)引物1和引物2擴(kuò)增到的核苷酸中含有一個(gè)完整 的開(kāi)放閱讀框，其基因長(zhǎng)度為l〇26bp(其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示）。
[0033] 實(shí)施例2 :
[0034] 根據(jù)實(shí)施方1分析結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物3 (CACGGATCCTTGCCACACATCGAGGCCTGGAGCAT CA)和引物4 (CAGCTCGAGTCAAGAAATAGCCATACC)，并分別在引物3和引物4中引入了 BamHI 和Xhol限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)。在引物3和引物4中引發(fā)下，利用pfu DNA polymerase進(jìn) 行擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)為l〇34bp的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶片段，測(cè)序后利用BamHI和Xhol限制性?xún)?nèi)切 酶對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4DNA連接酶將該片段同用相同的雙酶處理的pGEX-6p-l 進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6p-dgcX。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-6p-dgcX電轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌BL21中，涂平板37 °C下培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取克隆提取質(zhì)粒，并用引物3與引物4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的模板質(zhì)粒即為含有雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的質(zhì)粒。
[0035] 提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0036] 實(shí)施例3 :
[0037] 將實(shí)施例2驗(yàn)證后的含有表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-dgcX的重組大腸桿菌BL21菌株 BL21/pGEX-6p-dgcX，用含有100 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)到菌體濃度0D600約為 1. 0左右，再向LB培養(yǎng)液加入終濃度ImM的ITPG，誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后，4°C、8000rpm離心5min， 收集含有重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的菌體細(xì)胞。
[0038] 實(shí)施例4 :
[0039] 以實(shí)施例3中獲得的含有表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-dgcX的重組大腸桿菌BL21菌株 BL21/pGEX-6p-dgcX菌體超聲波破碎（300W，破碎10s，間隔30s，破碎20分鐘）。超聲波破 碎后離心4°C、8000rpm離心10min。取上清液作為轉(zhuǎn)化用酶，以5' -三磷酸鳥(niǎo)苷三鈉為底 物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸。轉(zhuǎn)化體系及操作如下：在l〇ml反應(yīng)試管中加入超聲 破碎上清液和底物為ImM的反應(yīng)液體，30°C，200rpm轉(zhuǎn)化30分鐘，離心去除不溶物，上清液 中即含有環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸。
[0040] 在光密度253nm處測(cè)定雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶生成環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸所用的酶量，酶活定 義：30°C、每分鐘A253處吸光度值增加0. 001為1個(gè)活力單位（U)。
[0041] 表1 :以重組大腸桿菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgCX以酶源測(cè)定的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化 酶活力測(cè)定結(jié)果
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因，其特征在于所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因編 碼SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列。
3. 在保持由上述權(quán)利要求2編碼的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶催化活性的前提下，由插入，缺失 或替換上述權(quán)利要求2堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因，其特征在于所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因來(lái) 源于野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)CCTCC NO :M 2012464。
5. 野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072,保藏日期：2012年11月20日，保藏編號(hào)：CCTCC NO :M 2012464。
6. -種含有權(quán)利要求1所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因的重組載體。
7. 如權(quán)利1所述的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因在制備重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和生物合成 c-di-GMP方面的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化 酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo) 培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的菌體細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可 以5' -三磷酸鳥(niǎo)苷三鈉（GTP)為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備環(huán)二鳥(niǎo)苷單磷酸（c-di-GMP)。
【文檔編號(hào)】C12N15/60GK104152472SQ201210579844
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】陶飛, 劉小杰, 陳禮明 申請(qǐng)人:陶飛