專利名稱：一種大豆核因子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆核因子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、鹽堿等非生物脅迫嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過基因工程手段改良作物的抗逆性是一種有效的途徑。而闡明抗非生物脅迫的分子機(jī)理則是應(yīng)用基因工程改良的前提。轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫的信號傳導(dǎo)中起到非常重要的作用。大豆作為重要的糧食作物，在全世界范圍內(nèi)被大面積種植。然而與其他植物如擬南芥、水稻、玉米以及小麥相比，大豆中NFYB類轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)信息研究甚少。因此，利用生物工程技術(shù)改變植物抗逆性反應(yīng)，進(jìn)而培育性狀優(yōu)良的新品種成為一種有效的育種方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種大豆核因子蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白，命名為GmNFYBl,來源于大豆(Glycine max (L. )Merri 11.)東農(nóng)50，是如下I)或2)的蛋白質(zhì)I)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列2由174個氨基酸殘基組成，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦翴) -5)中任一一種DNA分子I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第22-665位核苷酸所不的DNA分子；3)序列表中序列I自5’末端的第93-617位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA分子雜交且與植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且與植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子。上述序列I由710個核苷酸組成，編碼區(qū)為序列I自5’末端第93-617位核苷酸。所述嚴(yán)格條件也可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用
2X SSC, 0. 1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體為將上述編碼基因插入表達(dá)載體得到的重組載體，具體為將上述序列表中序列I自5’末端第22-665位核苷酸所示的DNA分子插入pCAMBIA_pBI121載體的Xba I和Sac I識別位點(diǎn)間得到的載體。所述pCAMBIA-pBI121載體按照如下方法制備將載體pCAMBIA3301和pBI121分別使用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切，回收酶切后為11257bp的pCAMBIA3301載體大片段和酶切后3032bp的pBI121載體小片段，將二者連接構(gòu)建中間表達(dá)載體pCAMBIA-pBI121。所述重組載體中含有啟動子和連接在所述啟動子下游的GmNFYBl蛋白的編碼基因。上述啟動子可以為下述任一啟動子花椰菜花葉病毒35S啟動子和Ubiquitin啟動子，優(yōu)選為花椰菜花葉病毒35S啟動子。上述重組菌為將上述的重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。擴(kuò)增上述編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述引物對具體如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所
/Jn o上述蛋白、上述編碼基因、上述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在調(diào)控植物耐逆性和/或植物育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性，所述耐逆性具體為耐旱性；上述提高植物耐旱性是在干旱脅迫下進(jìn)行，具體通過提高根長、增加萌發(fā)率和/或提高脯氨酸含量體現(xiàn)；所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥或大豆；上述蛋白、上述編碼基因、上述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，其中，調(diào)控植物產(chǎn)量為提高植物產(chǎn)量，所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為大豆；上述提高植物產(chǎn) 量是在干旱地區(qū)進(jìn)行，具體為在新疆，其他氣候條件少雨干旱的地區(qū)也可以。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟為將上述的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。上述方法中，所述耐逆性為耐旱性；所述目的植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥或大豆。本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟為將上述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量高于所述目的植物；所述產(chǎn)量通過提高株高、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝、有效莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株粒重和/或百粒重體現(xiàn)；所述目的植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為大豆。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新基因GmNFYBl，將其轉(zhuǎn)入擬南芥或大豆中，得到轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥或轉(zhuǎn)GNFYBl大豆；轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥抗旱處理后的根長增加、脯氨酸的含量增大、種子萌發(fā)率明顯增高 ’轉(zhuǎn)GmNFYBl大豆干旱處理后生長由于野生型大豆，且在干旱地區(qū)產(chǎn)量高于野生型大豆；可以看出該基因與植物抗旱性相關(guān)，能應(yīng)用于培育和改良抗旱植物的新品種。


