林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉，其由以下質(zhì)量百分比的組分組成：20％～25％的冷榨黃豆粉、15％～30％的花生餅粉、10～25％的棉籽蛋白粉和20％～55％的魚(yú)粉。本發(fā)明的復(fù)合蛋白粉經(jīng)200L發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵單位可達(dá)至9561μg/ml，大幅領(lǐng)先目前國(guó)內(nèi)的平均水平，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉。
【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)林可霉素(Iincomycin)以來(lái)，林可霉素的發(fā)酵產(chǎn)率有了大幅度的提高。但是，一般企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中普遍存在發(fā)酵中后期菌絲斷裂嚴(yán)重并提前發(fā)生自溶的問(wèn)題，大大影響了林可霉素的生物合成速率以及有效生物合成時(shí)間。研究表明，高濃度游離氨基氮和溶解磷能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，可以縮短菌體繁殖所需要的時(shí)間，而同時(shí)又抑制許多抗生素的生物合成，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。中國(guó)專利申請(qǐng)CN101092597A公開(kāi)了一種生產(chǎn)林可霉素用復(fù)合培養(yǎng)基，其發(fā)酵液林可霉素生物效價(jià)在7200單位/毫升左右。林可霉素及其衍生物依然是臨床上使用量較大的抗生素，因此，亟需解決目前林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)中存在的問(wèn)題提高發(fā)酵單位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對(duì)林可霉素發(fā)酵過(guò)程中菌絲提前自溶而影響產(chǎn)物生物合成的問(wèn)題，根據(jù)林可霉素的代謝特性，采用多種動(dòng)植物蛋白復(fù)配并篩選得到一種復(fù)合蛋白粉，經(jīng)200L發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵單位可達(dá)至9561 μ g/ml，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]因此，本發(fā)明目的在于提供一種林可霉素發(fā)酵用有機(jī)蛋白粉，以利于提高林可霉素的發(fā)酵水平。
[0005]本發(fā)明提供的復(fù)合蛋白粉由多種動(dòng)植物蛋白復(fù)配并篩選得到，該復(fù)合氮源含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、植物多糖、維生素及核酸。
`[0006]本發(fā)明的林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉的特征在于，其由以下質(zhì)量百分比的組分組成:20 %~25 %的冷榨黃豆粉、15 %~30 %的花生餅粉、10~25 %的棉籽蛋白粉和20 %~55%的魚(yú)粉。
[0007]根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉由以下質(zhì)量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、20%~25%的花生餅粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的魚(yú)粉。
[0008]本發(fā)明中所述復(fù)合蛋白粉總氮含量為52.5% -55.5%、氨基氮含量為12.5% -14.5%、總磷含量為 1.6% -1.9%.[0009]本發(fā)明的復(fù)合蛋白粉能夠顯著減緩菌絲自溶和提高林可霉素的生物合成速率，從而提高發(fā)酵效價(jià)。經(jīng)200L發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵單位可達(dá)至9561 μ g/ml，大幅領(lǐng)先目前國(guó)內(nèi)的平均水平，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為如實(shí)施例1所述不同種類氮源對(duì)林可霉素發(fā)酵效價(jià)的影響；[0011]圖2為如實(shí)施例4所述發(fā)酵罐中不同氮源對(duì)林可霉素發(fā)酵效價(jià)的影響；
[0012]圖3為如實(shí)施例4所述不同含量的復(fù)合蛋白粉發(fā)酵168h時(shí)的菌絲形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0014]本發(fā)明中所用的原料來(lái)源如下:冷榨黃豆粉、花生餅粉、棉籽蛋白粉、魚(yú)粉、玉米漿、泡敵、硅油等購(gòu)自河南天方藥業(yè)股份有限公司；可溶性淀粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖購(gòu)自上海西王淀粉糖有限公司；其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0015]菌種:林可鏈霉菌Streptomyces lincolnensis SIP1-A.2118,由河南省天方藥業(yè)有限公司提供。
[0016]斜面培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20，冷榨黃豆粉5，K2HPO40.5，NaCl0.5，KNO3I,MgSO4.7Η200.5，F(xiàn)eSO4.7Η200.01，瓊脂 22，ρΗ7.0 ~7.5 ;121°C 滅菌 30min。
[0017]種子培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20，葡萄糖15，冷榨黃豆粉20，玉米漿25，(NH4)2S042, CaC034, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。滅菌 30min。
[0018]原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基( g/L):淀粉15，葡萄糖65，冷榨黃豆粉25，玉米漿15，(NH4)2S048, NaN038, NaCl5，KH2PO40.2，CaC038, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。滅菌 30min。
[0019]原始發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L):淀粉10，葡萄糖50，冷榨黃豆粉15，玉米漿15，(NH4) 2S044, NaN034, NH4N034, NaCl5, KH2PO40.5，CaC038，泡敵 0.35，硅油 0.25，ρΗ6.5 ~7.5 ;121°C 滅菌 30min。
[0020]稀料培養(yǎng)基(g/L):玉米漿150，冷榨黃豆粉90，CaC036，泡敵1，硅油I。