圖I為轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物對照的⑶S染色結(jié)果圖2為干旱脅迫下表達(dá)GmNFYBl的轉(zhuǎn)基因植物4周齡苗與野生型植物對照4周齡苗的比較圖3為甘露醇對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的平均根長的變化圖4為轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物對照在不同甘露醇濃度處理下根長變化的圖片圖5為轉(zhuǎn)基因植物不同株系和野生型植物對照在300mM Minnitol甘露醇濃度處理下的根長變化圖6為轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物對照在不同ABA濃度處理下種子的萌發(fā)率變化 圖7為轉(zhuǎn)基因植株(TG)和野生型植株(CK)轉(zhuǎn)移至土中進(jìn)行抗旱脅迫后的脯氨酸含量比較圖8為轉(zhuǎn)基因(GmNFYBl)擬南芥植株對氯化鈉(NaCl)脅迫處理的根長變化圖9為轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株在不同氯化鈉(NaCl)濃度脅迫處理下的成活率變化圖10為GmNFYBl和AtNFYBl基因的同源性相比較圖11為PEG處理的大豆GmNFYBl基因的相對表達(dá)量圖12為大豆的遺傳轉(zhuǎn)化圖13為gus基因的瞬時表達(dá)圖14為轉(zhuǎn)基因植株的Bar基因的PCR檢測圖15為轉(zhuǎn)基因植株的⑶S基因的PCR檢測圖16為轉(zhuǎn)化株的GmNFYBl基因的PCR檢測圖17為大豆葉片基因組DNA圖18為基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化圖19為轉(zhuǎn)化株的GmNFYBl基因的Southern檢測圖20為轉(zhuǎn)GmNFYBl大豆干旱脅迫下表型結(jié)果圖21為轉(zhuǎn)GmNFYBl大豆在干旱地區(qū)生長表型結(jié)果圖22為轉(zhuǎn)GmNFYBl大豆在干旱地區(qū)生長表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例UGmNFYBl的獲得Trizol試劑提取大豆(Glycine max)(東農(nóng)50,武天龍，楊慶凱，馬占峰，吳宗璞，趙淑文，高鳳蘭，李文濱，張國棟，楊琪，孟慶喜，王金陵.東農(nóng)小粒豆I號大豆新品種選育報告，[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，(25) 1:104 ;公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，一下簡稱為野生型大豆)。葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈作為模板，以正義引物GGTCTAGACAAAGGTGCATTGGTGGT (下劃線部分為Xba I酶切位點(diǎn)，序列3)，反義引物ATGAGCTCCGTACAAGCATTCAAGGGA (下劃線部分為Sac I酶切位點(diǎn)，序列4)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR 條件為 94°C 5min ；35 個循環(huán)94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2. 5min ；72°C 5min。將 PCR 產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物為522bp。經(jīng)測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中的序列I自5’末端第22-665位核苷酸序列。該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因的編碼區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第93-617位核苷酸，該基因命名為GmNFYBl，該基因編碼的蛋白命名為GmNFYBl，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的獲得及功能研究一、植物表達(dá)載體pCAMBIA— GmNFYBI的構(gòu)建將載體pCAMBIA3301載體(由澳大利亞CAMBIA公司出售)和pBI121 (購自CL0NETECH公司)分別使用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切，回收酶切后為11257bp的pCAMBIA-D3載體大片段和酶切后3032bp的pBI121載體小片段，將二者連接構(gòu)建表達(dá)載體 pCAMBIA-pBI121。
將實(shí)施例I獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Xba I和Sac I酶切，得到的片段與經(jīng)過同樣酶切的pCAMBIA-pBI121載體片段相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列自5’末端第22-665位核苷酸插ApCAMBIA—pBI121的Xba I和Sac I識別位點(diǎn)間得到的重組載體，將該重組載體命名為pCAMBIA-GmNFYBl，該載體的啟動子為CaMV35S。二、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的培育I、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的獲得將上述獲得的植物表達(dá)載體pCAMB I A-GmNFYB I采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrogen公司，產(chǎn)品編號18313015)中，得到的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pCAMB IA— GmNFYB I，將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為LBA4404/pCAMBIA-GmNFYBI。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組菌LBA4404/pCAMBIA-GmNFYBI侵染野生型擬南芥(Columbia生態(tài)型)(以下簡稱野生型擬南芥，郝林，徐昕，曹軍.一種擬南芥突變體對高濃度CO2反應(yīng)的研究，[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2003，14(12) :2359 236.公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)，得到65株TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥。I)、制備轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌液共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌接菌LBA4404/pCAMBIA-GmNFYBI于有YEP培養(yǎng)液的試管中IOul IOml接種。28°C，220rpm搖過夜，約30小時，待已搖活的菌按(I :400)及750ul菌液轉(zhuǎn)至300毫升YEP(RifR，StrR，KanR)培養(yǎng)基中。Rif (利福平)在培養(yǎng)基中的濃度為25mg/L，Str(鏈霉素)在培養(yǎng)基中的濃度為50mg/L，Kan (卡那霉素)在培養(yǎng)基中的濃度為50mg/L。培養(yǎng)28°C，220rpm約14小時，測OD值，用YEP+Rif+StrR作為空白對照，當(dāng)菌液達(dá)到0D600為
I.5-3.0之內(nèi)時，可收集菌體于50ml離心管(滅菌)，4°C，4000g離心IOmin0用5%蔗糖(含0. 02%Silwet)稀釋至0D600約為0. 8-1. 0左右即。選取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌體，再將混勻的菌體溶入50ml溶液中，混勻后再加入Silwet (100%) 120ul終濃度為 0. 02%。2)、澆水轉(zhuǎn)化前一天將需要做轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥Columbia生態(tài)型的苗澆水澆透。3)、轉(zhuǎn)化將野生型擬南芥植株的花序在制備好的菌體重懸溶液中浸泡30s，于弱光下生長(暗培養(yǎng))，得到TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的苗。
4)、標(biāo)記好，將65株TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的苗平放于盒子內(nèi)，上蓋封口膜封好，避光培養(yǎng)24hrs，I天后，將植株立起正常培養(yǎng)，澆水。共獲得65株TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株。2、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的鑒定I)分子鑒定提取65株TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株的葉片的基因組DNA作為模板，用正義引物GGTCTAGACAAAGGTGCATTGGTGGT,反義引物ATGAGCTCCGTACAAGCATTCAAGGGA 進(jìn)行 PCR 鑒定，結(jié)果顯示得到522bp的片段為陽性，共得到24株陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株，轉(zhuǎn)化率為36. 92%。采用同樣的方法將空載體pCAMBIA—pBI121轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥。經(jīng)過上述方法鑒定，轉(zhuǎn)空載體擬南芥未有擴(kuò)增片段。 2)⑶S染色鑒定選取編號為53、57和2三個株系(L53，L57, L2)的陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株進(jìn)行GUS染色分析，轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的種子滅菌后播種于MS培養(yǎng)基上生長，4°C處理3天，然后轉(zhuǎn)入生長室。生長16天的苗用于誘導(dǎo)表達(dá)的處理。通過無菌操作，將要檢測的植株小心取出，轉(zhuǎn)移至⑶S染液中，使材料和染液的體積比小于1:5，放入37°C溫育過夜。待GUS滲入材料后，將材料轉(zhuǎn)入透明液中透明，以脫掉葉綠素，放置于室溫下5小時，直到綠色完全去除。最后，將經(jīng)透明處理后的植物材料在解剖鏡下觀察，有⑶S表達(dá)的部位呈現(xiàn)出穩(wěn)定且不溶于透明液的藍(lán)色，照相保存圖像，并且由Adobe Photoshop作適當(dāng)處理。以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對照。結(jié)果如圖I所示，其中A :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥種子剛發(fā)芽的GUS染色結(jié)果；B :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥幼苗和種子；C :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥幼苗；D :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株蓮座葉；E :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株葉片；F :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥蓮座葉和根；G :陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株的花序。編號為53,57和2三個株系(L53，L57, L2)的陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株的葉片均有藍(lán)色出現(xiàn)，野生型擬南芥則無藍(lán)色。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無顯著差別。3) PT篩選濃度(I)將野生型的擬南芥種子，分別播種于含Omg/L、lmg/L、3mg/L、5mg/L、7mg/L、10mg/LPPT的MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室(溫度為22 °C ± 2 °C，光照強(qiáng)度為0. 3 0. 4mmo lm-2 s_l)生長光/暗周期為16h/8h條件下讓其萌發(fā),根據(jù)萌發(fā)結(jié)果,確定過表達(dá)陽性苗的有效篩選濃度，結(jié)果為5mg/mL的PPT為有效篩選濃度。(2)篩選轉(zhuǎn)化子將編號為53、57和2的TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥種子于4°C低溫處理3d后，加入10%的次氯酸鈉，搖勻，8-10分鐘，用無菌水清洗2次。然后加入75%的乙醇，搖勻，30s。用無菌水清洗5次，然后均勻播種于含有5mg/mLPPT的培養(yǎng)基中。移入生長室6天后觀察并統(tǒng)計(jì)生長的健康綠色幼苗的數(shù)目。將正常綠色幼苗從培養(yǎng)基中取出，置于土 蛭石(3:1)中培養(yǎng)。經(jīng)50天左右的生活周期，篩選得到Tl代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株。以上實(shí)驗(yàn)表明外源基因GmNFYBl已經(jīng)整合到編號為53、57和2三個株系(L53, L57, L2)的轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株的基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平上得到有效的表達(dá)。