[0021]培養(yǎng)條件:斜面、種子、搖瓶及發(fā)酵罐發(fā)酵均采用30°C培養(yǎng)，培養(yǎng)周期分別為7~10d、2d、7d和8d，搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基裝量為100ml/750ml，轉(zhuǎn)速220r/min。發(fā)酵罐中稀料采用分批補(bǔ)料的方式，每隔12小時(shí)補(bǔ)一次，補(bǔ)料量為發(fā)酵液總體積的2%。
[0022]HPLC檢測(cè)條件:色譜柱ODS C18，4.6mmX 250mm, 5 μ m ;檢測(cè)波長(zhǎng):214nm ;進(jìn)樣量:10 μ L ;流速:0.8ml/min ;柱溫:35°C ；
[0023]流動(dòng)相:0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調(diào)pH至6.1):甲醇=50: 50
[0024]實(shí)施例1-3:復(fù)合蛋白粉用于林可霉素發(fā)酵與原配方對(duì)比
[0025]實(shí)施例1
[0026]復(fù)合蛋白粉的質(zhì)量百分比組成為:冷榨黃豆粉25%，花生餅粉30%，棉籽蛋白粉15%,魚(yú)粉30%。所述復(fù)合蛋白粉的總氮含量52.5%、氨基氮含量14.5%、總磷含量1.9%。
[0027]以原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(搖瓶發(fā)酵單位3500yg/ml左右)為對(duì)照，以不同氮源(棉籽蛋白粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨、魚(yú)粉、玉米蛋白粉、酵母膏、牛肉膏和實(shí)施例1所述的復(fù)合蛋白粉)替代對(duì)照組中10g/L的冷榨黃豆粉，考察氮源對(duì)林可霉素生物合成的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1，其中棉籽蛋白粉、蛋白胨和本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合蛋白粉均能提高林可霉素的生物合成，尤其是使用本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合蛋白粉作氮源，林可霉素的發(fā)酵效價(jià)可提高至 4500 μ g/ml。
[0028]實(shí)施例2[0029]復(fù)合蛋白粉的質(zhì)量百分比組成為:冷榨黃豆粉20%，花生餅粉25%，棉籽蛋白粉10%,魚(yú)粉45%。所述復(fù)合蛋白粉的總氮含量55.5%、氨基氮含量12.5%、總磷含量1.6%。
[0030]以原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，用實(shí)施例2的復(fù)合蛋白粉替代原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中20g/L的冷榨黃豆粉，考察對(duì)林可霉素生物合成的影響。最終林可霉素的發(fā)酵效價(jià)可提高至 4650 μ g/ml ο
[0031]實(shí)施例3
[0032]復(fù)合蛋白粉的質(zhì)量百分比組成為:冷榨黃豆粉20%，花生餅粉30%，棉籽蛋白粉25 %，魚(yú)粉25 %。所述復(fù)合蛋白粉的總氮含量53 %、氨基氮含量13 %、總磷含量1.7%。
[0033]以原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，用實(shí)施例3的復(fù)合蛋白粉完全替代原始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的冷榨黃豆粉，考察對(duì)林可霉素生物合成的影響。結(jié)果林可霉素的發(fā)酵效價(jià)可提高至 4695 μ g/ml ο
[0034]以上實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合蛋白粉可以完全替代原始搖瓶培養(yǎng)基中的冷榨黃豆粉，并能提高林可霉素的發(fā)酵單位。
[0035]實(shí)施例4:復(fù)合蛋白粉用于林可霉素發(fā)酵罐工藝
[0036]復(fù)合蛋白粉的質(zhì)量百分比組成為:冷榨黃豆粉25%，花生餅粉20%，棉籽蛋白粉15%，魚(yú)粉40%。所述復(fù)合蛋白粉的總氮含量54%、氨基氮含量13.5%、總磷含量1.8%。
[0037]以原始發(fā)酵罐培養(yǎng)基為對(duì)照，分別用5g/L、10g/L、15g/L的實(shí)施例4的復(fù)合蛋白粉替代原始發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的冷榨黃豆粉。同時(shí)，稀料培養(yǎng)基中90g/L的冷榨黃豆粉也按相同的比例用30g/L、60g/L、90g/L的實(shí)施例4的復(fù)合蛋白粉替代。考察在200L發(fā)酵罐中，復(fù)合蛋白粉對(duì)林可霉素發(fā)酵是否有促進(jìn)作用，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，復(fù)合蛋白粉替代冷榨黃豆粉后發(fā)酵單位較原始發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方的5900μ g/ml分別提高16%、39%、63%，其中復(fù)合蛋白粉完全替代原始發(fā)酵罐培養(yǎng)基`配方中15g/L的冷黃豆粉時(shí)，林可霉素的發(fā)酵單位達(dá)到了 9561 μ g/ml。而且利用復(fù)合蛋白粉替代冷黃豆粉后，能夠顯著減緩菌絲自溶和提高林可霉素的生物合成速率，從而提高發(fā)酵效價(jià)(圖3)。從圖3可以看出，用復(fù)合蛋白粉替代冷榨黃豆粉進(jìn)行林可霉素發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵后期能夠保持良好的菌絲狀態(tài)要，明顯減少菌絲的斷裂現(xiàn)象(對(duì)照組)，從而維持產(chǎn)抗活力提高發(fā)酵單位。
【權(quán)利要求】
1.林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉，其特征在于，其由以下質(zhì)量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、15%~30%的花生餅粉、10~25%的棉籽蛋白粉和20%~55%的魚(yú)粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉，其特征在于，其由以下質(zhì)量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、20%~25%的花生餅粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的魚(yú)粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的林可霉素發(fā)酵用復(fù)合蛋白粉，其特征在于，所述復(fù)合蛋白粉的總氮含量為52.5% -55.5%、氨基氮含量為12.5% -14.5%、總磷含量為.1.6% -1.9%。
【文檔編號(hào)】C12P19/64GK103805658SQ201210454439
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月13日
【發(fā)明者】李繼安, 陳代杰, 林惠敏, 藍(lán)鴻, 毛全貴, 張宏周 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 河南天方藥業(yè)股份有限公司