將編號為53、57和2的三個株系(L53，L57, L2)陽性TO代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株所結(jié)的種子及該種子所長成的植株稱為Tl代，將Tl代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株所結(jié)的種子及該種子所長成的植株稱為T2代。三、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的T2代功能分析A :干旱處理I、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型觀察將上述獲得的編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的種子滅菌后播種于MS培養(yǎng)基上，16h光/8h暗(長日照)，25°C生長10天，然后轉(zhuǎn)移到土里，獲得30株T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥苗?？购堤幚聿粷菜?5天。以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對照，各株系均為30株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
取經(jīng)過干旱處理后的編號為53，57，2的三個株系(L53，L57，L2)的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥4周齡苗(GmNFYBl)與野生型擬南芥4周齡苗(野生型)拍照，結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出，與野生型擬南芥相比，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥根變長。野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無顯著差異。2、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株對甘露醇(Minnitol)脅迫處理的根長變化將上述獲得的編號為53的L53株系的的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的種子滅菌后播種于MS培養(yǎng)基上，16h光/8h暗，25°C條件下生長，待I周后獲得50株編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥。然后將編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥苗分別轉(zhuǎn)移到含有OmM甘露醇(Mannitol )，IOOmM甘露醇，200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中生長，待I周后測量根長，以野生型擬南芥苗和轉(zhuǎn)空載體擬南芥苗為對照，各株系均為50株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。采用ImageJ軟件(http://rsbweb.nih. gov/i j/)統(tǒng)計(jì)根長平均變化。結(jié)果如圖3所示，含有OmM甘露醇的MS培養(yǎng)基中編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥(TG)的根長為3. 01cm，野生型擬南芥(CK)的根長為3. 05cm ；含有IOOmM甘露醇的MS培養(yǎng)基中編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥(TG)的根長為2. 51cm，野生型擬南芥(CK)的根長為I. 86cm ；含有200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥(TG)的根長為2. 59cm，野生型擬南芥(CK)的根長為I. 58cm ；野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無顯著差異。對編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的處理后的根長照相，拍照觀察，結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)基中甘露醇的濃度升高，(OmM Mannitol, IOOmM Mannitol, 200mM Mannitol)野生型植株的根長明顯變短，而編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株根長隨著濃度變化0mMMannitol時，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根長比野生型植株根長相接近，較野生型植株長。在IOOmM Mannitol、200mMMannitol濃度時,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根長較野生型植株根長長。采用上述的方法對編號為53、57和2的三個株系(L53，L57, L2)的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥苗(L57、L53、L2)分別轉(zhuǎn)移到含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中生長，待7d后，拍照觀察，結(jié)果如圖5所示，野生型擬南芥植株(WT)開始葉片出現(xiàn)黃白色，根長變得更短，而編號為57、53、2的三個株系(L53，L57, L2)的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥苗還是表現(xiàn)綠色葉片。3、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥種子對ABA (脫落酸)脅迫處理將上述獲得的編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥(TG)的種子滅菌后分別播種在含有不同濃度ABA (脫落酸)的MS培養(yǎng)基上(ABA濃度分別為0 u MABA, 0. 5 u MABA, l.Ou MABA, I. 5u MABA, 2. 0 u MABA)，16h 光 /8h 暗，25°C 條件下生長 6 天，統(tǒng)計(jì)萌芽率。以野生型擬南芥(CK)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對照，每個株系50株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖6所示 在ABA濃度為0 ii M時，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的萌芽率分別為100%和100% ；在ABA濃度為0. 5 ii M時，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的萌芽率分別為95. 37%和93. 26% ；在ABA濃度為I. 0 ii M時，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的萌芽率分別為93. 75%和91. 35% ；在ABA濃度為I. 5 ii M時，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的萌芽率分別為89. 33%和75. 61% ；在ABA濃度為2. 0 ii M時，編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥的萌芽率分別為88. 89%和68. 25% ；野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無顯著差異。從圖中可以看出，T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥和野生型擬南芥同樣在含有ABA的培養(yǎng)基中生長被大部分的抑制。但是轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子抑制程度更小一些。初步認(rèn)定轉(zhuǎn)GmNFYBl基因擬南芥植株的種子發(fā)芽和ABA有關(guān)。4、轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥植株對甘露醇(Minnitol)脅迫處理的脯氨酸含量變化脯氨酸是最重要的和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，干旱脅迫時可造成植物體內(nèi)脯氨酸的大量積累。這些積累的脯氨酸可以防止原生質(zhì)的水分散失，同時可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合作用。其含量的高低可以作為植物抗旱的指標(biāo)。將上述獲得編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥的種子滅菌后播種于MS培養(yǎng)基上，16h光/8h暗，25°C條件下生長，待I周后獲得50株編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥，然后將編號為53的L53株系的T2代轉(zhuǎn)GmNFYBl擬南芥轉(zhuǎn)移到分別含有0mM、100mM、200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中生長7天。檢測擬南芥植株中游離脯氨酸含量，方法如下1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(I)取7支具塞刻度試管按下表I加入各試劑。混勻后在沸水中加熱40min。表I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下I)或2)的蛋白質(zhì) O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)、4)或5)的基因 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列I自5’末端的第22-665位核苷酸所不的DNA分子； 3)序列表中序列I自5’末端的第93-617位核苷酸所不的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA分子雜交且與植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子； 5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且與植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或任一片段的引物對。
6.權(quán)利要求I所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求4所述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在調(diào)控植物耐逆性和/或植物育種中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求4所述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于 所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性，所述耐逆性具體為耐旱性； 所述調(diào)控植物產(chǎn)量為提高植物產(chǎn)量， 所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥或大豆。
9.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物耐逆性高于所述目的植物；所述耐逆性具體為耐旱性； 所述目的植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥或大豆。
10.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量高于所述目的植物； 所述產(chǎn)量通過提高株高、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝、有效莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株粒重和/或百粒重體現(xiàn)； 所述目的植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆核因子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，命名為GmNFYB1，來源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)東農(nóng)50,是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入大豆GmNFYB1(大豆核因子結(jié)合蛋白)的轉(zhuǎn)基因植物在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株根更長、脯氨酸含量更大、且產(chǎn)量更高。
文檔編號C12N1/21GK102964437SQ20121046207
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者李文濱, 王志坤, 李永光, 李勝暢 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)